Cat. No. 15596-018)总 RNA 提取试剂，按说明 书提供方法提取QBC939细胞的总RNA。具体方法为：取细胞，用浓度为0.0 lM的PBS冲洗 3次，加入适量TRIzoI试剂，室温放置5min裂解细胞，吹打均匀后以Iml/管分装至I. 5ml Eppendorf管中。每管加入0· 2ml氯仿，剧烈震荡15s，室温放置2_3min，4°C、12000rpm离 心15min，将上层水相移至干净Eppendorf管中，加入0. 5ml异丙醇，轻轻混勾，室温放置 lOmin，4°C、7500r/min 离心 lOmin。弃上清，75% 乙醇洗涤 RNA 沉淀，7500rpm 离心 5min，室 温干燥RNA沉淀，5-10min后溶于适量DEPC水。质量分数为I. 0 %的琼脂糖凝胶电泳检测 RNA样本的完整性，应用Bio-Photometer对提取的RNA进行定量测定。
[0127] 3. 2逆转录步骤同实施例2。
[0128] 3. 3QPCR扩增步骤同实施例2。
[0129] 4、统计学方法
[0130] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值土标准差的方式来表 示，采用SPSS13. 0统计软件来进行统计分析的，干扰LY6H基因表达组与对照组之间的差异 采用t检验，认为当P〈0. 05时具有统计学意义。
[0131] 5、结果
[0132] 结果如图2显示，相比siRNA2-LY6H、siRNA3-LY6H，siRNAl-LY6H能够更有效抑制 LY6H基因的表达，差异具有统计学意义（P〈0.05)。
[0133] 实施例4LY6H基因对胆管癌细胞增殖的影响
[0134] 采用MTT实验检测LY6H基因对胆管癌细胞增殖能力影响。
[0135] 1、细胞培养与转染步骤同实施例3。
[0136] 2、步骤：各组细胞转染12h后胰酶消化，制成单细胞悬液，以每孔6000个细胞接种 于96孔培养板中，每组分7个时间点，每个时间点设6个复孔。细胞贴壁后，进行第1次检 测：每孔加入5g/L的MTT液20 μ 1，继续培养4h后，吸去培养基，加入DMSO 150 μ 1，细心吹 打，使紫蓝色沉淀充分溶解，用酶标仪在490nm波长测吸光度值（Α值）。然后每12h检测1 次，连续测72h，共7次。本实验重复3次。
[0137] 3、统计学方法
[0138] 实验都是按照重复3次来完成的，采用SPSS13. 0统计软件来进行统计分析，两者 之间的差异采用t检验，认为当P〈0. 05时具有统计学意义。
[0139] 4、结果
[0140] 图3所示的结果显示：siRNAl-LY6H组的细胞生长速度明显低于转染siRNA-NC组 的细胞生长速度，差异具有统计学意义（P〈〇. 05)。上述结果表明LY6H表达有利于胆管癌细 胞的生长，通过抑制LY6H基因的表达可以抑制胆管癌细胞的生长。
[0141] 实施例5划痕实验检测转染SiRNA后胃癌细胞增殖、迀移能力
[0142] 1、将QBC939细胞平铺于六孔板中，每孔密度为5X105个，加入含10%胎牛血清的 DMEM培养，37°C，5% C02条件下培养24h。
[0143] 2、转染按照脂质体转染试剂2000(购自于Invitrogen公司）的说明书转染，实验 分为阴性对照组（siRNA-NC)和实验组（20nM) (siRNAl-LY6H)以及空白对照组。
[0144] 3、用10 μ 1移液枪头在单层细胞上画"一"字痕，用PBS溶液缓慢冲洗3次。分别 选取培养24、48、72h的细胞置于倒置显微镜下观察拍照。计算划痕愈合率=(Oh划痕宽 度-24h (或48h或72h)划痕宽度）/Oh划痕宽度X 100 %。
[0145] 4、结果
[0146] 结果如表2所示，随着培养时间的增长，siRNAl-LY6H组的划痕愈合率明显低于 siRNA-NC组和空白对照组，差异有统计学意义（P〈0. 05)。此结果表明，抑制LY6H的表达可 以抑制胆管癌细胞的迀移增殖，LY6H促进胆管癌细胞的迀移和增殖。
[0147] 表2LY6H siRNA对QBC939迀移增殖的影响
[0149] 实施例6LY6H基因对胆管癌细胞凋亡的影响
[0150] 使用流式细胞仪检测LY6H基因对细胞凋亡的影响。
[0151] 1、细胞培养步骤同实施例3。
[0152] 2、细胞转染步骤同实施例3。
[0153] 3、步骤
[0154] 细胞转染72h后，使用预冷PBS洗涤细胞，然后用0. 25%胰酶消化细胞，中止消化， 将离心收集的细胞使用PBS重悬，将细胞定量为I X IO6个/ml，取200 μ 1上述细胞悬液放 置到Eppendorf管中，加入10 μ I Annexin-V-FITC混匀，室温暗处孵育染色15min，上机前 5min加入10mg/L碘化丙锭（PI)染色5 μ 1。未转染siRNA的细胞分别用Annexin-V-FITC 和PI染色用于标准定量。用FACS流式细胞仪进行双色荧光细胞流式计数，观察凋亡细胞 百分比。
[0155] 3、统计学方法
[0156] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值土标准差的方式来表 示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用的t检验，认为当 P〈〇. 05时具有统计学意义。
[0157] 4、结果：
[0158] 转染siRNAl-LY6H组的细胞凋亡率为（31. 32±0. 97) %，转染siRNA-NC组的细胞 凋亡率为（6. 95 ±0.25) %，上述差异具有统计学意义（P〈0. 05)，上述结果表明，LY6H表达 有利于胆管癌细胞存活，通过抑制LY6H基因的表达可以促进胆管癌细胞的凋亡。
[0159] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进 和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
【主权项】
1.LY6H基因及其表达产物在制备诊断胆管癌的产品中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量 PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测LY6H基因及其表达产物的表达水平以诊断胆管癌的 产品。3. -种诊断胆管癌的产品，其特征在于，所述产品能够通过检测胆管组织中LY6H基因 的表达水平来诊断胆管癌。4. 根据权利要求3所述的产品，其特征在于，所述产品包括芯片、或试剂盒。其中，所述 芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核 苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测LY6H基因转录水平的针对LY6H基因的寡核苷 酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的LY6H蛋白的特异性抗体；所 述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测 LY6H基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括LY6H蛋白的特异性抗体。5. 根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述试剂包括针对LY6H基因的引物和/ 或探针。 6. LY6H基因及其表达产物在制备治疗胆管癌的药物中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的药物包含LY6H基因和/或其表达 产物的抑制剂。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抑制剂是针对LY6H的siRNA。9. 一种用于治疗胆管癌的药物，其特征在于，所述药物包括权利要求7或8所述的抑制 剂。10. 权利要求7或8所述的抑制剂在制备治疗胆管癌的药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种与胆管癌相关的分子标记物，更具体地涉及LY6H基因在胆管癌诊断和治疗中的作用，属于基因新用途技术领域。本发明公开了LY6H基因在制备诊断胆管癌的产品中的应用，同时公开了LY6H基因在制备治疗胆管癌的药物中的应用。
【IPC分类】A61P35/00, A61K48/00, A61K45/00, C12Q1/68, A61K31/7088, G01N33/574
【公开号】CN105385754
【申请号】CN201510713576
【发明人】高倩倩, 杨承刚, 边洋
【申请人】北京泱深生物信息技术有限公司
【公开日】2016年3月9日
【申请日】2015年10月28日