一种将miRNA转染进猪精子并评估其转染效率的方法与流程

本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种将mirna转染进猪精子并评估其转染效率的方法。
背景技术：
：精子(sperm)是雄性生殖细胞，来源于希腊语意思是“种子”。哺乳动物的精子细胞由头部、颈部、中间部分和尾巴组成。头部包含有密集的染色质纤维的细胞核，周围环绕着一种高纤维，其中含有用于穿透女性卵子的酶；颈部则是精子的中心，中间部分有一个中央丝状的核心，周围有许多线粒体螺旋状的螺旋体，用于atp的生产，通过女性子宫颈、子宫和子宫管；尾巴或“鞭毛”会执行推动精子细胞的鞭毛运动。在受精过程中，精子能为卵细胞提供3个基本部分：(1)信号或激活因子，使代谢休眠的卵母细胞激活；(2)单倍体父基因组；(3)中粒，负责形成中心体和微管系统。microrna(mirna)是1993年在秀丽线虫中发现的一类单链、内源性的、非编码的小rna，长度约为22个碱基，广泛存在于动物、植物、病毒等多种有机体中。mirna作用于mrna的3’utr，从而抑制靶mrna的翻译或者介导靶mrna的降解。通过这两种方式对靶基因进行负调控，行使它的生物学功能。mirna的主要作用是调控基因的转录后表达，并且在表达上具有时序性和组织特异性。精子在细胞结构上不同于普通的细胞系或者细胞株，并且不能贴壁生长和分裂，而处于悬浮状态，容易死亡。常规的lipofectamine2000、3000等脂质体转染试剂对精子的转染效果不佳，是因为这些转染试剂在与需导入的核酸形成脂质体-dna复合物后，跟贴壁细胞相比，与悬浮的精子细胞的接触机会大大降低，更难通过内吞作用进入细胞。由于x-tremegenesirnatransfectionreagent这种转染试剂具有更高的转染效率和更小的细胞毒性。因此，本发明采用这种经过优化的脂质体转染试剂来转染精子细胞。此外，本发明采用qrt-pcr对转效率进行评估。将外源核酸导入动物精子是作为研究精子功能以及后续试验的一种重要方法，因此一种有效的精子转染方法是一切试验的保证。技术实现要素：本发明针对上述存在的问题做出改进，即本发明要解决的技术问题是提供一种将mirna转染进猪精子并评估其转染效率的方法，该方法可以有效的将mirna转染进猪精子中，并能评估mirna的转染效率。为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种将mirna转染进猪精子并评估其转染效率的方法，包括以下步骤：a、首先将稀释后的新鲜猪精液45度立于co2培养箱中孵育1h，接着用巴氏吸管吸出适量上层精子悬浮液，通过离心浓缩精子，然后加入等体积的稀释液进行稀释；b、使用x-tremegenesirnatransfectionreagent转染试剂将mirna转染进精子，将其放置于17℃保温箱上，转染6h；c、通过离心沉淀精子，然后使用trizolls抽提精子中的totalrna；d、对抽提出的totalrna进行mirna反转录以及相关mirna的定量，并对精子的转染效率进行评估。进一步的，步骤a具体为：a1、将新鲜猪精液转至数个50ml离心管中，倾斜45度立于5％co2、饱和湿度、37℃的培养箱中孵育1h，使具有高度活力的精子上游至溶液上层；a2、用巴氏吸管轻轻吸出上层精子悬浮液于新的50ml离心管中，1000rpm离心5min，去除上清液，得到具有高度活力的精子；a3、加入与上清液等体积的稀释液重悬精子，使精子均匀分布在溶液中。进一步的，步骤b具体为：b1、转染试验分为mimicgroup(m)、mimicnegativecontrolgroup(mc)、inhibitorgroup(i)、inhibitornegativecontrolgroup(ic)、controlgroup(c)五个试验组，m、mc组转染体系为：2.5μlx-tremegenesirnatransfectionreagent与50μlopti-mem预混成a液，2.5μl20μmmirna存储液与50μlopti-mem预混成b液；i、ic组转染体系为：5μlx-tremegenesirnatransfectionreagent与50μlopti-mem预混成a液，5μlmirna与50μlopti-mem预混成b液；b2、五个组都按将a液预混5min，b液预混5min，再将a液和b液于一起预混20min；b3、将步骤a3得到的混匀精液分装在数个无rna酶的1.5ml的ep管中，m、mc分别加入895μl的重悬精液，i、ic组分别加入890μl的重悬精液，c组加入1ml的重悬精液；b4、等a液b液20min预混时间到，将ab混合液分别加入已经加好精子重悬液的各组，m、mc组分别加入105μl，i、ic组加入110μl，五个组总体积均为1ml，盖好ep管的盖子，轻轻的上下颠倒，使其混合均匀；b5、将其放置于17℃保温箱上，转染6h。进一步的，步骤c具体为：c1、转染6h后，按4000×g离心5min去除上清液，得到精子细胞；c2、每管加入1ml的trizolls试剂，用漩涡仪充分混合均匀，室温放置5min；c3、加入200μl氯仿，盖好管盖，充分振荡，于冰上静置5min；c4、按12000×g，4℃离心15min后，样品会自动分成三层：上层为无色的水相，中间为薄薄的白色蛋白层，下层为有颜色的有机相，轻轻吸取上清液转移至一个新的离心管中，注意宁愿少吸也不要将其他层吸入以免造成蛋白质等污染；c5、加入500μl氯仿，盖好管盖，充分振荡，于冰上静置5min；c6、按12000×g，4℃离心15min后，再一次吸取上清液到新的1.5ml的ep管中，此步骤重复为获得更纯的rna；c7、向装有上清液的ep管中加入等体积的异丙醇，并加入1μl的糖原以促进rna沉降，盖好管盖，充分振荡，于冰上静置15min；c8、按12000×g，4℃离心10min，试管底部会出现少量白色的沉淀物，弃去上清液保留沉淀；c9、沿ep管管壁缓慢地加入75％的乙醇1ml，盖好管盖，上下颠倒ep管，使白色沉淀漂浮在75％的乙醇中，更好的洗涤异丙醇等有机物，然后按12000×g，4℃离心5min，弃去乙醇保留沉淀；c10、于冰上干燥沉淀3min左右后，每管加入20μl的rnase-freedh2o溶解沉淀，得到的rna溶液于-80℃保存。进一步的，步骤d具体为：d1、使用mir-xtmmirnafirst-strandsynthesiskit试剂盒进行mirna的反转录，反应体系为：mrqbuffer5μl，totalrna3.75μl，mrqenzymemix1.25μl；反应条件为37℃60min，85℃5sec；d2、向得到的反转录反应液中添加90μlrnasefreedh2o进行稀释，得到cdna；d3、对转染进精子的mirna进行qrt-pcr定量，每个样品重复3次，并用u6作为内参矫正，反应体系为：2×sybrgreenmixextaq5μl、forwardprimer0.5μl、reverseprimer0.5μl、rnase-freedh2o3μl、cdna1μl；反应条件为：95℃预变性10sec，95℃变性5sec，60℃退火20sec，40个循环；溶解曲线条件为：95℃60sec，55℃30sec，95℃30sec；d4、根据荧光定量结果，对精子细胞内mirna相对表达量进行计算。本发明的有益技术效果是：本发明采用45度孵育精子来获得具有高度活力的精子，从而为下一步转染实验做好准备。本发明采用17℃保温箱进行转染实验，从而能有效保证转染过程中精子的损伤最小。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本发明实施例1中精子转染示意图；图2为本发明实施例2中mir-26a-5p荧光定量数值分段柱状图。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1采集新鲜大白公猪精液，保留中段精液50ml，稀释液(beltsvillethawingsolution稀释粉50g用1000ml双蒸水稀释得到的稀释液)与精液按1:1稀释，得到100ml的稀释后精液。该精液用于后续mirna的转染。转染大白公猪精液的方法包括以下步骤：(1)将稀释后新鲜猪精液转至两个50ml离心管中，倾斜45度立于倾斜45度立于5％co2、饱和湿度、37℃恒温培养箱中孵育1h，使具有高度活力的精子上游至溶液上层；(2)两管用巴氏吸管均轻轻吸出20ml的上层精子悬浮液于一个新的50ml离心管中，1000rpm离心5min，去除上清液，得到具有高度活力的精子；(3)加入40ml的稀释液重悬精子，使精子均匀分布在溶液中；(4)转染试验分为mimicgroup(m)、mimicnegativecontrolgroup(mc)、inhibitorgroup(i)、inhibitornegativecontrolgroup(ic)、controlgroup(c)五个试验组，每个组6个重复，按表1将a液预混5min，b液预混5min，再将a液和b液于一起预混20min；表1精子转染体系(5)将(3)中得到的混匀精液分装在个30个无rna酶的1.5ml的ep管中，m、mc组分别加入895μl的重悬精液，i、ic组分别加入890μl的重悬精液，c组加1ml的重悬精液；(6)等a液b液20min预混时间到，将ab混合液分别加入已经加好精子重悬液的各组，m、mc组分别加入105μl，i、ic组分别加入110μl，五个组总体积均为1ml，盖好ep管的盖子，轻轻的上下颠倒，使其混合均匀；(7)将其放置于17℃保温箱上，转染6h。实施例2将实施例1中得到的转染过mir-26a-5p的精子进行totalrna的抽提，mirna反转录和定量，以及转染效率的评估。具体方法包括以下步骤：(1)转染6h后，按4000×g离心5min去除上清液，得到精子细胞；(2)每管加入1ml的trizolls试剂，用漩涡仪充分混合均匀，室温放置5min；(3)加入200μl氯仿，盖好管盖，充分振荡，于冰上静置5min；(4)按12000×g，4℃离心15min后，样品会自动分成三层：上层为无色的水相(上清液)，中间为薄薄的白色蛋白层，下层为有颜色的有机相，轻轻吸取上清液转移至一个新的离心管中，注意宁愿少吸也不要将其他层吸入以免造成蛋白质等污染；(5)加入500μl氯仿，盖好管盖，充分振荡，于冰上静置5min；(6)按12000×g，4℃离心15min后，再一次吸取上清液到新的1.5ml的ep管中，此步骤重复为获得更纯的rna；(7)向装有上清液的ep管中加入等体积的异丙醇，并加入1μl的糖原以促进rna沉降，盖好管盖，充分振荡，于冰上静置15min；(8)按12000×g，4℃离心10min，试管底部出现少量白色的沉淀物，弃去上清液保留沉淀；(9)沿ep管管壁缓慢地加入75％的乙醇1ml，盖好管盖，上下颠倒ep管，使白色沉淀漂浮在75％的乙醇中，更好的洗涤异丙醇等有机物，然后按12000×g，4℃离心5min，弃去乙醇保留沉淀；(10)于冰上干燥沉淀3min左右后，每管加入20μl的rnase-freedh2o溶解沉淀，得到rna溶液(-80℃保存)；(11)使用mir-xtmmirnafirst-strandsynthesiskit试剂盒进行mirna的反转录，反应体系如表2。表2mirnas反转录体系试剂体积(μl)mrqbuffer5μlmrqenzymemix1.25μltotalrna3.75μl总体积10μl(12)反应条件为37℃60min，85℃5sec；(13)向得到的反转录反应液中添加90μlrnasefreedh2o进行稀释，得到cdna；(14)对mir-26a-5p进行qrt-pcr定量，每个样品重复3次，并用u6作内参矫正，反应体系如表3；反应条件为：95℃预变性10sec，95℃变性5sec，60℃退火20sec(加上荧光照相)，40个循环；溶解曲线条件为：95℃60sec，55℃30sec(加上荧光照相)，95℃30sec；表4为五个组精子中mir-26a-5p定量的ct值比较。表3mirna荧光定量反应体系试剂体积(μl)2×sybrgreenmixextaqtm5μlpcrforwardprimer0.5μlpcrreverseprimer0.5μlrnase-freedh2o3μlcdna1μl总体积10μl表4mir-26a-5p定量数值比较实施例2对实施例1中转染mir-26a-5p后的精子进行了rna的抽提及mirna反转录及qrt-pcr定量，经计算后结果表明：m组mir-26a-5p的表达量最高，与mc组及c组均差异极显著；i组mir-26a-5p的表达量最低，与ic组及c组均差异极显著(表4，图2)，以上结果证明mir-26a-5p确实能被转染到大白公猪的精子中。当前第1页12