一种灵芝酸提取及分析方法
【专利说明】
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技术领域
[0002] 本发明及灵芝酸分析方法技术领域，特别涉及一种灵芝酸提取及分析方法。
[0003]
【背景技术】
[0004] 灵芝（Ganoderma Iucidum)又称为仙草、瑞草、神芝、不老草，属担子菌纲、伞菌目、 多孔菌科、灵芝属真菌，在中国主要指包括赤芝、紫芝以及松杉灵芝等在内的芝类，是一种 深受中国人民喜爱的中药材，也是韩国、日本、泰国等东方国家的传统珍贵中药，具有2000 多年的药用历史，主要用于肝炎、高血压、高血脂和胃癌等疾病的治疗。灵芝性温、味甘、微 苦，有益心气、生血、助心安神、益肺气、坚筋骨、利关节、安神补肝等多种功能。食用灵芝可 延年益寿、增强体格。
[0005] 灵芝含有丰富的活性成分，以多糖和属三萜类的灵芝酸为主要活性成分。药理研 究显示灵芝多糖具有抗癌、抗肿瘤、免疫调节、抗衰老、抗氧化等作用；灵芝酸可抑制肿瘤细 胞、艾滋病毒以及细菌。当前灵芝多糖等灵芝活性物质生产主要依赖人工栽培子实体为原 料以提取的方法获取，具有产率低、难以规模化生产以及不同批次间活性成分组成及含量 有车父大差异等缺点。
[0006] 灵芝液体深层发酵具有周期短以及可工业化生产等优点，另外研究表明发酵产物 灵芝多糖和三萜具有与子实体相近的抗肿瘤活性，因此，以灵芝多糖、灵芝酸和三萜为目标 产物的液体深层发酵成为灵芝研究热点。余素萍等研究发现先摇床培养后静置培养的方法 有利于菌丝总三萜合成，有效抗肿瘤三萜生产则以摇床培养为最佳方式。高兴喜等发现真 菌激发子可诱导灵芝三萜和多糖大量合成。Liu等发现药用昆虫提取物可促进灵芝多糖生 物合成。Fang等采用先摇床培养后静置培养的发酵工艺可显著提高灵芝酸产量。
[0007] 灵芝酸是一类高度氧化的羊毛留烷衍生物，主要有高效液相色谱法、香草醛-高 氯酸比色法和紫外吸收法等3种分析方法。高效液相色谱法的优点在于其可同时分析不同 单体灵芝酸含量以及样品制备过程相对简单，但仪器昂贵、不易操作以及试剂要求高；紫外 吸收法和香草醛-高氯酸比色法由于所需仪器设备简单成为灵芝酸分析的主要方法。紫外 吸收法通常以灵芝酸A和百里酚为灵芝酸对照品以定量分析；香草醛-高氯酸比色法主要 以熊果酸和齐墩果酸作为参比物进行分析。但是利用紫外可见光谱分析不同灵芝酸及对照 品差异，以不同对照品利用紫外吸收法和香草醛-高氯酸比色法分析灵芝发酵菌丝及子实 体灵芝酸含量，是没有的。
[0008]
【发明内容】
[0009] 本发明为解决上述技术问题为提供一种分析简单、快速、准确的灵芝酸提取及分 析方法。
[0010] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为： 一种灵芝酸提取及分析方法，包括以下步骤： 步骤一、将灵芝菌株接种至PDA斜面25°C活化培养7天作为琼脂培养基菌种；取5粒 黄豆粒大小的琼脂培养基菌种加入至80mL发酵培养基中进行30°C、160r/min恒温摇瓶培 养5天作为种子；取8mL种子加入至80mL发酵培养基中进行30°C、160r/min丨旦温摇瓶培养 7天作为发酵液； 步骤二、取发酵液40mL装于50mL离心管进行4500r/min离心10min，除去上清，将沉淀 的菌丝用去离子水洗去培养基，将菌丝进行离心收集，重复一次菌丝用去离子水洗及离心 收集的过程；将收集好的菌丝放置在恒重的称量纸上，用60°C烘至恒重； 步骤三、将烘干后的菌丝于研钵中研为粉末，将粉末进行灵芝酸的提取制成菌丝灵芝 酸提取液；取灵芝子实体切片用中药粉碎机进行粉碎，将粉碎后的灵芝子实体切片制成灵 芝子实体灵芝酸提取液； 步骤四、将菌丝灵芝酸提取液稀释1倍，和标准品灵芝酸A、标准品灵芝酸C、标准品灵 芝酸C2、标准品灵芝酸E、标准品赤芝酸A、百里酚标准溶液以及灵芝子实体灵芝酸提取液 分别进行紫外可见光谱扫描，得到紫外可见光谱曲线图； 步骤五、根据紫外可见光谱曲线图，标准品灵芝酸A和百里酚标准溶液为对照品，用紫 外吸收法分别计算菌丝灵芝酸提取液和灵芝子实体灵芝酸提取液中灵芝酸的含量。
[0011] 本发明有益效果是：通过改进灵芝酸提取工艺提高其纯度提高对灵芝酸含量分析 方法的准确性，为优化灵芝酸含量分析提供有效方法，提供更好的指导生产以及提高监管 水平，使灵芝酸提取工艺更简单、快速和准确，有效优化和改变灵芝酸分析方法。
[0012] 作为本发明的一种优选结构，在所述步骤一之前还包括： 将葡萄糖35g、蛋白胨3.5g、KH2P04 lg、MgS04 0.5g以及维生素 Bl 0.01 g加入1000 mL 去离子水中，用121°C灭菌20min制成发酵培养基。
[0013] 作为本发明的一种优选结构，所述恒温摇瓶所用的摇瓶均为250mL摇瓶。
[0014] 作为本发明的一种优选结构，所述紫外可见光谱扫描的光程为Icm石英比色皿， 紫外可见光谱扫描的扫描范围为200~700nm，紫外可见光谱扫描的采样间隔2nm。
[0015] 为解决上述技术问题，本发明采用的另一种技术方案为： 一种灵芝酸提取及分析方法，包括以下步骤： 步骤一、将灵芝菌株接种至PDA斜面25°C活化培养7天作为琼脂培养基菌种；取5粒 黄豆粒大小的琼脂培养基菌种加入至80mL发酵培养基中进行30°C、160r/min恒温摇瓶培 养5天作为种子；取8mL种子加入至80mL发酵培养基中进行30°C、160r/min丨旦温摇瓶培养 7天作为发酵液； 步骤二、取发酵液40mL装于50mL离心管进行4500r/min离心10min，除去上清，将沉淀 的菌丝用去离子水洗去培养基，将菌丝进行离心收集，重复一次菌丝用去离子水洗及离心 收集的过程；将收集好的菌丝放置在恒重的称量纸上，用60°C烘至恒重； 步骤三、将烘干后的灵芝于研钵中研为粉末，将粉末进行灵芝酸的提取制成灵芝酸提 取液；取灵芝子实体切片用中药粉碎机进行粉碎，将粉碎后的灵芝子实体切片制成灵芝子 实体灵芝酸提取液； 步骤四、将灵芝酸提取液和标准品灵芝酸A、熊果酸标准溶液、齐墩果酸标准溶液以及 稀释1倍的灵芝子实体灵芝酸提取液分别进行紫外可见光谱扫描，得到紫外可见光谱曲线 图； 步骤五、根据紫外可见光谱曲线图，取熊果酸标准溶液和齐墩果酸标准溶液为对照品， 用香草醛-高氯酸比色法分别计算菌丝灵芝酸提取液和灵芝子实体灵芝酸提取液中灵芝 酸的含量。
[0016] 作为本发明的一种优选结构，在所述步骤一之前还包括： 将葡萄糖35g、蛋白胨3.5g、KH2P04 lg、MgS04 0.5g以及维生素 Bl 0.01 g加入1000 mL 去离子水中，用121°C灭菌20min制成发酵培养基。
[0017] 作为本发明的一种优选结构，所述恒温摇瓶所用的摇瓶均为250mL摇瓶。
[0018] 作为本发明的一种优选结构，所述紫外可见光谱扫描的光程为Icm石英比色皿， 紫外可见光谱扫描的扫描范围为200~700nm，紫外可见光谱扫描的采样间隔2nm。
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【附图说明】
[0020] 图1为本发明实施方式一得到的不同灵芝酸、赤芝酸A、百里酚以及样品紫外可见 光谱曲线图； 图2为本发明灵芝酸A、熊果酸、齐墩果酸及灵芝菌丝及子实体提取液香草醛-高氯酸 显色反应紫外可见光谱曲线图。
[0021]
【具体实施方式】
[0022] 为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式 并配合附图详予说明。
[0023] 定义： 灵芝酸是一种三萜类物质，已分离到100多种，如灵芝酸A、B、C、D、E、F、G、I、L、ma、md、 mg等。有些灵