专利名称：鉴定纯种波尔山羊的线粒体分子遗传特征标记和方法
技术领域：
本发明属于利用分子生物学方法检测生物物种的技术领域。更具体地，涉及波尔山羊线粒体DNA分子特征遗传标记，以及此标记为基础检测纯种波尔山羊的方法。
背景技术：
在肉食品的生产结构中，牛羊肉低脂肪、高蛋白，不仅是优质的肉类产品，同时还是清真肉制品的主要原料。
波尔山羊(Capra hircus，Boer)是世界上公认的优秀肉用品种，具有个体大，初期生长速度快，适应性广，繁殖性能好，出肉率高等优良特性。中国是农业大国，畜牧业在农业中占有极其重要的位置。但与畜牧业发达国家新西兰、澳大利亚等相比有相当大的差距。特别是养羊业，仍停留在传统的品种低层次和饲养管理低水平上，品种差，散养多，规模小，效益低。波尔山羊是重点推广的良种，成为改良地方山羊、促进养羊业产业化的当家品种。由于前期波尔山羊原种均从国外引进，相对价格较昂贵，导致引进回国繁殖选育的原种、纯种价格相对较高。目前鉴定纯种波尔山羊使用传统的形态学鉴定方法，很不准确，由此产生不法人员用杂交一代和杂交二代波本杂交羊冒充波尔山羊欺骗顾客的情况。因此，本领域迫切需要开发新的能有效鉴定纯种波尔羊的方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种鉴定纯种波尔山羊的方法。
本发明的另一目的是提供鉴定纯种波尔山羊的遗传标记。
在本发明的第一方面，提供了一种分离的检测纯种波尔山羊的遗传标记物，其特征在于，所述遗传标记物含有SEQ ID NO9中第1900-1940所示的线粒体D-环区序列，并且其起始核苷酸为SEQ ID NO9中第528-1900位中的一个核苷酸，终止核苷酸为起始核苷酸为SEQ ID NO9中第1940-3274中的一个核苷酸，长度为400-2700bp。
在另一优选例中，所述的遗传标记物的长度600-1800bp。
在另一优选例中，所述的遗传标记物的序列如SEQ ID NO1所示。
在本发明的第二方面，提供了一种PCR引物对，其长度为15-35个核苷酸，其中一个引物的序列与SEQ ID NO9中第528-1900位所示的序列相同，且另一个引物的序列与SEQ ID NO9中第1940-3274位所示的序列互补；或者其中一个引物的序列与SEQ ID NO9中第528-1900位所示的序列互补，且另一个引物的序列与SEQ ID NO9中第1940-3274位所示的序列相同；且所述引物对的扩增产物的长度为400-2700bp。
在另一优选例中，所述引物的长度为20-30个核苷酸。
在另一优选例中，所述的引物选自SEQ ID NO3-8。
在本发明的第三方面，提供了一种检测纯种波尔山羊的试剂盒，它含有(a)特异性扩增纯种波尔羊遗传标记物的引物对，所述的引物长度为15-35个核苷酸，其中一个引物的序列与SEQ ID NO9中第528-1900位所示的序列相同，且另一个引物的序列与SEQ ID NO9中第1940-3274位所示的序列互补；或者其中一个引物的序列与SEQ ID NO9中第528-1900位所示的序列互补，且另一个引物的序列与SEQ ID NO9中第1940-3274位所示的序列相同；并所述引物对的扩增产物的长度为400-2700bp；(b)TaqI酶。
在另一优选例中，在所述的试剂盒中，所述引物对中的一个引物选自下组SEQ ID NO3、5、7；另一个引物选自下组SEQ ID NO4、6、8。
更佳地，所述引物对含有SEQ ID NO3、5、7和SEQ ID NO4、6、8所示的引物。
在另一优选例中，所述的试剂盒，还具有阳性对照和阴性对照。
在本发明的第四方面，提供了一种鉴定山羊是否是纯种波尔山羊的方法，它包括步骤(a)抽提山羊的DNA；(b)将抽提的DNA作为模板，用特异性扩增纯种波尔山羊遗传标记物的引物对进行PCR扩增，其中所述的引物长度为15-35个核苷酸，其中一个引物的序列与SEQ ID NO9中第528-1900位所示的序列相同，且另一个引物的序列与SEQID NO9中第1940-3274位所示的序列互补；或者其中一个引物的序列与SEQ ID NO9中第528-1900位所示的序列互补，且另一个引物的序列与SEQ ID NO9中第1940-3274位所示的序列相同；并且所述引物对的扩增产物的长度为400-2700bp；(c)对步骤(b)的扩增产物用TaqI进行酶切，酶切图谱与阳性对照相同就表明被鉴定的山羊是纯种波尔山羊。
在另一优选例中，所述引物对中的一个引物选自下组SEQ ID NO3、5、7；另一个引物选自下组SEQ ID NO4、6、8。
图1显示了山羊线粒体中细胞色素b基因、D-环区和12srRNA基因的位置关系，相应的序列示于SEQ ID NO9。
图2A显示了本发明一个实施例中扩增的南非波尔山羊线粒体DNA细胞色素b基因和12srRNA基因之间的1614bp扩增产物(SEQ ID NO1)的TaqI酶切示意图。
图2B显示了本发明一个实施例中扩增的关中奶山羊线粒体DNA细胞色素b基因和12srRNA基因之间的1614bp扩增产物(SEQ ID NO2)的TaqI酶切示意图。
图3显示了对不同山羊的含线粒体D-环区的扩增产物的酶切图谱。其中各泳道是1、2为南非波尔山羊；3、4为澳大利亚波尔山羊；5、6为新西兰波尔山羊；7为德系波尔山羊(高代杂交羊)；8为山东青山羊；9为关中奶山羊；10为萨能奶山羊；11为徐淮山羊；12为F1代杂交波尔羊；13为F2代杂交波尔羊。
图4显示了对不同山羊的含线粒体D-环区的扩增产物的酶切图谱。其中各泳道是1为南非波尔山羊；12为萨能奶山羊；2、3、4、5、6、7、8、9、10、11为山东青山羊。
具体实施例方式
本发明人经过深入而广泛的研究，首次发现了纯种波尔山羊的特征性的遗传标记物，即纯种波尔山羊线粒体DNA D-环区(D-Loop区)有特异性限制性内切酶酶切位点(TaqI)区别于本地山羊。山羊线粒体DNA D-环区经PCR扩增，并用特异的限制性内切酶(如TaqI)酶切扩增产物后，纯种波尔山羊所产生的酶切图谱区别于本地山羊。本发明人在该遗传标记物的基础上，开发了特异性扩增纯种波尔山羊遗传标记物或其片段的引物对和试剂盒，从而首次实现了对纯种波尔山羊的快速准确鉴定。
高等动物线粒体DNA(mtDNA)是一共价闭合的环状双链超螺旋DNA分子，长约5.5微米，分子量在1×107道尔顿左右，大小约14-19kb，山羊线粒体长15.8kb。
虽然mtDNA基因组的长度及组织结构十分稳定，但一级结构上的进化都很快，是单拷贝核DNA的5-10倍，约1％/106年。哺乳动物mtDNA的突变方式主要是碱基置换(substitution)，包括转换(transition)和颠换(transvertion)，很少有基因重排。
同种哺乳动物个体之间的平均核苷酸顺序歧异值通常在0.3％到4％之间，最大时竟达10％以上。mtDNA核苷酸序列的分歧程度能反映物种亲缘关系的远近，这一特点在种群遗传学和进化分类学上得到了应用。mtDNA复制起始区有一特殊结构称为D-loop区，约占线粒体基因组的6％，该区A-T碱基富集，为非编码区，是动物线粒体基因组中进化速度最快的一段DNA序列(Upholt WB，Dawid I B，″Mapping of mitochondrial DNA of individual sheep and goatsRapidevolution in the D-loop region″，Cell，11571-583，1977；Cronin M A，″RapidCommunicationA unique Sac II restriction fragmentlength polymorphism inmitochondrial DNA of sheep and goats″，Journal of Animal Science，72(3)796，1977；Walberg M W，Clayton D A，.″Sequence and properties of the human KB celland mouse L cell D-loop regions of miochondrial DNA″.NucleicAcidRes，95411～5421，1981；Chang D D，Clayton D A，.“Proming of human mitochondrial DNAreplication occurs at the strand promoter”.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82351～355，1985)。
D-loop区同时也是mtDNA的控制区。D-loop区特别适合于种内群体水平的研究。mtDNA由卵细胞传递后代，属于典型的母性遗传。受精过程显微观察表明，虽然精子中含有线粒体并通过受精进入了卵子，但与卵子中的相比，微不足道。目前普遍认为高等动物的mtDNA是母系遗传的，一个个体就可以代表一个母系集团，故通过几只随机的动物个体样本就可以了解一个群体的遗传结构。mtDNA母系遗传特性同时为亲子鉴定提供了可靠的理论依据。
动物线粒体DNA具有分子量小、结构简单、进化速度快、母性遗传、无组织特异性及提取方便等特点。正是由于mtDNA具有这些特点，因而它被广泛用于哺乳动物群体遗传，种内及种间亲缘关系，系统发生，物种起源与分化，分类及育种等方面的研究。由于动物线粒体特别是线粒体D-loop区具有变化快但相对稳定的特点，因此，通过鉴定线粒体是否来自良种动物品系可以判定该动物个体是否为纯种良种动物品系(例外的情况是良种动物品系的雌性与非良种动物品系的雄性的杂交后代)。
本发明的理论基础是，与其他山羊相比，纯种波尔山羊线粒体D-环区含有一个额外的TaqI酶切位点(SEQ ID NO9中第1930位，或SEQ ID NO1中第911位)。因此先扩增出含该酶切位点的扩增产物，再利用该酶切位点所产生的酶切图谱的差异，可以方便、快速、有效地鉴别纯种波尔山羊。
如本文所用，术语“波尔山羊特异性酶切位点”或“特异性酶切位点”指纯种波尔山羊线粒体D-环区含有一个额外的TaqI酶切位点(SEQ ID NO9中第1930位，或SEQ ID NO1中第911位)。
参见图1和SEQ ID NO9，其中显示了山羊线粒体中细胞色素b基因、D-环区和12srRNA基因的位置关系。其中第1-1140位为细胞色素b基因，第1140-1278位为间隔区，第1279-2491位为D-环区，第2492-5173位为12srRNA基因。
虽然理论上只要扩增引物对分别位于线粒体D-环区该特异性酶切位点的上下游，就可获得含特异性酶切位点的扩增产物，但是由于波尔山羊线粒体D-环区与其他山羊相比存在某些核苷酸差异，因此将引物设计在D-环区容易导致扩增反应无法有效地获得扩增产物。
一种优选方法是将二个引物分别设计线粒体D-环区上游的山羊细胞色素b基因(Capra hircus mito...[gi17298008])(Kraus F，Miyamoto M M.1990.Rapid cladogenesis among the pecoran ruminantsEvidence frommitochondrial DNA sequences.Syst.Zool.40117～130)和下游的12srRNA基因(Capra hircus Phe-...[gi337103])(Mannen H，Nagata Y，TsujiS.2001.Mitochondrial DNA reveal that domestic goat(Capra hircus)aregenetically affected by two subspecies of bezoar (Capraaegagurus).Biochem Genet.39(5-6)145～154)。由于细胞色素b基因和12srRNA基因在各种山羊中是高度保守的，因此分别基于这两个基因核苷酸序列的引物对可以有效地从各种山羊中扩增出含D-环区的扩增产物，并供随后的酶切分析使用。
此外，由于波尔羊特有的TaqI酶切位点位于SEQ ID NO9中第1930位，因此只要扩增产物含有该位点，即可用于鉴别波尔羊。当然，为了便于区分酶切产物，PCR扩增产物的长度宜为长度为400-2700bp，更佳地为600-1800bp。
在优选例中，本发明的波尔羊特异性遗传标记物的其起始核苷酸为SEQ IDNO9中第528-1900位中的一个核苷酸，终止核苷酸为起始核苷酸为SEQ ID NO9中第1940-3274中的一个核苷酸，且其长度为400-2700bp。
可用于本发明的扩增方法和条件没有特别限制，可以采用常规的扩增方法和条件。可采用一次PCR扩增，也可以采用多次PCR扩增(如巢式PCR)，以便进一步减少扩增产物的条带数，甚至只获得一种所需的扩增产物。
本发明所述的特异性扩增引物可通过常规的DNA合成方法合成而得(例如可以用商业化的DNA自动合成仪合成)。
用于本发明的DNA模板可用各种常规方法制备。优选的方法包括(1)取少量山羊耳部组织或血液。耳部组织按常规方法抽提总DNA(总DNA中含线粒体DNA)，并用TE溶解。
(b)血液加3-10倍体积的蒸馏水后，在沸水中处理10分钟，离心取上清为模板。
(c)先纯化动物线粒体，然后通过常规的基因组DNA提取方法提取纯化线粒体DNA。
本发明方法可鉴别各种波尔山羊，其中包括(但并不限于)南非、澳大利亚和新西兰的纯种波尔山羊。
可用本发明方法将其他各种非波尔山羊与波尔山羊区分开，这些山羊包括(但并不限于)徐淮山羊，萨能奶山羊，山东青山羊，大西羊，关中奶山羊，波本杂交羊。
本发明方法还可有效将其他各种杂交山羊与波尔山羊区分开，德系波尔山羊(高代杂交山羊)，和F1代或F2代波本杂交羊包括(但并不限于)F1代波本杂交羊，其父本为纯种波尔山羊，母本为徐淮山羊，萨能奶山羊，山东青山羊，大西羊，关中奶山羊，德系波尔山羊(高代杂交羊)；F2代杂交波尔山羊，其父本为纯种波尔山羊，母本为F1代波本杂交山羊。
本发明的主要优点在于
(a)提供了优良山羊品系纯种波尔山羊的一种分子特征遗传标记。
(b)利用这一分子特征遗传标记可方便准确地鉴定外性特征与波尔山羊相似的山羊是否为纯种波尔山羊。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1山羊细胞线粒体DNA制备可用以下三种方法分别制备山羊线粒体DNA方法1.
取少量山羊耳部组织或血液。耳部组织按常规方法抽提总DNA(总DNA中含线粒体DNA)，并用TE溶解。
方法2.
血液加3-10倍体积的蒸馏水后，在沸水中处理10分钟，离心取上清为模板。
方法3先纯化动物线粒体，然后通过常规的基因组DNA提取方法提取纯化线粒体DNA。
上述三种方法制备的DNA均可用于扩增反应。其中方法2最简便，但模板DNA质量稍差。方法3最烦琐，但模板DNA最纯。
实施例2山羊细胞线粒体D-loop区PCR扩增根据Genebank山羊细胞色素b基因(Capra hircus mito...[gi17298008])和12srRNA基因(Capra hircus Phe-...[gi337103])分别合成下列3对PCR引物进行三轮巢式PCR扩增。
序列(5’-3′)1.Goatmtb528 5′CCG ATT CTT CGC CTT CCA C 3′ (SEQ ID NO3)Goatmt12s783 5′GC CCA TTT CTT CCC ATT CCA3′ (SEQ ID NO4)2.Goatmtb570 5′AGC CCT CGC CAT AGT CCA CCT 3′ (SEQ ID NO5)Goatmt12s699 5′GGT TTG CTG AAG ATG GCG GTA 3′ (SEQ ID NO6)3.Goatmtb10205′ACA GCC AGT CGA ACA TCC CTA C 3′ (SEQ ID NO7)Goatmt12s142 5′TAC TCA CCG GGG CGT GGA TG3′ (SEQ ID NO8)注引物名称中的b528表示对应于细胞色素b基因第528位，12s783表示对应于12s rRNA基因的第783位，其余依此类推。
以下PCR扩增采用TAKARA公司LATaq酶进行扩增，其PCR扩增效果较使用普通Taq酶好第一轮PCR扩增10×LA缓冲液 3μl10mM dNTP1.2μlGoatmtb528 0.6μlGoatmt12s783 0.6μlLA Taq酶 0.3μl(TaKaRa公司)DH2O 23.3μl模板 1μl(总DNA含量100ng左右)反应条件94℃预热4min，94℃ 1min，68℃ 1min，72℃ 3min，进行10个循环，然后72℃延伸10min。
第二轮10×LA缓冲液3μl10mM dNTP 1.2μlGoatmtb570 0.6μlGoatmt12s6990.6μlLA Taq酶0.3μlDH2O 23.3μ1模板1μl(第一轮PCR产物)
反应条件94℃预热4min，94℃ 1min，68℃ 1min，72℃ 3min，进行10个循环，然后72℃延伸10min。
第三轮10×LA缓冲液 3μl10mM dNTP 1.2μlGoatmtb10200.6μlGoatmt12s143 0.6μlLA Taq酶 0.3μlDH2O 23.3μl模板 1μl(第二轮PCR产物)反应条件94℃预热4min，94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 2min，进行30个循环，然后72℃延伸10min。
取第3次PCR产物(1614bp)用于限制性内切酶酶切。
实施例3山羊细胞线粒体D-loop区PCR产物的限制性内切酶图谱采用TaKaRa公司的Taq I限制性内切酶，按厂家推荐反应条件进行，反应总体积20μl，直接取第三轮PCR产物消化2-3小时后加溴酚蓝加样缓冲液终止反应。并在2％的琼脂糖凝胶中电泳。
结果和分析纯种波尔羊的1614bp扩增产物(SEQ ID NO1)中除了在第10位和第1080位含有TaqI位点外，还在第911位含有额外的特异性酶切位点(图2A)，因此酶切后产生长度分别为10、170、533、901。
其他山羊的1614bp扩增产物(SEQ ID NO2)仅在第10位和第1080位含有TaqI位点(图2B)，因此酶切后产生长度分别为10、533、1071。因此，通过比较酶切图谱就可方便、快速、有效地鉴别纯种波尔羊。
鉴定结果如下表和图3-4所示。
酶切品种个体数 采集地 酶切片段大小位点数南非波尔山羊21 上海南汇3 10、170、533、901澳大利亚波尔山羊10 上海南汇3 10、170、533、901新西兰波尔山羊 5 山东3 10、170、533、901德国波尔山羊8 上海南汇2 10、533、1071关中奶山羊 5 上海南汇2 10、533、1071萨能奶山羊 5 上海南汇2 10、533、1071徐淮山羊10 江苏溧水2 10、533、1071大西羊 4 江苏溧水2 10、533、1071青山羊 7 山东2 10、533、10713 山东3 10、280、533、791F1代杂交波尔山羊35 江苏溧水2 10、533、1071F2代杂交波尔山羊5 江苏溧水2 10、533、1071出现10，170，533，901四个片段者为南非、澳大利亚、新西兰纯种波尔山羊线粒体，出现10，533，1071三个片段者为本地山羊、关中奶山羊、萨能奶山羊、徐淮山羊、大西羊、青山羊、F1代波本杂交山羊、F2代波本杂交山羊的线粒体。另外，有三只青山羊表现为三个酶切位点，形成10，280，533，791四个片段(图3和图4)。
实施例4山羊细胞线粒体D-loop区PCR扩增重复实施例2和3，不同点仅在于PCR扩增时用引物对1(SEQ ID NO3和4)和引物对3(SEQ ID NO7和8)进行二步巢式PCR扩增。
结果与实施例3相同，扩增后仍然得到1614bp的扩增产物，且用TaqI酶切后产生相同的可区别波尔羊和其他山羊的酶切图谱。
实施例5山羊细胞线粒体D-loop区PCR扩增重复实施例2和3，不同点仅在于PCR扩增时用引物对3(SEQ ID NO7和8)进行一步PCR扩增。
结果与实施例3相似，扩增后仍然得到1614bp的扩增产物(但有部分样品有一些杂带，但不影响检测)，且用TaqI酶切后产生相同的可区别波尔羊和其他山羊的酶切图谱。
实施例6.纯种波尔羊快速鉴定试剂盒为了有利于本方法的商品化，特制备方便使用的试剂盒，盒中含有下列试剂和材料1.引物对1、2、3(SEQ ID NO3，4，5，6，7和8)溶液(各20μmol/L)2.Taq酶或TAKARA LA Taq酶及PCR缓冲液3.TaqI及酶切缓冲液4.使用说明书(一份)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海杰隆生物工程股份有限公司<120>鉴定纯种波尔山羊的线粒体分子遗传特征标记和方法<130>031103<160>9<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1614<212>DNA<213>山羊(Capra hircus)<400>1acagccagtc gaacatccct acattattat tggacaacta gcatctatca tatatttcct 60catcattcta gtaataatac cagcagctag caccattgaa aacaaccttc taaaatgaag 120acaagtcttt gtagtacaat caatacactg gtcttgtaaa ccagaaaagg agaatagcca 180atctccctaa gactcaagga agaagccata gcctcactat cagcacccaa agctgaaatt 240ctatttaaac tattccctga accactatta accacatcta ttaatatacc cccaaaaata 300ttaagagcct ccccagtatt aaatttacta aaaatttcaa atatacaaca caaacttccc 360actccacaag cttacagaca tgccaacaac ccacacgtat aaaaacatcc caatcctaac 420ccaacttaga tacccacaca aacgccaaca ccacacaatg ttacgcgtat gcaagtacat 480tacaccgctc gcctacacac aaatacattt actaacatcc atataacgcg gacatacagc 540cttcatatag tttactatat atctacccta cacatgtgca gtactaatcc agcataaacg 600taatgtatgt acattacatt ttatgatcta cttcacgtgt acgtacataa tattaatgta 660acaaggacat aatatgtata tagtacatta aacgatcttc cacatgcata ttaagcacgt 720atatcagtat taatgtaata aagacataat atgtatatcg tacattaaac gatctccctc 780atgcatataa gcacgtacaa tgtccttatt agcagtacat ggtacatttt actgtatacc 840cgtacatagc acataaagtc aaatctatcc ttgtcaacat gcgtatcccg tccactagat 900cacgagcttg tcgaccatgc cgcgtgaaac cagcaacccg cttggcaggg atccctcttc 960
tcgctccggg cccattaacc gtgggggtag ctatttaatg aactttatca gacatctggt1020tctttcttca gggccatctc acctaaaatc gcccactctt tcctcttaaa taagacatct1080cgatggacta atgactaatc agcccatgct cacacataac tgtgctgtca tacatttggt1140attttttaat tttcggggat gcttggactc agctatggcc gtctgaggcc ccgacccgga1200gcataaattg tagctggact taactgcatc ttgagcatcc ccataatggt aggcatgggc1260attacagtta atggtcacag gacatactta ttatgttgca tttcaccatg cattcgctcc1320acctttcccc ccctccttct taaatatata ccaccgtttt aaacacgctc cctcctagat1380attagtgcaa aatttttcta cttccaatac tcaaatcttt actccagcca aggtaaatat1440ataaggtgcc tgggtctttt acatggtaag tggttgatgt agcttaaact taaagcaagg1500cactgaaaat gcctagatga gtgtaccaac tccataaaca cataggtttg gtcccagcct1560tcctgttaac tctcaacaga cttacacatg caagcatcca cgccccggtg agta 1614<210>2<211>1614<212>DNA<213>山羊(Capra hircus)<400>2acagccagtc gaacatccct acattattat tggacaacta gcatctatta tatatttcct60catcattcta gtaataatac cagcagctag caccattgaa aacaaccttc taaaatgaag120acaagtcttt gtagtacaat caatacactg gtcttgtaaa ccagaaaagg agaatagcca180atctccctaa gactcaagga agaagccata gcctcaccat cagcacccaa agctgaaatt240ctatttaaac tattccctga accactatta accacatcta ttaatatacc cccaaaaata300ttaagagcct ccccagtatt aaatttacta aaaatttcaa atatacaaca caaacttccc360actccacaag cctacagaca tgccaacaac ccacacgtat aaaaacatcc caatcctaac420ccaacttaga tacccacaca aacgccaaca ccacacaata ttacgtgtat gcaagtacat480tacaccgctc gcctacacac aaatacattt actaacatcc atataacgcg gacatacagc540cttcatatag tttactgtat atctacccta cacatatgca gtactaatcc agcataaacg600
taatgtatgt acattacatt ttatgatcta cttcatgtgt acgtacataa tattaatgta660acaaggacat agtatgtata tagtacatta aacgattttc cacatgcata ttaagcacgt720acatcagtat taatgtaata aggacatagt atgtatattg tacattaaac gatcttcctc780atgcatataa gcatgtataa tgcttctatc ggtagtacat agtacatctt actgcatatt840cgtacatggc acatagagtc aaatccattc ttgccaacat gcgtatcccg tccactagat900cacgagcttg ttgaccatgc cgcgtgaaac cagcaacccg cttggcaggg atccctcttc960tcgctccggg cccattaacc gtgggggtag ctatttaatg aactttatca gacatctggt1020tctttcttca gggccatctc acctaaaatc gcccactctt ccctcttaaa taagacatct1080cgatggacta atgactaatc agcccatgct cacacataac tgtgctgtca tacatttggt1140attttttaat tttcggggat gcttggactc agctatggcc gtctgaggcc ccgacccgga1200gcataaattg tagctggact taactgcatc ttgagcatcc ccataatggt aggcatgggc1260attgcggtta atggtcacag gacatattta ttatgttgca tttcatcatg catccgctcc1320acctttcccc ccctccttct tagatatata ccaccgtttt aaacacgctc cctcctagat1380attagtgcaa aatttttcta cttccaatac tcaaatcttt actccagcca aggtaaatat1440ataaggtgcc tgggtctttt acatggtaag tggttgatgt agcttaaact taaagcaagg1500cactgaaaat gcctagatga gtgtaccaac tccataaaca cataggtttg gtcccagcct1560tcctgttaac tctcaacaga cttacacatg caagcatcca cgccccggtg agta 1614<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(19)<223>引物<400>3ccgattcttc gccttccac 19
<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>引物<400>4accttaccct tctttacccg20<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(21)<223>引物<400>5agccctcgcc atagtccacc t 21<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(21)<223>引物<400>6atggcggtag aagtcgtttg g 21<210>7<211>22
<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(22)<223>引物<400>7acagccagtc gaacatccct ac 22<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>引物<400>8gtaggtgcgg ggccactcat20<210>9<211>5173<212>DNA<213>山羊(Capra hircus)<400>9atgaccaaca tccgaaagac ccacccatta ataaaaattg taaacaacgc atttattgac60ctcccaaccc catcaaacat ctcatcatga tgaaactttg gatccctcct aggaatttgc120ctaatcttac aaatcctgac aggcctattc ctagcaatac actatacatc cgacacaata180acagcatttt cctctgtaac tcacatttgt cgagatgtaa attatggctg aatcatccga240tacatacacg caaacggagc atcaatattc tttatctgcc tattcataca tatcggacga300ggtctatact atggatcata tacctttcta gaaacatgaa acattggagt aatcctcctg360ctcgcgacaa tggccacagc attcataggc tatgttttac catgaggaca aatatcattt420tgaggggcaa cagtcatcac taatcttctt tcagcaatcc catatattgg cacaaaccta480
gtcgaatgaa tctgaggggg attctcagta gacaaagcca ctctcacccg attcttcgcc540ttccacttta tcctcccatt catcatcaca gccctcgcca tagtccacct gcttttcctc600cacgaaacag gatcgaacaa ccccacagga attccatcag acgcagataa aatcccattt660cacccttact acaccattaa agatatctta ggcgccatgc tactaattct tgttctaata720ttactagtac tattcacacc cgacctactc ggagacccag acaactatat cccagcaaat780ccactcaata caccccctca cattaaacct gagtggtatt tcctatttgc atacgcaatc840ctacgatcaa ttcccaacaa actaggagga gtcctagccc tagtcctctc aatcctaatc900ttagtacttg tacccttcct ccacacatct aaacaacgaa gcataatatt ccgcccaatc960agccaatgca tattctgaat cctggtagca gatctattaa cactcacatg aattggagga1020cagccagtcg aacatcccta cattattatt ggacaactag catctatcat atatttcctc1080atcattctag taataatacc agcagctagc accattgaaa acaaccttct aaaatgaaga1140caagtctttg tagtacaatc aatacactgg tcttgtaaac cagaaaagga gaatagccaa1200tctccctaag actcaaggaa gaagccatag cctcactatc agcacccaaa gctgaaattc1260tatttaaact attccctgaa ccactattaa ccacatctat taatataccc ccaaaaatat1320taagagcctc cccagtatta aatttactaa aaatttcaaa tatacaacac aaacttccca1380ctccacaagc ttacagacat gccaacaacc cacacgtata aaaacatccc aatcctaacc1440caacttagat acccacacaa acgccaacac cacacaatgt tacgcgtatg caagtacatt1500acaccgctcg cctacacaca aatacattta ctaacatcca tataacgcgg acatacagcc1560ttcatatagt ttactatata tctaccctac acatgtgcag tactaatcca gcataaacgt1620aatgtatgta cattacattt tatgatctac ttcacgtgta cgtacataat attaatgtaa1680caaggacata atatgtatat agtacattaa acgatcttcc acatgcatat taagcacgta1740tatcagtatt aatgtaataa agacataata tgtatatcgt acattaaacg atctccctca1800tgcatataag cacgtacaat gtccttatta gcagtacatg gtacatttta ctgtataccc1860gtacatagca cataaagtca aatctatcct tgtcaacatg cgtatcccgt ccactagatc1920
acgagcttgt cgaccatgcc gcgtgaaacc agcaacccgc ttggcaggga tccctcttct 1980cgctccgggc ccattaaccg tgggggtagc tatttaatga actttatcag acatctggtt 2040ctttcttcag ggccatctca cctaaaatcg cccactcttt cctcttaaat aagacatctc 2100gatggactaa tgactaatca gcccatgctc acacataact gtgctgtcat acatttggta 2160ttttttaatt ttcggggatg cttggactca gctatggccg tctgaggccc cgacccggag 2220cataaattgt agctggactt aactgcatct tgagcatccc cataatggta ggcatgggca 2280ttacagttaa tggtcacagg acatacttat tatgttgcat ttcaccatgc attcgctcca 2340cctttccccc cctccttctt aaatatatac caccgtttta aacacgctcc ctcctagata 2400ttagtgcaaa atttttctac ttccaatact caaatcttta ctccagccaa ggtaaatata 2460taaggtgcct gggtctttta catggtaagt ggttgatgta gcttaaactt aaagcaaggc 2520actgaaaatg cctagatgag tgtaccaact ccataaacac ataggtttgg tcccagcctt 2580cctgttaact ctcaacagac ttacacatgc aagcatccac gccccggtga gtaacgccct 2640ccaaatcaat aagactaaga ggagcaggta tcaagcacac atctcgtagc ttacaacgcc 2700tcgcttaacc acacccctac gggagacagc agtgacaaaa attaagccat aaacgaaagt 2760ttgactaagc catgttgacc agggttggta aatctcgtgc cagccaccgc ggtcatacga 2820ttaacccaag ctaacaggaa tacggcgtaa aacgtgttaa agcactacat caaatagagt 2880taaattctaa ttaaactgta aaaagccata attacaacaa aaatagatga cgaaagtaac 2940cctactgcag ctgatacact atagctaaga cccaaactgg gattagatac cccactatgc 3000ttagccctaa acacaaataa ttacagaaac aaaattattc gccagagtac taccggcaac 3060agcccgaaac tcaaaggact tggcggtgct ttataccctt ctagaggagc ctgttctata 3120atcgataaac cccgataaac ctcaccaatc cttgctaata cagtctatat accgccatct 3180tcagcaaacc ctaaaaagga acaaaagtaa gctcaatcac aacacataaa gacgttaggt 3240caaggtgtaa cccatggaat gggaagaaat gggctacatt ttctacctta agaaaattaa 3300tacgaaagcc attatgaaat taatgaccaa aggaggattt agtagtaaac taagaataga 3360gtgcttagtt gaattaggcc atgaagcacg cacacaccgc ccgtcaccct cctcaagtaa 3420
atacaatgca ctcaagccta ttaacacgca tcaactacat gagaggagat aagtcgtaac 3480aaggtaagca tactggaaag tgtgcttgga taaatcaaga tatagcttaa ccaaagcacc 3540tagtttacac ctagaagatt tcacatatta tgaatatctt gaactatatc tagcccaatc 3600ccccccccca tctaaattac caaaacagtc taaaacaaaa catttacccc aattaaagta 3660taggagatag aaattttaaa tatggcgcta tagagaaagt accgtaaggg aatgatgaaa 3720gaaaaagaat taaagtacaa aaaagcaaag attaaccctt gtaccttttg cataatgaat 3780taacgagcaa aaaacttaac aaaacgaatt ttagctaagt aacccgaaac cagacgagct 3840actcatgggc agtttatcag aaccaactca tctatgtggc aaaatagtga gaagacccat 3900aagtagaggt gacatgccta acgagcctgg tgatagctgg ttgtccagaa aatgaatttt 3960agttcagctt taaagatacc aaaaatataa ataaatttta ctgtattttt aaaagttagt 4020ctaaaaaggt tcagcctttt agaaatggat acaaccttca ctagagagta agactttaca 4080acaccatagt aggcctaaaa gcagccatca attaagaaag cgttaaagct caacaataaa 4140aataaaatta atcccaacaa tagtacaact aactcctaga cctaatactg gaccactcta 4200ttattaaata gaagcaataa tgttaatatg agtaacaaga aatattttct ccctgcacaa 4260gtttaagtta gtatctgata atattctgac tgttaacagt aaataaaaac aacctaacga 4320taaataattt attaattata ctgttaaccc aacacaggag tgcacccagg aaagattaaa 4380agaagtaaaa ggaactcggc aaacacaaac cccgcctgtt taccaaaaac atcacctcca 4440gcatttccag tattggaggc actgcctgcc cagtgactaa acgttaaacg gccgcggtat 4500tctgaccgtg caaaggtagc ataatcattt gttctctaaa taaggacttg tatgaacggc 4560cacacgaggg ttttactgtc tcttacttcc aatcagtgaa attgacctcc ccgtgaagag 4620gcgggaatga attaacaaga cgagaagacc ctatggagct ttaactaact agtccaaaag 4680aaataaattt aaccaccaag ggataacaac atcctttatg gactagcagt tttggttggg 4740gtgacctcgg agaacaagag atcctccgag cgattttaaa gactagactt acaagtcaaa 4800tcaaattatc gcttattgat ccaaaaaact tgatcaacgg aacaagttac cctagggata 4860
acagcgcaat cctattcaag agtccatatc gacaataggg tttacgacct cgatgttgga 4920tcaggacatc ctgatggtgc aaccgctatc aaaggttcgt ttgttcaacg attaaagtcc 4980tacgtgatct gagttcagac cggagcaatc caggtcggtt tctatctgtt atgtatttct 5040cccagtacga aaggacaaga gaaataaggc caacttcaac aaagcgcctt aaaccaatta 5100atgaccctat ctcaattaat tttacaaaca aaacctgccc tagaaaaggg cctagttaag 5160gtggcagagc cgg 517权利要求
1.一种分离的检测纯种波尔山羊的遗传标记物，其特征在于，所述遗传标记物含有SEQ ID NO9中第1900-1940所示的线粒体D-环区序列，并且其起始核苷酸为SEQ ID NO9中第528-1900位中的一个核苷酸，终止核苷酸为起始核苷酸为SEQ ID NO9中第1940-3274中的一个核苷酸，长度为400-2700bp。
2.如权利要求1所述的遗传标记物，其特征在于，其序列如SEQ ID NO1所示。
3.一种PCR引物对，其特征在于，其长度为15-35个核苷酸，其中一个引物的序列与SEQ ID NO9中第528-1900位所示的序列相同，且另一个引物的序列与SEQ ID NO9中第1940-3274位所示的序列互补；或者其中一个引物的序列与SEQ ID NO9中第528-1900位所示的序列互补，且另一个引物的序列与SEQ ID NO9中第1940-3274位所示的序列相同；且所述引物对的扩增产物的长度为400-2700bp。
4.如权利要求3所述的引物，其特征在于，其长度为20-30个核苷酸。
5.如权利要求3所述的引物，其特征在于，引物选自SEQ ID NO3-8。
6.一种检测纯种波尔山羊的试剂盒，其特征在于，它含有(a)特异性扩增纯种波尔羊遗传标记物的引物对，所述的引物长度为15-35个核苷酸，其中一个引物的序列与SEQ ID NO9中第528-1900位所示的序列相同，且另一个引物的序列与SEQ ID NO9中第1940-3274位所示的序列互补；或者其中一个引物的序列与SEQ ID NO9中第528-1900位所示的序列互补，且另一个引物的序列与SEQ ID NO9中第1940-3274位所示的序列相同；并所述引物对的扩增产物的长度为400-2700bp；(b)TaqI酶。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对中的一个引物选自下组SEQ ID NO3、5、7；另一个引物选自下组SEQ ID NO4、6、8。
8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还具有阳性对照和阴性对照。
9.一种鉴定山羊是否是纯种波尔山羊的方法，其特征在于，它包括步骤(a)抽提山羊的DNA；(b)将抽提的DNA作为模板，用特异性扩增纯种波尔山羊遗传标记物的引物对进行PCR扩增，其中所述的引物长度为15-35个核苷酸，其中一个引物的序列与SEQ ID NO9中第528-1900位所示的序列相同，且另一个引物的序列与SEQID NO9中第1940-3274位所示的序列互补；或者其中一个引物的序列与SEQ ID NO9中第528-1900位所示的序列互补，且另一个引物的序列与SEQ ID NO9中第1940-3274位所示的序列相同；并且所述引物对的扩增产物的长度为400-2700bp；(c)对步骤(b)的扩增产物用TaqI进行酶切，酶切图谱与阳性对照相同就表明被鉴定的山羊是纯种波尔山羊。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述引物对中的一个引物选自下组SEQ ID NO3、5、7；另一个引物选自下组SEQ ID NO4、6、8。
全文摘要
本发明提供了鉴定纯种波尔山羊的遗传标记和方法。具体地，本发明提供了纯种波尔山羊线粒体DNA D环区的核苷酸序列，以及以该序列为基础设计的寡核苷酸引物。本发明证明了线粒体D－环区中额外的TaqI酶切位点是纯种波尔山羊特有的。本发明还提供了鉴定纯种波尔山羊的方法。利用本发明可方便、快速、准确地鉴定纯种波尔羊。
文档编号C12P19/00GK1566363SQ03141519
公开日2005年1月19日 申请日期2003年7月10日 优先权日2003年7月10日
发明者成国祥, 赵建阳, 彭进, 蔡引凤, 王述宇, 张锁林 申请人:上海杰隆生物工程股份有限公司