日本血吸虫线粒体分子标记及其应用

日本血吸虫线粒体分子标记及其应用
【专利摘要】本发明提供了一种日本血吸虫线粒体分子标记及其应用。具体地，本发明公开了一种基于ND1、ND4、和16S-12S rDNA基因序列的聚类分析结果，从而鉴定日本血吸虫(Schistosoma japonicum katsurada)样本地域株、和/或对日本血吸虫样本进行地域性种群聚类的方法。本发明方法简便、准确，且稳定性高，对于鉴定血吸虫病患者的原始感染地，判断病例是原发型还是输入型有很大帮助。也为日本血吸虫病的监测和流行现状的研究提供了支持。
【专利说明】
日本血吸虫线粒体分子标记及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术和遗传学领域，具体地说，本发明涉及一种利用线粒体基因 作为分子标记鉴定日本血吸虫群体的方法以及线粒体分子标记在日本血吸虫群体遗传学 中的应用。
【背景技术】
[0002] 日本血吸虫病是一种严重威胁人类健康的人畜共患病，全球每年因日本血吸虫病 死亡人数约28万。经过几十年的努力，我国血吸虫病防治工作取得了举世瞩目的成就，然 而目前我国仍有现症感染人群约30万，尤其是目前大量人口流动，加之人们对血吸虫病防 范意识松懈，导致我国血吸虫病防治形势不容乐观，防治任务依然艰巨。
[0003] 日本血吸虫在东南亚地区流行多年，在不同流行区具有明显的遗传多样性，不同 地域群体间有着多种不同的遗传分化或变异。其中，目前受到广泛认可的东南亚流行区分 型大致可以分为以中国台湾、日本、印尼等为主的岛屿型、以中国四川、云南、贵州等区域为 主的山区型、以及以中国湖北、湖南、安徽等区域为主的湖区型。其中，除岛屿型中台湾株日 本血吸虫不具有人类致病性（但可感染牛等家畜），其他各型均对人类具有致病性。然而， 由于种属相同，不同流行类型的日本血吸虫很难通过大体外形进行所属地域来源的区分。 在实现我国2015年达到全国血吸虫病传播阻断关键时期以及之后很长一段时间内，对血 吸虫病流行进行监测是评估和评价防治成果的必要措施，而发展鉴别日本血吸虫地域性来 源的技术可为血吸虫病流行监测提供有效地技术手段。
[0004] 近年来，众多的分子标记被应用于日本血吸虫的群体地域遗传研究中，如等位酶、 限制性片段长度多态性（RFLP)、随机扩增多态性（RAPD)、微卫星（STR)等。然而，尚没有一 种能够鉴别日本血吸虫地域株，尤其是将台湾型（即非致病株型）与其他地域株型鉴别开 的有效方法。
[0005] 因此，本领域迫切需要开发一种新的鉴定日本血吸虫地域株型或将日本血吸虫进 行地域性种群聚类的方法。

【发明内容】

[0006] 本发明利用特定的线粒体基因组合，可以有效鉴别日本血吸虫的地域株型。
[0007] 本发明第一方面，提供了一种鉴定日本血吸虫（schistosoma japonicum katsurada)样本地域株、和/或对日本血吸虫样本进行地域性种群聚类的方法，包括步骤：
[0008] ⑴对一个和/或多个样本中以下三种线粒体基因进行测序：
[0009] NADH 脱氢酶 1 (ND1)、NADH 脱氢酶 4 (ND4)、和 16S-12S rDNA 基因；
[0010] (ii)将步骤（i)中的测序结果与日本血吸虫标准数据库中的地域株参考序列信 息进行多序列联配，并利用所获的比对信息进行聚类分析；
[0011] (iii)根据（ii)中的聚类分析结果获得所述样本的地域株鉴定结果、和/或所述 样本地域性种群的聚类结果。
[0012] 在另一优选例中，所述的日本血吸虫样本包括虫卵、毛蝴、尾蝴、和/或成虫样本。
[0013] 在另一优选例中，当所述的样本为一个时，所述的方法包括将样本的测序结果与 日本血吸虫标准数据库中的地域株参考序列信息进行比对，从而用于鉴定所述样本所属的 地域株；和/或
[0014] 当所述的样本为多个时，所述的方法包括将多个样本的测序结果同时与日本血吸 虫标准数据库中的地域株参考序列信息进行多序列联配，从而用于对日本血吸虫样本进行 地域性种群聚类。
[0015] 在另一优选例中，步骤（i)中的测序为对三种线粒体基因同时进行测序。
[0016] 在另一优选例中，步骤（iii)中的聚类分析结果包括所述样本测序结果与标准数 据库序列信息之间的距离；
[0017] 其中，当样本与参考序列信息之间和/或多个样本之间的距离越近，则表明所述 样本与参考序列所属地域株之间和/或多个样本之间的地域性越接近。
[0018] 在另一优选例中，所述的距离包括所述样本测序结果与参考序列信息之间的碱基 差异度或差异量。
[0019] 在另一优选例中，步骤（iii)中的聚类分析结果包括样本与参考序列信息之间和 /或多个样本之间的进化树信息。
[0020] 在另一优选例中，所述的进化树信息的构建如下：根据步骤（ii)中的比对信息， 利用最大似然法（Maximum Likelihood, ML)构建进化树信息。
[0021] 在另一优选例中，所述最大似然法采用HKY模型。
[0022] 在另一优选例中，所述的进化树信息包括进化树的分支长度、和/或分支点的 Bootstrap 值。
[0023] 在另一优选例中，所述标准数据库中的地域株参考序列信息包括来自岛屿型、湖 区型、和/或山区型的日本血吸虫序列信息。
[0024] 在另一优选例中，所述岛屿型日本血吸虫序列信息包括中国台湾（TW)型、印度尼 西亚（IN)型、日本（JP)型、菲律宾（PH)型。
[0025] 在另一优选例中，所述湖区型日本血吸虫序列信息包括安徽贵池（AHGC)、安徽铜 陵（AHTN)、湖南岳阳（HNYY)、湖南常德（HNCD)、湖北沙市（HBSH)、江西都昌（JXDC)。
[0026] 在另一优选例中，所述山区型日本血吸虫序列信息包括云南洱源（YNEY)、四川西 昌（SCXC)o
[0027] 在另一优选例中，所述标准数据库中的参考序列信息如SEQ ID NO. :7-30所示，其 中，SEQ ID NO. :7-12所示的序列为ND1基因 ，SEQ ID NO. :13-18所示的序列为ND4基因， SEQ ID NO. :19-24所示的序列为 16s-rDNA基因 ，SEQ ID NO. :25-30所示的序列为 12s-rDNA 基因，所属的地域按顺序分别为湖区代表安徽贵池型、山区代表云南洱源型、中国台湾型、 印尼型、日本型、菲律宾型。
[0028] 本发明第二方面，提供了一种引物组合，所述的引物组合用于扩增以下三个日本 血吸虫的线粒体基因：ND1、ND4、和16S-12S rDNA基因。
[0029] 在另一优选例中，所述的引物组合中的引物如SEQ ID N0. : 1-6所示。

[0036] 本发明第三方面，提供了日本血吸虫线粒体基因组合和/或本发明第二方面所述 引物组合的用途，用于制备鉴定日本血吸虫样本地域株、和/或对日本血吸虫样本进行地 域性种群聚类的试剂盒；
[0037] 其中，所述的日本血吸虫线粒体基因组合含有：ND1、ND4、和16S-12S rDNA基因。
[0038] 本发明第四方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒含有本发明第二方面所述的 引物组合。
[0039] 本发明第五方面，提供了本发明第四方面所述试剂盒的用途，用于鉴定日本血吸 虫样本地域株、和/或对日本血吸虫样本进行地域性种群聚类。
[0040] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0041] 图1显示了 12个流行区（安徽贵池、安徽铜陵、湖南岳阳、湖南常德、湖北沙市、江 西都昌、四川西昌、云南洱源、中国台湾及日本、菲律宾、印度尼西亚）日本血吸虫样本线粒 体基因 ND1序列比对结果，其中以色块标示出的是存在核苷酸多态性的位点。
[0042] 图2显示了 12个流行区的日本血吸虫样本3个线粒体基因（ND1，ND4和16-12S rDNA)联合在一起后，用MEGA5. 1构建的最大似然法（ML)进化树（HKY模型）。
[0043] 图3显示了基于12个流行区的日本血吸虫样本（与图2所用的完全一致）的ND1 基因构建的ML tree。
[0044] 图4显示了基于12个流行区的日本血吸虫样本（与图2所用的完全一致）的ND4 基因构建的ML tree。
[0045] 图5显示了基于12个流行区的日本血吸虫样本（与图2所用的完全一致）的 16S-12S基因构建的ML tree。
[0046] 图6显示了用ATP-6基因构建的ML tree (没有清晰的地域性聚类）。
[0047] 图7显示了 12个流行区（安徽贵池、安徽铜陵、湖南岳阳、湖南常德、湖北沙市、江 西都昌、四川西昌、云南洱源、中国台湾及日本、菲律宾、印度尼西亚）日本血吸虫样本线粒 体基因在MrBayes中构建的ML进化树（GTR模型）。
【具体实施方式】
[0048] 本发明人经过广泛而深入的研究，首次提供了一种对日本血吸虫样本进行群体遗 传分析、亲缘鉴定或品种鉴定的简便方法。本发明通过大量筛选，采用了三个线粒体基因 (ND1，ND4和16-12S rDNA)作为日本血吸虫遗传分化聚类的分子标记物。通过对这三个线 粒体基因的核苷酸序列进行流行病学分析可以展示血吸虫种间和种内的遗传关系、群体结 构和进化时间等；本发明方法实验操作简单，鉴定结果准确，特别是可以清楚的分辨中国大 陆西南山区和长江中下游湖区以及东南亚岛屿之间的日本血吸虫群体，对于鉴定新发血吸 虫进化来源以及血吸虫病患者的原始感染地均有很大帮助。在此基础上，完成了本发明。
[0049] 日本血吸虫的地域分型
[0050] 目前，受到广泛认可的东南亚流行区分型大致可以根据其流行区地理特征分为以 中国台湾、日本、印尼等为主的岛屿型、以中国四川、云南、贵州等区域为主的山区型、以及 以中国湖北、湖南、安徽等区域为主的湖区型。
[0051] 其中，除岛屿型中台湾型血吸虫不具有人类致病性，其他各型均具有一定的人类 致病性，然而，由于种属相同，这些类型的日本血吸虫很难通过外形进行所属地域来源的区 分。
[0052] 线粒体基因
[0053] 自上世纪80年代以来，线粒体DNA(mtDNA)分析方法在遗传学、系统分类学、分子 生态学、群体遗传及人类学等方面得到了广泛的应用。线粒体DNA具有分子结构简单、无内 含子，突变率高、进化速度快，稳定母系遗传、无重组等特点，非常有利于进行遗传进化及亲 缘学分析，已经成为相关领域中应用最广泛的分子标记。
[0054] 近年来，众多的分子标记被应用于日本血吸虫的群体遗传研究中，如等位酶、限制 性片段长度多态性（RFLP)、随机扩增多态性（RAPD)、微卫星（STR)等。然而线粒体基因作 为一种中性的分子标记，因其突变率高、进化速度快（是核基因的四倍）、遗传稳定的特点， 在日本血吸虫遗传分类鉴定方面，具有更大的优势。
[0055] 本发明采用的线粒体基因为日本血吸虫ND1，ND4和16S-12S rDNA基因。
[0056] ND1 是 NADH 脱氛酶 1 (NADH dehydrogenase 1)的简写；
[0057] ND4 是 NADH 脱氛酶 4 (NADH dehydrogenase 4)的简写；
[0058] 有研究认为，NADH脱氢酶的蛋白编码基因是进化较快的基因之一。
[0059] 16S-12S rDNA是编码线粒体核糖体大、小亚基中所含的rRNA的DNA序列，因其通 常既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域。
[0060] 其中，可以采用任意已知地域来源的血吸虫株系中ND1，ND4和16S-12S rDNA的基 因作为标准数据库中参考序列信息（涵盖日本血吸虫代表性流行区样本的序列信息）。
[0061] 聚类分析
[0062] 聚类分析为生物信息学和生物统计学常用概念，对多维数据进行降维来展示其关 系的一种方法。本领域技术人员理解，术语"聚类分析"为生物学领域遗传学研究常用的数 据源相似性描述技术。根据日本血吸虫标准数据库中的三线粒体基因参考序列信息，以及 聚类分析的技术方式，可以对未知来源的日本血吸虫样本或样本种群进行地域性聚类或鉴 定。
[0063] 本发明通过大量实验和数据筛选，获得了一组聚类分析结果稳定性较强的日本血 吸虫线粒体基因。实验证明，采用本领域最常用的ML进化树或MrBayes进化树，以及不同 的模型，均能够基于这三个基因的组合获得结果稳定、可靠的聚类结果。
[0064] 引物组合
[0065] 本发明的引物组合包括三对引物，所述的引物可以分别扩增出ND1，ND4或 16S-12S rDNA基因。可用于本发明的引物组合中的引物没有特殊限制，可以为任何能够扩 增出ND1，ND4或16S-12S rDNA基因序列的引物，而从这些引物中也可以任意挑选合适的 引物对进行组合，从而构成本发明引物组合。通过软件预测以及人为优化筛选，本发明人发 现，SEQ ID NO. : 1-6的引物能够有效地扩增出ND1，ND4或16S-12S rDNA基因。
[0066] 试剂盒
[0067] 本发明试剂盒包括本发明的引物对组合，优选还包括ND1、ND4、和16S-12S rDNA 基因的扩增产物作为阳性对照。此外，本发明试剂盒中还含有对如何采用本发明试剂盒进 行鉴定日本血吸虫样本地域株、和/或对日本血吸虫样本进行地域性种群聚类的说明书。
[0068] 本发明有益效果
[0069] 本发明展示了一种对血吸虫样本进行群体遗传分析、亲缘鉴定或品种鉴定的简便 方法。本发明通过文献调研和软件分析（jmodeltest, MEGA等），并对线粒体上的每个蛋白 编码基因构建ML tree，逐一进行人工分析和评价（主要评价依据是已知样本来源地的个 体是否在ML tree的同一分支或相邻分支上，以及分支点的Bootstrap值），最终从多个线 粒体蛋白编码基因中选出了地域相关性最好的3个基因（ND1，ND4和16-12S rDNA)并组合 起来用于对日本血吸虫进行群体进化分析和地域株鉴定。
[0070] 线粒体基因遗传稳定，易于扩增，进化速度快，适于作为分子标记物。经过软件分 析和人工优选后，基于所选的三个基因设计了特异性的引物，所述引物扩增效果良好，扩增 产物唯一。通过对其核苷酸序列的分析可以展示血吸虫种间和种内的遗传关系、群体结构 和进化时间等；实验操作简单，鉴定结果准确，对于鉴定血吸虫病患者的原始感染地，判断 病例是原发型还是输入型有很大帮助。也为日本血吸虫病的监测和流行现状的研究提供了 支持。
[0071] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照 常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否 则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0072] 实施例1样本收集、基因组DNA提取以及目标片段的扩增
[0073] (1)收集来自安徽贵池、安徽铜陵、湖南岳阳、湖南常德、湖北沙市、江西都昌、四川 西昌、云南洱源、中国台湾及日本、菲律宾、印度尼西亚等12个流行区的日本血吸虫样本， 提取单个个体的基因组DNA (提取试剂：QIAGEN公司（德）生产的DNeasy Blood&Tissue Kit试剂盒）。具体方法如下：
[0074] 将单条日本血吸虫成虫放入1. 5ml EP管中，加入1. OmM EDTA和10mM Tris缓冲液 500 μ 1。振荡后吸尽液体，重复三次。加入试剂盒中提供的ATL缓冲液180 μ 1 ;加入20 μ 1 蛋白酶Κ，振荡混匀。在56°C水浴中孵育4h，中间振荡数次。从水浴中取出后振荡15s，加 入200 μ 1缓冲液AL，振荡混匀。再加入200 μ 195 %以上的乙醇，混匀。将所有液体移入 DNeasy抽提柱里，8000g离心lmin，弃滤液。向抽提柱中加入500 μ 1缓冲液AWl，8000g离 心lmin，弃滤液。再向抽提柱中加入500 μ 1缓冲液AW2,12000g离心3min，弃滤液。保留 的抽提柱移入新的EP管中，加入150 μ 1缓冲液AE(或ddH20)。室温下静置lmin，12000g 离心lmin。滤液中即含有基因组DNA，-20°C保存。
[0075] (2)引物合成采用固相亚磷酰胺三酯法（生工生物工程（上海）股份有限公司） 合成特异性扩增引物，序列如SEQ ID N0. : 1-3所示，用HAP法纯化。
[0076] (3) PCR 扩增
[0077] PCR 反应体系为 20 μ 1 :包括 2 μ 1 lOXBuffer，四种 dNTP 各 0· 25mM，Taq DNA 聚 合酶1. 25U，上、下游引物各0. 5ymol，模板DNA 20- 50ng。
[0078] 扩增反应在LifePro PCR仪上进行，反应条件为：
[0079] ① 94°C预变性 lOmin ;
[0080] ② 94 Γ 变性 30s;
[0081] ③退火 30s (ND1 和 ND4 的退火温度为 55°C，16S-12S rDNA 则为 49°C )
[0082] ④ 72°C延伸（ND1 延伸 90s，ND4 和 16S-12S rDNA 延伸 150s)
[0083] ⑤步骤②一④重复35个循环后，72°C延伸lOmin。
[0084] 扩增产物送至华大基因上海分公司进行测序。采用ABI3730进行双向测序，测序 引物即扩增所用引物。
[0085] 实施例2序列联配
[0086] 采用实施例1中测序获得的基因序列用MEGA 5. 1软件与标准数据库中已知地域 来源的参考序列（数据库）进行多序列联配。
[0087] 序列联配结果之一（ND1基因）可见图1，可见不同流行区的个体间存在着相当多 的碱基变异。而其他两个基因也同样存在着不同个体之间的碱基变异（结果未示出）。
[0088] 实施例3进化树的构建
[0089] 通过模型分析软件（jmodeltest)评价及人工抽样检验，选择最合适的核苷酸进 化模型为HKY模型，用最大似然法（Maximum Likelihood, ML)基于所选模型构建进化树。根 据进化树的拓扑结构（特别是各分支点及Bootstrap值）判断样本来源地域。
[0090] 3. 1单个基因的进化树构建
[0091] 3. 1. 1 ND1构建的进化树
[0092] 用ND1基因构建的ML进化树，结果见图3,可见ND1基因能很好地区分出中国台湾 (TW)、印度尼西亚（IN)和云南（YNEY);
[0093] 3. 1. 2 ND4构建的进化树
[0094] 用ND4基因构建的ML进化树，结果见图4,可见ND4基因能较好地区分出台湾 (TW)、湖北沙市（HBSH)和云南（YNEY)。
[0095] 3. 1. 3 16S-12S rDNA 构建的进化树
[0096] 用16S-12S rDNA基因构建的ML进化树，结果见图5,可见16S-12S rDNA基因能较 好地区分出中国台湾（TW)、印度尼西亚（IN)、四川（SCXC)和云南（YNEY)的样本。
[0097] 3. 1. 4 ATP-6构建的进化树
[0098] 用ATP-6基因构建的ML进化树，结果见图6,可见ATP-6基因构建的ML进化树并 没有清晰的地域性聚类。
[0099] 而采用日本血吸虫其他线粒体基因构建的进化树也均与ATP-6基因相似，没有明 显的地域性聚类（结果未示出）。
[0100] 3. 2采用三基因联合构建的进化树
[0101] 利用ND1，ND4和16-12S rDNA三基因联合，以相同的模型和方法构建单倍型进化 树，结果可见图2,可见12个流行区中，来自中国台湾，菲律宾和印度尼西亚这三个岛屿 型地区的日本血吸虫样本可以较好的按地域聚类在一起，而中国山区如云南、四川等地的 日本血吸虫样本也能够较明显地聚类，而中国湖区的如安徽、江西、湖南等地则无明显的聚 类，群体分布较为分散。
[0102] 由此可见，本发明通过优选的三线粒体基因联合，可以将岛屿型、山区型的日本血 吸虫样本进行良好的聚类，而无法聚类的剩余血吸虫类型则可归为中国湖区型。
[0103] 实施例4更换进化模型以及进化树发生程序后对三基因鉴定稳定性研究
[0104] 为验证所选三个线粒体基因在进行地域株划分时的稳定性，本实施例使用另一种 核苷酸进化模型（GTR)和另一种系统发生分析程序（MrBayes v3. 2. 2)对实例中样本的三 个线粒体基因序列进行分析，所构建的单倍型进化树如图7所示。可以看出，与图2相比 较，在不同的核苷酸进化模型下，进化树的枝长发生了较大的改变，这是由不同模型的进化 速率设定不同所导致的。但各样本的聚类情况并没有发生明显变化，即中国台湾，菲律宾 和印度尼西亚的日本血吸虫样本能显著的与中国大陆山区以及湖区的样本分开。说明所选 基因组合最为有效和稳定。
[0105] 实施例5血吸虫地域来源的验证
[0106] 取实施例1中各地域来源的样本各1例，通过盲法采用实施例1-3的步骤进行进 化树的构建。结果表明，采用ND1、ND4和16s-12s rDNA基因可以将中国台湾，菲律宾和印 度尼西亚的日本血吸虫样本与中国大陆山区以及湖区的样本分开。其中聚类较为显著的是 各岛屿型以及山区型的样本，与其原始来源吻合，而分布较为分散的样本也符合原始来源 湖区的特征。
[0107] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【主权项】
1. 一种鉴定日本血吸虫（Schistosoma japonicum katsurada)样本地域株、和/或对 日本血吸虫样本进行地域性种群聚类的方法，其特征在于，包括步骤： (i) 对一个和/或多个样本中以下三种线粒体基因进行测序： NADH 脱氢酶 1 (ND1)、NADH 脱氢酶 4 (ND4)、和 16S-12S rDNA 基因； (ii) 将步骤（i)中的测序结果与日本血吸虫标准数据库中的地域株参考序列信息进 行多序列联配，并利用所获的比对信息进行聚类分析； (iii) 根据（ii)中的聚类分析结果获得所述样本的地域株鉴定结果、和/或所述样本 地域性种群的聚类结果。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述的样本为一个时，所述的方法包括将 样本的测序结果与日本血吸虫标准数据库中的地域株参考序列信息进行比对，从而用于鉴 定所述样本所属的地域株；和/或 当所述的样本为多个时，所述的方法包括将多个样本的测序结果同时与日本血吸虫标 准数据库中的地域株参考序列信息进行多序列联配，从而用于对日本血吸虫样本进行地域 性种群聚类。3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（iii)中的聚类分析结果包括所述样本 测序结果与标准数据库序列信息之间的距离； 其中，当样本与参考序列信息之间和/或多个样本之间的距离越近，则表明所述样本 与参考序列所属地域株之间和/或多个样本之间的地域性越接近。4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（iii)中的聚类分析结果包括样本与参 考序列信息之间和/或多个样本之间的进化树信息。5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标准数据库中的地域株参考序列信息 包括来自岛屿型、湖区型、和/或山区型的日本血吸虫序列信息。6. -种引物组合，其特征在于，所述的引物组合用于扩增以下三个日本血吸虫的线粒 体基因：ND1、ND4、和 16S-12S rDNA 基因。7. 如权利要求6所述的引物组合，其特征在于，所述的引物组合中的引物如SEQ ID NO. : 1-6 所示。 (ND1-F：5, -TTGGAGTTTGTCAGGCTTTAGG(SEQ ID NO. :1) ND1-R：5, -TATATCAAACACCATCAAAAGGAAC(SEQ ID NO. :2) ND4-F：5, -TGCTGTTTTATGCTATGCTACGAAG(SEQ ID NO. :3) ND4-R：5, -TACAAACGGACGGACCAATAAAAC(SEQ ID NO. :4) rDNA-F ：5? -ATAATGTTGCGTCTAAGGTC(SEQ ID NO. :5) rDNA-R：5, -TAAACACTACCCATCAAATC(SEQ ID NO. :6))8. 日本血吸虫线粒体基因组合和/或权利要求6所述引物组合的用途，其特征在于，用 于制备鉴定日本血吸虫样本地域株、和/或对日本血吸虫样本进行地域性种群聚类的试剂 盒； 其中，所述的日本血吸虫线粒体基因组合含有：ND1、ND4、和16S-12S rDNA基因。9. 一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有权利要求6所述的引物组合。10. 权利要求9所述试剂盒的用途，其特征在于，用于鉴定日本血吸虫样本地域株、和/ 或对日本血吸虫样本进行地域性种群聚类。
【文档编号】C12Q1/68GK105986016SQ201510061854
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月5日
【发明人】胡薇, 徐斌, 冯正, 殷明波, 李鸿雁, 郑鸿翔, 莫筱瑾
【申请人】中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所, 复旦大学