测定皮肤样本中mc1r变体和线粒体标记物的方法

专利名称：测定皮肤样本中mc1r变体和线粒体标记物的方法
技术领域：
本发明涉及用于预测、诊断和监测皮肤状态和皮肤疾病的方法。具体地，本发明涉 及将非创伤性(non-irwasive，非侵入性)皮肤采样技术与用于确定线粒体突变和黑皮素1 受体(MClR)变体的测定相结合的方法，以用作预测和监测疾病、光老化和紫外辐射(UVR) 损伤的综合性工具。所述方法还可用于评估治疗剂、皮肤护理产品和治疗方案的有效性以 及对它们的反应。
背景技术：
皮肤病是当今世界主要的医疗难题。随着美国每年诊断出超过一百万例的新增皮 肤癌病例(美国国家癌症研究所(National Cancerlnstitute) ,www, cancer, gov),皮肤病 的预测和诊断是其管理(management)的重要方面。目前的诊断方法主要依赖于目视观察 和组织活检。然而，依赖于目视观察的检测方法对皮肤状态或疾病的诊断未必有效，并且直 到有临床表现后才能检测到风险或疾病。此外，如组织活检的创伤性方法不仅会对测试的 受试者造成外伤，而且还提高了感染的机会。为了安全实施，这些方法还必须由医师进行， 并且通常不提供皮肤表面上的细胞富集样本，这些细胞通常是参与反应的细胞。因此，诊断和监测皮肤状态和疾病的非创伤性方法是用于患者管理，以及用于评 估现有和新型治疗剂、皮肤护理产品和皮肤护理方案的效力的重要工具。此外，这些方法可 以提供受试者皮肤状态潜在的特异遗传变化以及他们形成皮肤疾病的遗传倾向性的重要 信息。识别这些遗传变化就鉴别了潜在的药物靶标和预防性措施，并且在确定个人是否将 实际上对特定治疗剂、皮肤护理产品或方案产生反应可能是关键的。同样，检测和诊断方法 对于评估这样的疗法、产品和措施的安全性是重要的。紫外辐射(UVR)损伤未知或可量化性差的因素经常促成了由于紫外辐射(UVR)所造成的皮肤损伤。已 知因素包括皮肤颜色、UVR暴露频率和严重性、黑色素产生、真黑素与褐黑素的比率以及遮 光剂的使用等。行为因素在UVR对皮肤所造成损伤的严重性和水平中起很大作用，但是由 于它们依赖于自我报告的准确性并且经常依赖于对患者日光生活方式习惯的错误认识，因 此很难进行临床评估。定期使用遮光剂的多个个体不正确地使用，不能使用足够的量或不 能以推荐的间隔再次使用，从而产生了保护的错觉并可能导致增加对UVR的暴露。这些因素尤其需要可用的工具以密切监测建议用于防止皮肤UVR损伤的预防性 措施和疗法的成功性和适当性，其后果在从过早光老化到皮肤癌风险增加的范围内。在努 力全面评价个体皮肤状态的过程中，以及因此它们对光老化和皮肤癌的风险，向医疗工作 者提供尽可能多的见解以了解和交流他们患者的风险因素是至关重要的。因此，将期望评
4估个体对UVR损伤作用的遗传倾向性以及鉴别与个体特定日光生活方式习惯有关的风险 因素的诊断方法。这样的方法可以包括从个体皮肤的表皮层或真皮层采集DNA样本，用于定量指示 UVR损伤的线粒体生物标记物，以及黑皮素1受体(MClR)基因分型，以鉴别参与控制黑素 生成的变体。通过考虑患者对光老化或癌症的遗传倾向性以及患者经历紫外辐射暴露的结 果，两种测试的先后结合使用为医疗工作者提供了监测、建议和治疗患者的综合性工具。与UVR有关的线粒体缺失人皮肤组织是高度复杂的并包含多种细胞类型。因此，鉴别人皮肤细胞的生物标 记物是特别重要的。为了确定人皮肤中累积性UVR暴露的可靠标记物，本发明人等考察了 使用线粒体DNA (mtDNA)而不是核DNA作为UV诱导的DNA损伤的生物标记物的新设想(Pang et al.,1994 ；Berneburg et al.,1997 ；Birch-Machin et al.,1998 ；Birch-Machin, 2000)。使用mtDNA损伤作为人皮肤中累积性日光暴露的生物标记物是相对较新的研究 领域，而先前的工作简单地比较了 mtDNA损伤以区别日光保护的和日光暴露的皮肤(Pang et al.，1994 ；Berneburg et al.，1997 ；Birch-Machin et al. ,1998)。由于非黑素瘤皮肤 癌(NMSC)主要在“经常”暴露于户外日光的身体部位(与“偶尔”暴露于日光的部位相对) 形成，因此这种方法受到了限制(Armstrong，2004)。在本申请人共同未决的具有公开号W0/06/111029的PCT申请中(其内容并入本 文作为参考)，将人线粒体DNA(mtDNA)中的3895bp缺失鉴别为UV诱导的DNA损伤的生物 标记物。这种缺失在跨核苷酸547-4443的次要弧(minor arc)中鉴别到了。先前这种缺失 与基-塞二氏综合征(Kearns Sayre Syndrome)以及慢性进行性眼外肌麻痹相关(Moraes et al. , 1995)。PCT公开No. W0/06/111029中的实施例表明，3895bp mtDNA缺失的出现频率在“经 常”和“偶尔”暴露于日光的身体部位之间显著不同。另外，这些实施例通过反复使用亚致 死剂量的UVA+UVB光源诱导体外3895bp缺失，证实了 3895bp缺失的病因学和日光的UVR 构成部分之间的关联。重要地，未针对W0/06/111029中所分析的皮肤样本评估个体对日光损伤的遗传 倾向性和皮肤癌风险。另外，这些样本是通过本领域先前已知的疼痛性皮肤采集方法获得 的。黑皮素1受体(MClR)基因分型黑皮素-1受体基因(MClR)编码对黑色素合成至关重要的膜结合受体蛋白。MClR 的编码区为高度多态的，并且已经报道了变体与毛色表型和黑素瘤以及非黑素瘤皮肤癌 风险之间的关联(Rees, Pigment Cell Research, Vol. 13(3), 135-140 (6), June 2000 ； Kanetsky etal. Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention Vol. 13,808-819, May 2004)。在皮肤白皙、对日光敏感的个体中黑素瘤发病率最高，表明通过增加黑色素合成对 UV暴露产生反应的能力是黑素瘤防御中的重要因素。家族研究已表明，白皙皮肤和红色毛 发的个体在两种MClR等位基因中存在功能性显著变化。对于红色毛发和白皙皮肤来说， 等位基因D84E、R142H、R151C、R160H和D294H具有高外显率。两种外显率较低的等位基因 (V60L和V92M)也是黑素瘤风险中的常见因素。
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因此，MC1R是日光敏感性和皮肤癌遗传风险因素的主要决定因素。评估黑皮素1 受体(MC1R)基因的DNA或氨基酸序列以鉴别是否存在与日光敏感性、对DNA损伤的易感性 增加和皮肤癌风险提高有关的某些变体为鉴别具有更高风险并且需要更主动的监测和治 疗措施的患者提供了有价值的工具。只评价与日光敏感性有关的表型特征不能说明这种风 险提尚。皮肤采样目前在疾病(如癌症)诊断或鉴定中使用的皮肤样本采集方法包括创伤性或疼痛 性方法，它们可以导致测试个体非常不适。目前皮肤样本采集方法的实例包括钻孔活检、胶 带提取(tapelift)和外科手术切除。除了目前皮肤采集方法所造成的不适外，为了安全实 施，这些方法还必须由医师进行。这样的创伤性技术具有其他缺点，包括感染的风险、样本采集的不便和所采集样 本丢失或误鉴别的可能。在需要频繁或定期采样的情况下，将会放大感染和不便，如在UVR 暴露监测方案和长期疗法评估中。而且，与这些创伤性试验方法有关的时间和成本使其难 以对大规模人群进行快速基因分型和DNA损伤评估。因此，期望提供非创伤性或微创性皮 肤采样方法，其可以在家庭、临床或美容环境中方便、快速地实施。出于使申请人认为已知的信息与本发明具有可能相关性的目的，提供了该背景资 料。不允许将任何之前的信息用于或视为构成针对本发明的现有技术。

发明内容
本发明的一个目的是提供用于测定皮肤样本中MC1R变体和线粒体标记物的方 法。根据本发明的一个方面，提供了一种用于确定受试者的皮肤状态和对UVR损伤的遗传 倾向性的诊断方法，其包括(a)从受试者采集组织样本；(b)测定第一组织样本的线粒体DNA(mtDNA)变异；(c)测定第二组织样本的一种或多种黑皮素1受体(MC1R)变体；和(d)根据对皮肤样本中mtDNA变异和MC1R变体的检测，确定受试者的皮肤状态和 对UVR损伤的遗传倾向性。根据本发明的另一方面，提供了本发明方法在预测光老化、UVR损伤或皮肤病的应用。根据本发明的另一方面，提供了本发明方法在确定用于防止或改善光老化、UVR损 伤或皮肤癌的预防性或治疗性处理的应用。根据本发明的另一方面，提供了一种用于监测光老化、UVR损伤或皮肤病的非创伤 性方法，其包括(a)使用非创伤性皮肤采样技术从受试者采集皮肤样本；(b)在规定的一段时间内，以固定的时间间隔测定皮肤样本的线粒体DNA (mtDNA) 变异；和(c)确定在规定的一段时间内所鉴别的mtDNA变异中的任何变化。根据本发明的另一方面，提供了一种用于监测受试者对光老化、UVR损伤或皮肤病 的预防性和治疗性处理的反应的方法，其包括
(a)从受试者采集第一皮肤样本；(b)测定该第一皮肤样本的线粒体DNA(mtDNA)变异；(c)测定该第一皮肤样本的一种或多种黑皮素1受体(MC1R)变体；(d)根据该第一皮肤样本中的mtDNA变异和MC1R变体的检测，确定受试者的皮肤 状态和对UVR损伤的遗传倾向性；(e)提供对于光老化、UVR损伤或皮肤病的预防性或治疗性处理；(f)从受试者采集第二皮肤样本；(g)测定该第二皮肤样本的线粒体DNA (mtDNA)变异；(h)在规定的一段时间内，以固定的时间间隔重复步骤(f)和(g)；和(i)比较第一皮肤样本和以固定的时间间隔获取的皮肤样本之间的mtDNA变异水 平，以检测mtDNA变异的变化，从而监测该处理的有效性；以及(j)可选地，根据受试者的遗传倾向性和在mtDNA变异中所检测的变化而调整该处理。根据本发明的另一方面，提供了一种筛选用于治疗光老化、UVR损伤或皮肤病的有 效治疗剂或药妆剂的方法，其包括(a)从受试者采集第一皮肤样本；(b)测定该第一皮肤样本的线粒体DNA (mtDNA)变异；(c)用该治疗剂或药妆剂治疗受试者；(d)在规定的一段时间后，从受试者采集第二皮肤样本；(e)测定该第二皮肤样本的线粒体DNA (mtDNA)变异；和(f)比较该第一皮肤样本和该第二皮肤样本相对于对照的mtDNA变异水平以确定 该治疗剂或药妆剂的有效性。根据本发明的另一方面，提供一种确定受试者光损伤水平的方法，其包括(a)从受试者采集皮肤样本；(b)测定该皮肤样本的线粒体DNA (mtDNA)缺失；(c)将该皮肤样本的mtDNA缺失水平与根据同龄人所划分的一组mtDNA缺失相比 较，并为该受试者评定光老化；和(d)通过比较受试者的实足年龄和所评定的光老化以确定该受试者的光损伤水平。根据本发明的另一方面，提供了一种用于确定受试者对UVR损伤的皮肤状态和遗 传倾向性的诊断试剂盒，其包括(a)用于采集组织样本的材料；和(b)用于实施MC1R基因分型和mtDNA变异检测的适合引物、探针和试剂。


在以下参考所附附图的详细说明中，本发明的这些和其他特征将变得更加清楚。图1示出了与使用本发明方法采自鼻和脚跟的皮肤样本中的3895bp mtDNA缺失 水平有关的实时PCR数据。图2示出了与使用本发明方法采自各个身体部位的皮肤细胞中的3895bp mtDNA缺失水平有关的实时PCR数据。图3示出了与使用本发明方法采自各个身体部位的皮肤细胞中的3895bp mtDNA 缺失水平有关的实时PCR数据。图4是显示在通过各种非创伤性皮肤采集方法所采集的样本中的扩增产物的存 在的凝胶。图5是显示在通过各种非创伤性皮肤采集方法所采集的样本中的扩增产物的存 在的凝胶。图6至11显示了对所测试受试者的等位基因变体进行基因分型的结果。图12显示了提供测试R160H等位基因变体的测定结果的凝胶。图13显示了划分为同龄人的人群的3895bp mtDNA缺失水平。
具体实施例方式本发明提供了预测、诊断和监测皮肤状态和皮肤疾病的方法。这些方法包括将非 创伤性皮肤采样技术与确定线粒体突变和黑皮素1受体(MC1R)变体的测定相联合。在这 点上，这些方法提供了用于评估遗传倾向性和与疾病、老化和紫外辐射(UVR)损伤有关的 风险因素的综合工具。这些方法还使得能够评估患者对治疗剂、皮肤护理产品和治疗方案 的反应。定义除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域技 术人员通常理解的含义相同。如本文所用的，术语“约”指与所说明的数值有近士 10%变化范围。应理解无论是 否明确指出，这样的变化范围始终包含于本文所提供的任何给定数值中。如本文所用的，“等位基因”是指占据染色体上特定位置的给定DNA序列的若干种 可替代形式。如本文所使用的，“循环阈值”(CT)是核酸序列的靶扩增升高至背景之上的点，其 是通过如荧光信号的信号进行指示的。CT与所研究序列的量负相关。如本文所用的，“诊断”是指使用存在或不存在突变或突变组合作为疾病诊断或管 理中的因素。突变的检测可以是疾病诊断中的步骤。如本文所用的，“缺失”是指从核酸的连续序列中去除DNA或mtDNA的一个区域。 缺失的大小可以在一个碱基至数千个碱基或更大的范围。如本文所用的，“线粒体DNA”或“mtDNA”为存在于线粒体中的DNA。如本文所用的，“突变”涵盖了来自野生型序列的核酸或线粒体DNA中的任何修 饰或变化，包括但不限于点突变、转换、插入、颠换、易位、缺失、倒转、重复、重组或它们的组 合。序列的修饰或变化可以从单个碱基的变化扩展到整个DNA片段的加入或消除。术语“样本”指来源于受试者皮肤的任何制备物。例如，使用本文所述的非创伤性 方法获得的细胞样本可以分离多核苷酸、多肽或线粒体DNA以用于本发明的方法。用于本 发明的样本通常取自皮肤的真皮或表皮。优选地，使用本文所讨论的非创伤性或微创性皮 肤采样方法从皮肤表面获取该样本。术语“皮肤”指身体的外部保护性覆盖物，由真皮和表皮组成，并应理解为包括汗腺和皮脂腺以及毛囊结构。在一个实施方式中，该皮肤为哺乳动物皮肤，优选人类。如本文所用的，术语“皮肤状态”指相对于由于日光暴露、晒黑床(tanning bed)或 UVR相关疾病等累积的UVR损伤量而言的皮肤状况。如本文中互换使用的，术语“疗法”和“治疗(或处理)”指意在改善受试者状况而 进行的干预。改善可以是主观的或客观的并且涉及改善皮肤疾病、病症或状态相关的症状、 防止其发展或改变其病理学。因此，以最广泛的含义使用术语疗法和治疗(或处理)，并包 括疾病、病症或状态在各个阶段的防止(预防)、缓和、减轻和治愈。该术语还涵盖了防止受 试者状况恶化。因此，需要疗法/治疗的受试者包括那些已经患有疾病、病症或状态的人以 及那些有患该疾病、病症或状态倾向或有发展该疾病、病症或状态风险的人以及那些要防 止该疾病、病症或状态的人。用于确定皮肤状态和评估对皮肤疾病的遗传倾向性的测定本发明的方法包括将非创伤性皮肤采样技术与在鉴别个体对皮肤疾病的遗传倾 向性以及与UVR暴露有关的风险因素中有效的测定相联合。这些测定可以单独进行或与另 一个结合进行。这些测定的结合使用提供了同时评估遗传风险因素和日光生活方式习惯的 独特能力，从而为医护人员提供了用于更好地监测、建议和治疗易患或患有光老化、UVR损 伤或皮肤病的患者的诊断工具。用于检测线粒体突变的测定线粒体DNA (mtDNA)动力学是一种重要的诊断工具。mtDNA中的突变经常是疾病发 展的初始指示，并可以用作指示与疾病发作有关的风险因素的生物标记物。同样，由于与核 DNA相比，单位细胞的线粒体DNA的拷贝数更高，因此它是依赖于极微量核酸的测定的更可 靠的靶标。因此，本发明的方法将用于采集皮肤样本的非创伤性技术与用于检测人线粒体 基因组中突变的测定相联合。如本文所讨论的，测量皮肤样本中线粒体DNA变异水平可以鉴别相对于累积性日 光暴露和UVR损伤而言的患者皮肤状态。此外，以固定的时间间隔(如每两周或每月)测 量mtDNA，可以为医护人员提供用于比较治疗推荐的实时、定量监测工具，以便确定它们在 防止由UVR造成的皮肤损伤中的有效性。因此，本发明提供了一种用于确定相对于累积性UVR损伤而言的患者皮肤状态的 方法，其包括将非创伤性皮肤采集技术与检测线粒体变异的测定相结合。根据本发明的一 个实施方式，线粒体突变选自由缺失、取代和插入组成的组。根据本发明的另一个实施方 式，突变为mtDNA缺失。根据本发明的另一个实施方式，突变是PCT申请no. W0/06/111029 中所鉴别的3895bp mtDNA缺失。根据本发明的另一个实施方式，突变是如SEQ ID N0:1中 所示的3895bp缺失。根据本发明的另一个实施方式，mtDNA突变对应于如SEQ IDN0 2中 所示的序列。实施例部分提供了非创伤性采集皮肤样本和测定线粒体突变的示例性方法。使用 任何适当的已知方法，可以从样本中提取mtDNA。提取mtDNA后，对线粒体基因组的全部或 一个区域进行扩增，并且可以包括对线粒体基因组测序，如在本领域已知的和，例如在“现 iV^^^^^^t^^ (Current Protocols in Molecular Biology) "(Ausubel et al., John Wiley & Sons，New York, 2007)中所描述的。同样地，可以从本领域技术人员所知的 适用方法中选择用于检测mtDNA中突变的存在的方法。例如，分析mtDNA可包括mtDNA测
9序、用PCR扩增mtDNA、DNA印迹、RNA印迹、蛋白质印迹，DNA-蛋白质印迹杂交、变性高效液 体色谱、杂交至微阵列、生物芯片或基因芯片、分子标记物分析、生物传感器、熔融温度分布 曲线或上述任何的组合。可以使用任何合适的方法对线粒体DNA测序。优选地，在测序前通过PCR扩增 mtDNA。在本领域中，PCR的方法是熟知的并且可以如Mullis and Faloona，1987，Methods Enzymol. , 155 335中所述进行。可以直接对PCR产物测序或将其克隆至载体中，然后再将 该载体置于细菌宿主中。DNA测序方法的实例在R. L. Jr and Smith，L. M.，1991，Rapid DNA sequencing by horizontal ultrathin gelelectrophoresis, Nucleic Acids Res. 19 4121—4126 禾口 Luckey，J.A.，et al, 1993, high speed DNA sequencing by capillary gel eletrophoresis, Methods Enzymol. 218 :154_172 中找至lj。在 Hopgood, R. , et al, 1992, Strategies for automated sequencing of human mtDNA directly fromPCR products, Biotechniques 13 :82_92 禾口 Tanaka, M. et al,1996, Automated sequencing of mtDNA, Methods Enzymol. 264 :407_421 中描述了 PCR 和 mtDNA 测序的结合使用。黑皮素1受体(MC1R)基因分型黑皮素1受体是黑素生成中的关键控制点并决定了皮肤中色素累积的量。假定皮 肤色素决定了个体对致癌UVR的天然保护的程度，则MC1R基因分型可以确定对由UVR暴 露所引起的DNA损伤的易感性并评估与皮肤癌相关的风险因素。这样，评价黑皮素1受体 (MC1R)基因的DNA或氨基酸序列以鉴别某些变体是否与日光敏感性和UVR损伤易感性提高 有关，这为确定患病风险更大并且需要更主动的监测和治疗措施的个体提供了有价值的工 具。本发明方法将非创伤性皮肤采集技术与用于MC1R基因分型的测定相联合。从 皮肤样本中提取的DNA或RNA可以用于鉴别一种或多种MC1R变体等位基因。例如，可以 同时测试与黑素瘤风险增加有关的七种等位基因变体D84E、R142H、R151C、R160H、D294H、 V60L和V92M。可替换地，对最常见的与皮肤癌风险增加有关的五种等位基因变体，即D84E、 R151C、D294H、V60L和V92M进行MC1R基因分型。在SEQ ID NO :3中示出了包含变体的MC1R 基因。另外,在SEQ ID N0:4中示出了 MC1R RNA序列。因此，本发明提供了一种用于确定个体对皮肤损伤或癌症的遗传倾向性的方法， 包括将非创伤性皮肤采集技术与用于鉴别皮肤样本中一种或多种MC1R变体存在的测定相 结合。根据本发明的一个实施方式，测试的MC1R变体选自由等位基因变体D84E、R142H、 R151C、R160H、D294H、V60L和V92M组成的组。根据本发明的另一个实施方式，测试的MC1R 变体选自由D84E、R151C、D294H、V60L和V92M组成的组。实施例部分提供了用于非创伤性采集皮肤样本和进行MC1R基因分型的示例性方 法。本领域的技术人员将理解，与mtDNA突变检测不同，其由于UVR暴露方式不同而可能导 致个体一生中发生波动，MC1R基因分型的结果在个体一生中不会变化。因此，如果需要，在 患者一生中可以仅对MC1R测试一次。由于MC1R基因的序列是遗传的并且在人的一生中不会变化，因此无论哪一身体 组织为样本，基因分型测定如用于评价MC1R变体的那些均将在个体中产生相同的结果。本 领域技术人员将承认尽管可以通过对皮肤进行非创伤性采集方法获得样本，但也可以从任 何其他身体组织采集样本以获得相同基因型。采集用于本发明方法的适合组织在本领域中
10是广泛了解的并且可以包括这些非限制性实例，如口腔组织、肌肉组织、神经组织等。相同 情况对于线粒体测定是不正确的，它是组织特异的体细胞突变。因此，根据本发明的一个实 施方式，提供了一种包括从受试者采集组织样本的方法，其中所述组织样本为不同于皮肤 样本的样本。根据本发明的另一个实施方式，提供了一种从受试者采集组织的方法，其中所 述组织为口腔样本。可以使用任何适合的已知方法从样本中提取DNA或RNA。可以使用如ABI’s a qPCR Taqman SNP基因分型测定的本领域所承认的技术来确定特异等位基因的检测(https:// products, appliedbiosystems. com/ab/en/US/direct/)。同样地，制备自定义引物和探针 的方法在本领域中是熟知的(见，例如，Ausubel等人编著的“现代分子生物学实验技术 (Current Protocols inMolecular Biology) ”，John Wiley & Sons，Inc.，NY)。可替换地，可以根据对MC1R基因的氨基酸序列的评价来评估等位基因变体。用于 进行氨基酸分析的技术在本领域中是熟知的并且可以包括，例如，高效液相色谱法(HPLC)。确定皮肤类型和皮肤癌的风险本发明所述方法不但可以用于评估个体中等位基因变体的存在，而且还可以用于 确定皮肤类型，即个体的菲茨帕特里克皮肤光型(Fitzpatrick phototype)的近似结果。 在这方面，MC1R基因分型的结果还可以将个体分成以相关的癌症风险为特征的特定皮肤类型。将这些皮肤类型定义如下皮肤类型1的特征在于个体具有与皮肤癌风险最相关的四种等位基因变体中的 两种或更多种。皮肤类型2的特征在于个体具有与皮肤癌风险最相关的四种等位基因变体中的一种。皮肤类型3或更高的类型的特征在于个体不具有与皮肤癌风险最相关的四种等 位基因变体。因此，根据一个实施方式，提供了一种基于MC1R基因分型而鉴别个体皮肤类型和 皮肤癌风险因素的方法。采集皮肤组织的非创伤性方法本发明为基因分型或诊断测试提供采集皮肤样本的非创伤性或微创性技术。 在本发明上下文中，“微创性”是指导致穿透一层或多层皮肤但抽少量血或不抽血的那 些技术。用于采集皮肤样本的非创伤性或微创性技术的非限制性实例包括，但不限于， 使用手术胶带的胶带提取、用8%扁桃酸湿润的无菌拭子、用蒸馏水湿润的无菌拭子、 蜡条、棉签、使用无菌外科手术刀刮下的皮肤碎屑、使用木制刮刀刮下皮肤碎屑、胶粘垫 (CapSure Clean-up Pad, Arcturus)的粘性表面、LCM MacroCap (Arcturus)的薄膜、 LCM MacroCap (Arcturus)的加热膜和使用小号针(例如，28号)以采集皮肤组织的微芯 (micro-core)0样本可以采集自皮肤的真皮层或表皮层，并且可以来源于如下的身体部位，例如， 脚跟、鼻、内臂、耳、口、头皮、胸部、肩部、臀部、背部、面部、颈背、手和/或头部。样本可以如 从来源所获得的一样直接使用，或者经过预处理改变样品性质后使用。因此，皮肤样本可以 在使用前进行预处理，例如，用防腐剂、试剂等进行预处理。
本领域技术人员将理解一次可以使用多于一种的采样技术。此外，在需要采集过 程的情况下，例如，随时间监测皮肤状态时，在测试期间可以单独或共同使用相同或不同的 技术。在这点上，可以仅进行一次皮肤采集，或以固定的时间间隔采取，如每两周或每月。技术人员还将理解，某些采集方法产生极低水平的核酸(约0. lng)，其不能用于 靶向核DNA的测定；然而，丰度大很多的线粒体DNA靶标(约大1000倍)将特别适合于这 样极低收率的采集方法。以下实施例表明通过本发明的非创伤性方法采集的皮肤细胞，提 供了与通过先前使用的皮肤采集方法所获得的mtDNA相当的足够多的mtDNA。参考本发明的具体方法，在一个实施方式中，提供了一种非创伤性采集技术，其包 括无菌拭子的使用，如采集口腔细胞时使用的那些或棉签拭子。从其包装取出无菌拭子并 用其摩擦所感兴趣的皮肤部位。优选地，为了确保采集到足够数量的皮肤细胞以用于基因 分型或诊断目的，对所述部位摩擦约15次。尽管下文参考具体实施例描述了本发明，但是 所述方法还可以用于采集皮肤样本以用于诊断或鉴定疾病、老化或紫外辐射暴露以及鉴别 与此相关的突变。擦拭皮肤后，将拭子放入无菌管。为了维持其中所含的遗传材料(即DNA)的完整 性，可以根据需要向该管中加入缓冲液。然后，利用本领域熟知的方法提取DNA。在本发明的另一个实施方式中，将使用极小号针(28或29号)的微创性技术用于 采集用于遗传研究目的的皮肤细胞。在该实施方式中，通过刺穿皮肤的帐篷状层(tented layer)从受试者的真皮和表皮中采集皮肤细胞从而使得只抽取少量的血或不抽血，但是微 量的真皮和表皮组织粘附在针的内芯中。可以使用，例如，手指、镊子或其他类型的夹子使 皮肤升高而形成帐篷状。该皮肤材料包含在针内直到将其提取出用于进一步处理(即DNA 提取)。为了将该皮肤样本从针中压出，将磷酸盐缓冲盐水加入到针的柱管内，然后用活塞 迫使其进入无菌管。利用本领域熟知的方法提取DNA。如以下实施例所举例说明的，用于采 集皮肤样本的这种微创性方法得到了足够用于评估DNA或mtDNA损伤(例如，由紫外辐射 所引起的)的DNA或mtDNA。如上述的实施方式，这一获得皮肤样本的方法是安全的并且无 痛的。而且，如以下所举例说明的，允许采集足够的DNA或mtDNA用于进行精确测定。诊断和监测皮肤状态以及检测与疾病有关的遗传风险因素如本文所述的，本发明的测定可以单独使用以(例如)评估皮肤状态或遗传风险， 或结合使用，以评估对皮肤病的遗传倾向性和鉴别与个体特定生活方式有关的风险因素。 如以下所讨论的，对这些因素的鉴别和监测在确定针对UVR损伤、光老化和皮肤病的有效 预防性和治疗性措施中是至关重要的。诊断和监测皮肤状态定期使用如遮光剂和防晒霜的皮肤护理产品的多个个体不正确地使用这些产品， 不能使用足够的量或以推荐的时间间隔再次使用，产生了保护的错觉，从而导致对UVR暴 露的增加。此外，直到最近，个体在日光暴露期间定期使用的遮光剂和防晒霜通常防护UVB 的诱变作用，但没有包含针对UVA辐射有害作用的试剂。这些因素尤其需要可用的工具以确定相对于UVR损伤的初始皮肤状态，并通过研 究过程而监测被建议用于防止对皮肤造成进一步UVR损伤的预防性措施和疗法的成功性 和适当性。以如每两周或每月的规则时间间隔(或任何其他合适的时间间隔)，通过非创伤 性皮肤样本采集，测量患者皮肤中线粒体DNA缺失的水平可以为医护人员提供实时、定量
12的监测工具，以比较治疗建议，从而确定它们在防止由UVR所引起的皮肤损伤中的有效性。 这种采集方法允许在没有任何副作用或不适的情况下定期采样，并且如果期望，可以在家 进行。出乎意料地，由于通过擦拭所提供的极低收率的DNA足够进行这样的分析，因此皮肤 样本采集技术如擦拭特别适合于mtDNA突变的检测。现在介绍实施例，在本发明的一个实施方式中，所述方法用于采集皮肤细胞，以定 量与紫外辐射所引起的损伤有关的生物标记物(见实施例1)。具体地，本发明的方法用于 采集皮肤样本以测试人线粒体基因组中的缺失，即如上所述的3895bp mtDNA缺失。该实施 例表明通过本发明的非创伤性方法所采集的皮肤细胞提供了与通过先前皮肤采集方法所 获得的mtDNA相当的用于获得结果的足够mtDNA。本领域普通技术人员将理解，来自人皮肤的表皮层或真皮层的用于定量线粒体 DNA靶标的DNA样本的非创伤性采集，为医护工作者提供了以防止这一后果(如光老化和皮 肤癌)为目的而监测防止UVR相关皮肤和DNA损伤的治疗方案和生活方式建议的有效性的 措施。普通技术人员还将理解，医护工作者在鉴别不良日光习惯或无效保护方法中使用 的mtDNA分析的效用。这种效用在实施例6中被证实，其中根据本发明的一个实施方式，对 两位年龄和肤色相似的个体分析了遮光剂使用的结果，以评估日光保护方案的有效性。光老化的确定利用微创性采样程序结合线粒体标记物的鉴别的本发明的其他诊断方法是光老 化的确定。如实施例部分所述的，这种方法的目的在于通过使用微创性皮肤采集技术在个 体面部或头部的皮肤组织上取样并测量与UVR损伤有关的线粒体靶标(如mtDNA缺失)的 量来评价个体的UVR暴露。然后，将这个结果与通过相同方法所得到的结果的数据库进行 比较并基于检测的mtDNA缺失水平将个体划分成同龄组。为了评定光老化，将个体mtDNA 分析的结果与他们的实足年龄进行比较，以确定他们与同龄组中其他个体相比是否具有更 高或更低的光致损伤。因此，通过利用微创性技术采集用于线粒体DNA标记物分析的皮肤组织微芯，医 疗工作者可以鉴别个体的光老化并确定他们的光老化是否与其实足年龄一致或不一致。光 老化确定由此为医护人员提供了更适当地制定抵抗光老化、UVR损伤或皮肤病的预防性和 治疗性措施的方法。确定对疾病的遗传倾向性为了全面评价个体的光老化风险和他们对皮肤癌的风险，需要为医疗工作者提供 尽可能多的信息以使他们了解并交流其患者的风险因素。MC1R基因分型的使用不但有助于 个体对由UVR暴露所引起的DNA损伤的易感性和发展皮肤癌的风险，它还提供了有价值的 工具以鉴别具有更大风险并且可能需要更主动的监测和治疗措施的患者。因此，本发明提供了采集用于MC1R基因分型的DNA样本的非创伤性方法。根据本 发明的一个实施方式，从通过本发明方法采集的细胞中所提取的DNA可以用于鉴别与黑素 瘤风险升高有关的一种或多种等位基因变体。所述方法可用来评估个体中这些变体的存在 并且可以用于另外确定所述个体的皮肤类型。因此，MC1R基因分型的结果使得可以将个体 分成以相关癌症风险为特征的特定皮肤类型。结合分析(coupled analysis)
通过考虑遗传倾向性和他们阳光生活方式习惯的最终结果，MClR基因分型和 mtDNA分析的结合使用为医疗工作者提供了监测、建议并且更好地治疗患者的工具。多种测 定的这一结合使用提供了同时评估风险因素和后果的独特能力。重要地，可以暂时将MClR 测试从用于mtDNA测试的非创伤性采集的重复测试中去除，但仍然结合地使用。正如以上 所讨论的，由于从MClR测试中获得的信息将在个体一生中都不会变化而通过测量线粒体 DNA缺失所阐明的DNA损伤水平将根据UVR暴露类型而波动，因此这是可能的。值得注意的是这样的事实，即由UVR所引起的皮肤损伤是多因素过程。因此，不 能假设具有MClR变体的个体的损伤将始终比不具有该变体的个体高，也不能假设报告定 期使用遮光剂的个体的损伤将一定比报告不使用遮光剂的个体低。因此，MClR基因分型与 mtDNA分析的结合为医疗工作者提供了向他们所护理的那些患者提供更知情的建议所需的 独特见解。治疗剂和皮肤护理产品的评价出于医学和美容的目的，本发明方法也可用于广泛的皮肤筛选。本发明方法可以 用于基因分型和/或测量与皮肤癌(非黑素瘤皮肤癌和黑素瘤)有关的各种生物标记物。 在任何时间点和从任何外部解剖位置，评估个体皮肤中由于紫外辐射所造成的DNA损伤水 平的能力为皮肤健康的独特和信息性筛选试验以及对现有和新型治疗剂、皮肤护理产品和 皮肤护理方案的安全性和效力的评估提供了基础。此外，通过鉴别受试者皮肤病或状态的 潜在特异遗传变化，可以容易地确定患者是否将对特定治疗剂、皮肤护理产品或方案产生 反应以及其反应的程度。试剂盒根据所期望的应用，可以将本发明方法中所用的采集材料包装成消费试剂盒或在 临床环境中使用的医疗试剂盒。这样的试剂盒不仅可以包括一种或多种采样装置，如无菌 拭子、棉签拭子或针，而且还可以包括用于基因分型和/或鉴别mtDNA突变所必需的其他材 料。试剂盒可以可选地包括进行诊断测定所需的试剂，如缓冲液、盐、检测试剂等。其 他组分如用于分离和/或处理测试样品的缓冲液和溶液也可以包括在试剂盒内。试剂盒的 一种或多种组分可以是冻干的，并且试剂盒还可以包括适合于冻干组分重新溶解的试剂。如果合适，试剂盒还可以容纳反应容器、混合容器及有利于测试样本制备的其他 部件。试剂盒还可以可选地包括使用说明书，其可以以纸质形式或以如磁盘、CD、DVD等的 计算机可读形式提供。为了更好地理解本文所述的发明，提供了以下实施例。应理解这些实施例旨在说 明本发明的举例说明性实施方式，而不以任何方式限制本发明的范围。实施例实施例1 :3895bp人mtDNA缺失的分析使用本发明方法分析PCT申请号W0/06/111029中所鉴别的3895bp mtDNA缺失。 按照以下所提供的方法进行mtDNA的采集和提取。1、通过用无菌拭子擦拭皮肤部位约15次来采集皮肤样本。皮肤样本采自脚跟(η =41)、鼻(η = 43)、内臂(η = 20)、耳(η = 5)、肩部(η = 5)、臀部(η = 5)和背部(= 5)。
2、根据生产商的规程，使用可商购的试剂盒(QiaAMP DNAMicro Kit，产品编号 56304, Qiagen, Maryland USA)提取 mtDNA。3、使用 HS-DNA Quant-it dsDNA HS测定试剂盒(产品编号 Q32851，Invitrogen， California USA)在 Qubit 荧光计(产品编号 Q32857，Invitrogen, California USA)上 对双链DNA进行定量。4、然后，使用 iQ Sybr Green Supermix (产品编号 170-8882，Bio-Rad, California USA)和下列引物通过实时PCR(rt-PCR)定量3895bp缺失的水平，该引物为正向5，-CTGCTAACCCCATACCCCGAAAATGTTG-3，(SEQ IDNO 5)；反向5，-GAAGGATTATGGATGCGGTTGCTTGCGTGAG-3，(SEQID NO 6)。在该实施例中，使用一对扩增引物来扩增指示3895bp缺失存在的靶标区。在 3895bp序列缺失发生后，该正向引物与mtDNA的剪接区重叠(即在mtDNA基因组的547和 4443之间位置的剪接)。因此，只有在3895bp部分缺失时才能发生该重叠引物的延伸，而 产生尺寸正确的扩增产物。在定量3895bp缺失的步骤中，RT-PCR反应设置如下12. 5μ 1 的 iQ Sybr Green Supermix ；350nmol 的正向引物(SEQ ID NO 5)；350nmol 的反向引物(SEQ ID NO 6)；5 μ 1 的模板(约 0. 5ng 的 dsDNA)；加水至25μ1;循环参数步骤1 :95°C保持3分钟；步骤2 95 °C保持30秒；步骤3 67. 5°C保持 30 秒；步骤4 72 °C保持30秒；步骤5:读取板；步骤2-5循环45次；以1°C的间隔绘制55-110°C的熔化曲线，每3秒读取一次在10°C保持10分钟。这些测定的结果在图1至3中示出，并且证实从很少暴露于日光/UV辐射的区域 (即脚跟和臀部)取得的皮肤拭子与从经常暴露的那些区域(即鼻和耳)所取得的样品之 间存在明显的差别。与通常保护不受紫外辐射的区域(如脚跟和臀部)相比，在受到高水 平紫外辐射的区域(如鼻和肩)中3895bp缺失的水平显著升高。如图1和2所示，3895bp缺失的实时PCR循环阈值(CT)表明，与那些很少暴露于 紫外辐射的部位(脚跟或臀部)相比，在经常(鼻或耳)或偶而(肩部或背部)暴露于紫 外辐射的皮肤部位中缺失发生率更高。图3示出了与从很少暴露于紫外辐射的部位(例如，脚跟或内臂)所获得的皮肤 细胞中采集的mtDNA相比，从经常暴露于紫外辐射的部位(例如，鼻或耳)所获得的皮肤细 胞中采集的mtDNA的特征在于3895bp缺失标记物水平升高。这些结果还表明，根据本发明的皮肤样本采集的有效性，以便获得足够的mtDNA
15进行所述测定。这样，本发明所述的非创伤性皮肤采集方法在获得用于分析的mtDNA方面 与创伤性方法(例如，申请人的PCT申请号W0/06/111029中所使用的方法)的有效性类似。实施例2 皮肤采集方法的比较为了鉴别哪种方法(如果有)能得到用于分子分析如定量实时PCR的足够数量和 质量的核酸，测试了五种不同的非创伤性皮肤采集方法。所测试的五种方法为·使用手术胶带的胶带提取；.Biore 胶粘条； 用8 %扁桃酸湿润的无菌拭子；·用蒸馏水湿润的无菌拭子；和 蜡条。用70%的异丙醇对区域消毒后，对该皮肤表面应用胶带提取、Biore条和蜡条。施 加稳固的压力，然后快速除去所述胶带或条。施加稳固的压力，然后快速除去胶带或条。首 先将拭子放入在8%的扁桃酸或蒸馏水无菌溶液中，然后在用70%的异丙醇清洁皮肤后用 力摩擦所感兴趣的皮肤部位。从3位个体采集皮肤细胞后，将每个采集媒介放入到200 μ 1磷酸盐缓冲盐水溶液 (PBS)中并在56 °C培育过夜。然后，使用Qiagen公司的QiaAMP DNA微型试剂盒、口腔拭子规程(产物编号 51304)对所有样本进行核酸提取。使用NanoDrop ND-1000分光光度计对纯化的样本进 行定量以确定提取程序是否成功。表1 从通过五种非创伤性方法所采集的皮肤中提取的DNA的量的确定 当考虑核酸浓度和样本纯度时，对于使用水或者扁桃酸作为润湿剂的拭子样本或 者蜡样本得到了最一致的结果。接着，对所有样本进行PCR以确定是否存在扩增抑制剂，或在处理过程中是否发 生了显著的样本降解。根据下列条件扩增样本表2 样本扩增的PCR条件 所用引物为线粒体DNA引物，其具有以下提供的序列12s 正向引物序列 5，-CGTTCCAGTGAGTTCACCCTC-3，(SEQID NO 7)12s 反向引物序歹Ij R 5，-CACTCTTTACGCCGGCTTCTATT-3，(SEQ ID NO 8)根据以下规程，在DNA Engine Tetrad(Bio-Rad)上循环扩增反应1、94°C 保持 2 分钟2、94°C 保持 30 秒
3、64°C 保持 30 秒4、72°C 保持 30 秒5、将步骤2-4重复39次6、4°C 保持然后，将扩增产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳并用溴化乙锭染色。图4中提供了 扩增结果，其中凝胶的上半部分包括泳道 1 :500ng IOObp GeneRuler SM0323 (Fermentas)泳道2 个体1的Biore泳道3 个体1的水润湿拭子泳道4 个体1的扁桃酸润湿拭子泳道5 个体1的手术胶带泳道6:个体1的蜡泳道7 个体2的Biore泳道8 个体2的水润湿拭子
泳道9 个体2的扁桃酸润湿拭子泳道10 个体2的手术胶带泳道11:个体2的蜡泳道12:空白泳道13:阴性扩增对照泳道14:阳性扩增对照泳道15-18:空白而其中凝胶的下半部分包含泳道1 个体3的Biore泳道2 个体3的水润湿拭子
泳道3 个体3的扁桃酸润湿拭子泳道4 个体3的手术胶带泳道5:个体3的蜡泳道 6:500ng IOObp GeneRuler SM0323 (Fermentas)泳道7 =Biore提取物阴性对照泳道8 水润湿拭子提取物的阴性对照泳道9 扁桃酸润湿拭子提取物的阴性对照泳道10 手术胶带提取物的阴性对照泳道11 蜡提取物的阴性对照泳道12:空白泳道13 阴性扩增对照(上述泳道13上样的重复加载)泳道14 阳性扩增对照(上述泳道14上样的重复加载)泳道15-18:空白结果没有mtDNA是从使用Biore条收获的皮肤细胞中采集的mtDNA所扩增的。尽管水拭子扩增的更明显，但是水和扁桃酸的拭子均有扩增。手术胶带偶有扩增。蜡扩增明显，但 是可能由于非无菌性质或与蜡有关的处理困难，凝胶下半部分的泳道11中的提取物阴性 对照被污染了。考虑到所有因素，本实施例表明使用无菌拭子是优选的非创伤性皮肤样本采集方 法。拭子可以是干燥的或用各种液体湿润的以有利于样本的采集或缓冲。实施例3 其他皮肤采集方法的比较在本实施例中，为了鉴别哪种方法(如果有的话)能得到用于分子分析如定量实 时PCR的足够数量和质量的核酸，对五种其他非创伤性皮肤样本采集方法进行了测试。使用下列方法，从一位个体中采集皮肤样本两次·使用无菌外科手术刀刮皮肤·使用木制刮刀刮皮肤·胶粘垫的粘性表面(CapSure Clean-up Pad, Arcturus)· LCM MacroCap 的薄膜(Arcturus)· LCM MacroCap 的加热膜(Arcturus)首先通过用70%异丙醇擦拭进行清洁以准备皮肤。将木制刮刀和外科手术刀用力 地从皮肤表面通过以移出皮肤细胞，然后放入离心管中。无摩擦地将胶粘垫和膜用力地压 靠在皮肤上以采集皮肤细胞。使用两种不同的核酸提取方法处理多个采集。使用本领域熟知的蛋白酶K(PK)消 化对第一组进行提取，而使用QiaAMP DNA微型试剂盒(Qiagen 51304)对第二组进行提取。然后，使用NanoDrop ND-1000分光光度计对用Qiagen试剂盒处理的样品进行定 量。由于PK消化组中的那些样本不够清洁而不能用于这类型的定量，因此未进行定量。表3 从通过其他采集方法所采集的皮肤中提取的DNA的量的确定(Qiagen提取 的 DNA) 根据实施例2中提供的规程对样本进行扩增。然后将扩增产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳并用溴化乙锭染色。图5中示出了 结果，其中该凝胶包括泳道1 500ng 的 IOObp GeneRuler(SM0323)
泳道2 阴性扩增对照
泳道3 阳性扩增对照
泳道4 PK缓冲液木制刮屑
泳道5 PK缓冲液外科手术刀刮屑
泳道6 PK缓冲液CapSure垫
泳道7 PK 缓冲液 MacroCap
泳道8 PK缓冲液MacroCap加热的
泳道9 PK缓冲液木制刮刀刮屑阴性提取对照
泳道10=PK缓冲液外科手术刀刮屑阴性提取对照
泳道11=PK缓冲液CapSure阴性提取对照
泳道12=PK缓冲液MacroCap阴性提取对照
泳道13=PK缓冲液MacroCap加热膜阴性提取对照
泳道14= QiaAMP外科手术刀刮屑
泳道15=QiaAMP CapSure 垫
泳道16= QiaAMP木制刮刀刮屑
泳道17= QiaAMP外科手术刀刮屑阴性提取对照
泳道18:QiaAMP CapSure垫阴性提取对照
泳道19= QiaAMP木制刮刀刮屑阴性提取对照
泳道20= QiaAMP试剂阴性对照使用PK缓冲液对外科手术刀刮屑和MacroCap 进行扩增，而使用QiaAMP 试剂盒 对CapSure 垫进行很好的扩增。与皮肤擦拭相比，发现使用本实施例中测试的方法所采集 的mtDNA的量和所获得的扩增产物的量没有那样有效。实施例4 使用针采集皮肤样本使用针在9位个体的5个不同身体部位采集皮肤样本。所述身体部位包括眉毛、 耳垂、颈背、手和脚跟。如上所述使用针，将皮肤在样本采集人的手的拇指和食指之间捏起或提起成帐篷 状。将针穿过该皮肤，抽取少量的血或不抽血。通过将磷酸盐缓冲盐水加入针的柱管中，然 后把活塞插入无菌管中将样品从针中压出从而将该皮肤样本从针中提取出来。然后，使用 Qiagen公司的QiaAMP DNA微型试剂盒(Qiagen产物编号51304)从含有该皮肤组织的溶 液提取DNA。然后，为了鉴别3895bp mtDNA缺失对该样本进行扩增。本实施例的反应条件和循环参数与上述实施例1中所提供的相同。表3中列出了这些结果。表4 通过针所采集的皮肤样本的结果 很明显，通过该采集方法获得的材料足够进行分子分析如实时PCR。具体地，如表 3所证明的，已经对指示3895bp mtDNA缺失的扩增产物进行了检测和定量。因此，通过针采 集方法采集的皮肤样本得到了足够用于这种类型的测定的DNA。实施例5 =MClR变体的检测从三位受试者采集口腔样本。每位受试者用自来水或瓶装水漱口并将水吐出。从 保护性包装中取出棉签拭子并抓住柄部。握住棉签拭子柄部的同时，将棉签放入受试者口 中并用棉签摩擦面颊内侧30秒。将该拭子放入无菌管并密封以备其它处理。使用ABI的qPCR Taqman SNP基因分型测定来确定特定等位基因的检测。对每位 受试者测试七种等位基因变体D84E、R142H、R151C、R160H、D294H、V60L和V92M。使用 ABI 的测定(https://products, appliedbiosystems. com/ab/en/US/ direct/)鉴别了 D84E、R142H、R151C，V60L 禾Π V92M 的基因型，如下V60L-测定 #0751905410D84E-测定 #0751905520V92M-测定 #0203340520R142H-测定 #02754163410R151C-测定 #0203340420如下所列出的，使用定制的引物和探针来检测D294H等位基因变体。正向引物MC1R-294 CGCCCTCATCATCTGCAATG SEQ ID NO 9 ；反向引物MC1R-294 GGCTGTGGAAGGCGTAGAT SEQ ID NO 10 ；探针1MC1R-294V1VIC CCATCATCGACCCCCT SEQ ID NO 11 ；探针2MC1R-294M1FAM :CCATCATCCACCCCCT SEQ ID NO: 12。所有测定使用的反应条件与在Custom Taqman SNP基因分型测定规程中所概括 的一样。使用Sac II消化，测试R160H等位基因变体。使用引物扩增MC IR基因中的DNA 的靶标区。然后，对该扩增产物进行Sac II消化。凝胶的泳道1至4(参见图12)显示了 三位测试受试者和对照样本的结果。所有这四个样本均为纯合野生型。对于该等位基因位 点，指示纯合野生型的扩增产物的大小为436bp，其在用SAC II消化后得到327bp的产物。 在纯合变体中未发生消化，因此所有PCR扩增产物的尺寸仍为436bp。图6至12中示出了测试的结果。对每位个体进行两次测试，对照样本也测试两次。 V60L的对照样本基因型为杂合体，V92M的为纯合型变体，而其余等位基因为野生型。确定 测试的第一个体具有类型3皮肤(未发现MClR变体)。确定测试的第二个体具有类型3皮 肤(未发现MClR变体)。确定测试的第三个体为类型2皮肤(对于变体V60L和R151C为纯合体，而对于R142H为杂合体)。很明显，通过这种采集方法获得的材料足够进行MClR基因分型。具体地，通过口 腔拭子采集方法采集的DNA样本得到了足够用于这种类型的测定的DNA。实施例6 遮光剂方案的有效性的分析背景UVB为导致红斑(晒伤)的UVR光谱，该红斑是对紫外线发生过度暴露的目视提 示。通常使用红斑的发生频率和严重性作为个体日光保护习惯成功性的量度。然而，目前已 知道UVA会造成皮肤和DNA损伤，但是直到最近，遮光剂和防晒霜中才包含了针对阻断UVA 的作用剂。因此，出现了这种情况，使用遮光剂的个体保护自身不受UVB的红斑诱导作用， 但是却可能遭受比他们不使用遮光剂时会受到的UVA诱变作用更长时间的暴露。在这种 情况下，个体会自我报告称他们使用了遮光剂，而医疗工作者会错误地评估正用于防止UVR 损伤的措施，而事实上该患者并未受到对UVA的保护，并且最终风险仍会很高。如实施例1中所实施的，对以固定的时间间隔(如每两周或每月)用棉签拭子所 采集的表皮中，3895bp线粒体DNA缺失水平的测量可以为医疗工作者提供实时、定量的监 测工具以比较治疗建议从而确定它们在防止由UVR所引起的皮肤损伤中的有效性。这种采集方法使得能够没有任何副作用或不适地定期采样。该拭子得到了极低水 平的核酸(约0. Ing)，这不可用于靶向核DNA的测定，然而线粒体DNA靶标(如3895bp缺 失)的丰度要大得多(约大1000倍)，并且特别适合具有这样的极低收率的采集方法。研究通过年龄和肤色类似的两位个体的结果，证明了在鉴别不良日光习惯或无效保护 法中的mtDNA缺失分析的效用。患者202完全不使用遮光剂，而患者225有效地使用遮光 剂。他们的损伤水平反映患者202的这一行为具有高约10倍的3895bp缺失的量，表明与患 者225相比，由UVR暴露造成的DNA损伤水平较高(其中3CT的差异相当于靶标量10倍的 差异)。尽管这两位个体的表型表明UVR相关的皮肤损伤风险将会是相似的或等同的，但是 大概由于如遮光剂使用的行为差异，结合非创伤性拭子采集的3895缺失能够证明患者202 的风险更大。表5 =UVR损伤的患者分布图和风险因素 实施例7 分析MClR变体和mtDNA缺失以预测日光护理方案的有效性以下证明了监测DNA损伤和UVR相关的3895生物标记物的结合使用作为评估日 光护理方案有效性以及确定MClR变体状态的代表，其中年龄、肤色和遮光剂使用类似的两 位患者具有不同的DNA损伤水平，这大概是不同MC IR基因型的副产物。患者300不具有 与对UVR对皮肤损伤作用的易感性提高有关的变体，而患者303在氨基酸位置92处具有一 个变体。尽管从表型上说这两位患者非常类似并且在菲茨帕特里克(Fitzpatrick)皮肤光 型分级(类型3)中得分也相似，但是具有MClR变体的患者与不具有变体的患者相比，DNA损伤水平提高了 3倍，反应了易感性的提高(其中ICT的差异为约3倍的靶标量差异)。表6 两位患者中MClR差异和mtDNA缺失的比较分析 如前所讨论的，UVR造成的皮肤损伤是多因素过程，并因此不能假设具有MClR变 体的个体将始终比不具有的个体的损伤高，也不能假设报告定期使用遮光剂的个体将一定 比报告不使用遮光剂的个体的损伤低。将这两种测试相结合为医疗工作者提供了向他们所 护理的那些患者提供更知情的建议所需的见解。由于在DNA损伤谱中具有变体和不具有变体的个体通常相等地分布，以下两个表 对这一点进行了说明。表7A和7B =MClR差异与DNA损伤水平的比较A B 没有ν患者无变体一个ν患者在v60、v80或v92具有一个杂合变体两个ν患者在v60、v80和/或v92具有两个杂合变体或一个纯合变体> Ov患者在v60、v80或v92具有至少一个变体低低损伤组；C(t)为高于总体平均值的一个标准偏差平均+高平均及以上损伤组；C(t)为高于总体平均值的少于一个标准偏差当仅考虑通常与风险表型无关的变体时，在以下两个表中观察到了例外情况。氨 基酸位置60和92处的这些变体在低损伤人群中的人数不足，可能表明了他们对由于MClR 变体所造成损伤的易感性与缺少如皮肤白皙或红色毛发的目视提示之间的独特结合，并表 明风险增加导致了携带者中始终较高的损伤水平。表8 =MClR v60和v92变体与DNA损伤水平的比较仅使用v60和v92的汇合比例测试 没有ν患者无变体一个ν 患者在v60、v80或v92具有一个杂合变体两个ν患者在v60、v80和/或v92具有两个杂合变体或一个纯合变体> Ov患者在v60、v80或v92具有至少一个变体低低损伤组；C(t)为高于总体平均值的一个标准偏差平均+高平均及以上损伤组；C(t)为高于总体平均值的少于一个标准偏差实施例8 用于光老化测定的针采样出于评价UVR暴露的目的，提供了利用微创性采样程序结合线粒体标记物的其他 工具，其中通过用小号针(28号)采集面部或头部(如耳垂或接近眉嵴处)的皮肤组织，将 微芯压出到溶液中，进行核酸提取并测量与UVR损伤有关的线粒体靶标的量，如3895bp缺 失(见实施例1)。然后，将这个结果与结果的数据库进行比较并根据3895bp缺失的水平 将其划分成同龄组。通过如下方法产生了该数据库测量从0岁至80岁以每隔5岁年龄 间隔的多个个体中的3895bp缺失水平，寻找每个年龄间隔的簇群或方法，除去异常值并将 3895bp缺失水平的范围与年龄范围相关联。例如，21. 5-23. 5的CT值可以与45-65岁的年龄范围相关联。然后，将个体测试的结果与他们的实足年龄相比以确定他们的光损伤是否 比同龄组的其他个体更高或更低，并根据他们的结果评定光老化。为了生成该数据库，从289位个体的耳垂和眉嵴处采集微芯。如图13所示，提取 DNA和定量3895bp缺失水平后，如上所述构建该数据库，并将年龄组分为他们之间具有显 著差异的3个组(ρ <0.01)。尽管已经参考某些具体实施方式
描述了本发明，但在不背离本发明的精神和范围 的前提下，其各种变形对于本领域那些技术人员来说将是显而易见的。对于本领域技术人 员显而易见的是，所有这些变形均包含在所附权利要求的范围内。
权利要求
一种确定受试者的皮肤状态和对UVR损伤的遗传倾向性的诊断方法，包括(a)从受试者采集组织样本；(b)测定第一皮肤样本的线粒体DNA(mtDNA)变异；(c)测定第二皮肤样本的一种或多种黑皮素1受体(MC1R)变体；以及(d)根据对所述皮肤样本中的mtDNA变异和MC1R变体的检测，确定所述受试者的皮肤状态和对UVR损伤的遗传倾向性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述变异选自由缺失、取代和插入组成的组。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述变异是mtDNA缺失。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述缺失是所述mtDNA基因组的核酸546至4444 之间的3895bp mtDNA缺失。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述一种或多种MClR变体选自由D84E、R142H、 R151C、R160H、D294H、V60L、和 V92M 组成的组。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，至少所述第一组织样本为使用非创 伤性或微创性皮肤采集技术获得的皮肤样本。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述皮肤样本是使用采集皮肤组织的微芯的无 菌拭子、棉签拭子、小号针或它们的组合采集的。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述皮肤采集自所述受试者的真皮层或表皮层。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述皮肤样本来源于脚跟、鼻子、内臂、耳、口、头 皮、胸部、肩部、臀部、背部、面部、颈背、手、头部、或它们的组合。
10.根据权利要求1所述的方法在预测光老化、UVR损伤或皮肤疾病中的应用。
11.根据权利要求1所述的方法在确定防止或改善光老化、UVR损伤或皮肤癌的预防性 或治疗性处理中的应用。
12.一种用于监测光老化、UVR损伤或皮肤病的非创伤性方法，包括(a)使用非创伤性皮肤采样技术从受试者采集皮肤样本；(b)在规定的一段时间内，以固定的时间间隔测定所述皮肤样本的线粒体DNA(mtDNA) 变异；以及(c)确定在所述规定的一段时间内鉴别的mtDNA变异中的任何变化。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述非创伤性皮肤采集技术产生超低水平的DNA。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述超低水平的DNA为约0.Ing的核酸。
15.一种用于监测受试者对光老化、UVR损伤或皮肤病的预防性和治疗性处理的反应 的方法，包括(a)从受试者采集第一皮肤样本；(b)测定所述第一皮肤样本的线粒体DNA(mtDNA)变异；(c)测定所述第一皮肤样本的一种或多种黑皮素1受体(MClR)变体；(d)根据对所述第一皮肤样本中的mtDNA变异和MClR变体的检测，确定所述受试者的 皮肤状态和对UVR损伤的遗传倾向性；(e)对光老化、UVR损伤或皮肤病提供预防性或治疗性处理；(f)从受试者采集第二皮肤样本；(g)测定所述第二皮肤样本的线粒体DNA(mtDNA)变异；(h)在规定的一段时间内，以固定的时间间隔重复步骤(f)和(g)；和(i)比较在所述第一皮肤样本与所述以固定的时间间隔取得的皮肤样本之间的mtDNA 变异水平以检测mtDNA变异的变化，由此监测所述处理的有效性；以及(j)可选地，根据所述受试者的遗传倾向性和所检测到的mtDNA变异的变化而调整所 述处理。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，使用非创伤性或微创性皮肤采集技术，获得所 述第一皮肤样本、第二皮肤样本和以固定的时间间隔取得的皮肤样本。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，用于采集所述第二皮肤样本和以固定的时间 间隔取得的样本的所述非创伤性或微创性皮肤采集技术产生超低水平的DNA。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述超低水平的DNA为约0.Ing的核酸。
19.根据权利要求15所述的方法，其中，所述固定的时间间隔为每两周或每月。
20.一种筛选处理光老化、UVR损伤或皮肤病的有效治疗剂或药妆剂的方法，包括(a)从受试者采集第一皮肤样本；(b)测定所述第一皮肤样本的线粒体DNA(mtDNA)变异；(c)用所述治疗剂或所述药妆剂处理受试者；(d)在规定的一段时间后，从所述受试者采集第二皮肤样本；(e)测定所述第二皮肤样本的线粒体DNA(mtDNA)变异；以及(f)相对于对照，比较在所述第一皮肤样本和所述第二皮肤样本之间的mtDNA变异水 平以确定所述治疗剂或药妆剂的有效性。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，使用非创伤性或微创性皮肤采集技术获得所 述第一皮肤样本和第二皮肤样本。
22.一种用于确定受试者的光损伤水平的方法，包括(a)从受试者采集皮肤样本；(b)测定所述皮肤样本的线粒体DNA(mtDNA)缺失；(c)将所述皮肤样本的mtDNA缺失水平与根据年龄组所划分的一组mtDNA缺失比较，并 评定所述受试者的光老化；和(d)通过比较所述受试者的实足年龄与所述评定的光老化，确定所述受试者的光损伤 水平。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述线粒体DNA缺失是3895bp缺失。
24.一种用于确定受试者的皮肤状态和对UVR损伤的遗传倾向性的诊断试剂盒，包括(a)用于采集组织样本的材料；和(b)用于进行MClR基因分型和检测mtDNA变异的合适引物、探针和试剂。
全文摘要
本发明涉及用于预测、诊断和监测皮肤状态和皮肤疾病的方法。这些方法将非创伤性皮肤采集技术的使用与用于确定线粒体DNA(mtDNA)变异和黑皮素1受体(MC1R)变体的一种或多种测定相结合，从而提供了用于鉴别、预测和/或监测光老化、紫外辐射(UVR)损伤或皮肤病的综合性工具。本发明的方法还可以在筛选新型治疗剂、皮肤护理产品和治疗方案中有效，并且还可以用于监测受试者对预防性或治疗性处理的反应。
文档编号C07K14/72GK101896622SQ200880119849
公开日2010年11月24日 申请日期2008年10月14日 优先权日2007年10月11日
发明者凯丽·鲁滨逊, 加布里埃尔·达库波, 卡特里娜·马基, 安德烈亚·马格格拉, 安德鲁·哈博特尔, 布赖恩·赖古伊, 珍妮弗·克里德, 瑞安·帕尔, 罗伯特·塞耶, 马克·伯奇-梅钦 申请人:起源基因组学公司