LncRNAENST00000424523.1及其基因在诊断和治疗药物中的应用的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及lncrnaenst00000424523.1及其基因在诊断和治疗药物中的应用。

背景技术：

胃癌是世界上最常见的消化系统恶性肿瘤之一，统计显示70％的胃癌患者属于发展中国家；其中，将近半数的胃癌患者属于东亚亚国家，特别是中国。胃癌病因复杂，其涉及的因素有幽门螺杆菌感染、饮食、环境致癌物暴露和遗传易感性等；环境致癌物被认为是导致胃癌发生最重要的因素之一。

n-亚硝基化合物(nocs)是一类与胃癌发生相关的强致癌物质，生活中主要来源于各类腌制物、烟熏物或由内源性形成。n-甲基-n′-硝基-n′-亚硝基胍(mnng)作为n-亚硝基化合物的一种，是公认广泛存在环境中的化学诱变剂和致癌剂。虽然目前人们已构建mnng诱导胃癌的动物模型和细胞模型，使胃癌的研究取得一定的进展，但mnng涉及的胃癌机制仍需进一步明确。

过去，化学致癌物诱发胃癌的机制研究主要针对编码基因，近年随着高通量测序等生物技术的发展，非编码rna与化学致癌物诱发胃癌的关联逐渐受到人们的重视。长链非编码rna(longnoncodingrna，lncrna)是一类长度大于200核苷酸的非编码rna。lncrna是一类重要的基因表达调控元件，能在多种水平(表观遗传、转录和转录后等)调控基因的表达，且与多种疾病密切相关，如肿瘤的发生、发展、凋亡、迁移和粘附等。根据lncrna在肿瘤发生中的作用，目前分为致癌作用的lncrna和抑癌作用的lncrna。

胃癌已成为当今社会的疾病难题，早期的临床诊断和预后有利于胃癌的治疗，同时胃癌的治疗药物有待于进一步研发。因此，有必要将lncrna与胃癌相结合，为胃癌的诊断、预后以及治疗提供新的治疗思路。

技术实现要素：

本发明目的在于克服现有技术存在的不足，而提供lncrnaenst00000424523.1及其基因在诊断和治疗药物中的应用。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：lncrnaenst00000424523.1及其基因在筛选或制备胃癌临床诊断或预后的芯片、制剂或试剂盒中的应用，lncrnaenst00000424523.1的基因序列号为loc101927497。

另外，本发明还提供lncrnaenst00000424523.1及其基因在筛选或制备胃癌治疗药物中的应用，lncrnaenst00000424523.1的基因序列号为loc101927497。

另外，本发明还提供检测lncrnaenst00000424523.1的试剂在筛选或制备胃癌临床诊断或预后的芯片、制剂或试剂盒中的应用。

另外，本发明还提供一种胃癌临床诊断或预后的芯片、制剂或试剂盒，包括测定lncrnaenst00000424523.1转录量的特异性引物，所述特异性引物包含如seqidno.1和seqidno.2所示的dna序列。

本发明首先通过高通量测序rna-seq证实lncrnaenst00000424523.1的基因(loc101927497)在胃癌细胞和阴性细胞中的转录存在差异，并制备了检测lncrnaenst00000424523.1的特异性引物，可以用来作为胃癌的临床诊断和预后的标记物。

另外，本发明还提供lncrnaenst00000424523.1促进剂在筛选或制备胃癌治疗药物中的应用。

作为上述技术方案的改进，所述lncrnaenst00000424523.1促进剂包含促进基因loc101927497过表达的质粒，所述质粒含有基因loc101927497的dna序列。

本发明构建基因loc101927497过表达的质粒，并设计合成出基因loc101927497的sirna，实验发现：在ges-1-t(恶性转化的人胃粘膜细胞)和mkn-28(胃癌细胞)两种细胞中，上调表达lncrnaenst00000424523.1能抑制胃癌细胞增殖，下调表达lncrnaenst00000424523.1能促进胃癌细胞增殖。

另外，本发明还提供一种胃癌的治疗药物，所述治疗药物包含lncrnaenst00000424523.1促进剂。

作为上述技术方案的改进，所述lncrnaenst00000424523.1促进剂包含促进基因loc101927497过表达的质粒，所述质粒含有基因loc101927497的dna序列。

作为上述技术方案进一步地改进，所述治疗药物还包含药学生上可接受的载体。

在上述技术方案中，“药学上可接受的载体”包括任何和所有生理上相容的溶剂、分散介质、包衣料、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂等。药学上可接受的载体的实例包括水、盐水、磷酸缓冲盐水、右旋糖酐、甘油、乙醇等中的一个或多个以及它们的组合。在很多情况下，优选的是将等渗剂例如糖、多元醇或氯化钠包括在组合物中。药学上可接受的载体还可包含少量的能提高抗体或抗体部分的货架期或有效性的辅助物质，如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液。

另外，本发明还提供一种基因loc101927497的sirna，所述sirna为sirna-1、sirna-2或sirna-3，所述sirna-1由如seqidno.3和seqidno.4所示的rna序列组成，所述sirna-2由如seqidno.5和seqidno.6所示的rna序列组成，所述sirna-3由如seqidno.7和seqidno.8所示的rna序列组成。

本发明的有益效果在于：本发明提供lncrnaenst00000424523.1及其基因在诊断和治疗药物中的应用，本发明首先通过高通量测序rna-seq证实lncrnaenst00000424523.1的基因(loc101927497)在胃癌细胞和阴性细胞中的转录存在差异；并制备了检测lncrnaenst00000424523.1的特异性引物，可以应用于胃癌的临床诊断和预后；rna-seq数据及qrt-pcr数据都显示：lncrnaenst00000424523.1在恶性转化的胃粘膜细胞ges-1-t和胃癌细胞(mkn-28、mgc-803)中均表达下调，上调表达lncrnaenst00000424523.1能抑制胃癌细胞增殖，下调表达lncrnaenst00000424523.1能促进胃癌细胞增殖；由此可见，lncrnaenst00000424523.1及基因可应用于胃癌的临床诊断、预后和治疗。

附图说明

图1为ges-1-t细胞和ges-1-n细胞的高通量rna-seq测序结果图；图1a显示两种细胞差异表达的lncrna，图1b显示两种细胞差异表达的mrna；图中，差异表达lncrna和mrna用圆圈标出；

图2为验证lncrna的差异表达的统计图；图2a显示ges-1-t细胞和ges-1-n细胞中lncrna表达量，en～452050.1为enst00000452050.1的缩写，en～435695.1为enst00000435695.1的缩写，en～424523.1为enst00000424523.1的缩写；图2b显示ges-1细胞、mkn-28细胞和mgc-803细胞中lncrnaenst00000424523.1相对水平；图中，*表示p<0.05，**表示p<0.01；

图3显示上调lncrnaenst00000424523.1的表达对胃癌细胞增殖的影响；图3a显示导入过表达载体pcdna-loc101927497的ges-1-t细胞和mkn-28细胞中lncrnaenst00000424523.1的相对表达量；图3b显示导入过表达载体pcdna-loc101927497的ges-1-t细胞和mkn-28细胞的增殖得到抑制；图中，pcdna-lncrna为导入基因loc101927497的过表达载体，pcdna3.1为阴性对照；

图4显示显示下调lncrnaenst00000424523.1的表达对胃癌细胞增殖的影响；图4a显示转染sirna的ges-1-t细胞和mkn-28细胞中lncrnaenst00000424523.1的相对表达量；图4b显示转染sirna的ges-1-t细胞和mkn-28细胞的增殖得到促进；图中，sirna为阴性对照。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例、附表和附图对本发明作进一步说明。

实施例1高通量rna-seq测序结果分析，mnng处理的ges-1-t细胞会产生差异表达的lncrna

方法：以mnng诱导的恶性转化人胃粘膜细胞ges-1-t(t：转化)及dmso处理的阴性对照细胞ges-1-n(n：正常)为实验对象，通过高通量rna-seq测序技术，分析两种细胞中lncrna及mrna的表达差异。分析ges-1-t和ges-1-n细胞中的lncrna表达量，以表达差异倍数在2倍以上或0.5倍以下、p<0.05为标准确定差异表达的lncrna，以同样的标准确定差异表达的mrna。

结果：通过分析发现，ges-1-t细胞中检测出lncrna17626个，ges-1-n细胞中检测出lncrna17916个。ges-1-t细胞中较ges-1-n细胞中具有表达差异的lncrna有253个，其中表达上调的lncrna有94个，表达下调的lncrna有159个(如图1a所示)；同时也发现，两种细胞中有表达差异的mrna共751个，其中表达上调的mrna有244个，表达下调的mrna有507个(如图1b所示)。如表1所示，列出ges-1-t细胞中下调最明显的3个lncrna。

表1

实施例2lncrnaenst00000424523.1在ges-1-t细胞和胃癌细胞中低表达

方法：为了进一步寻找在mnng诱导ges-1细胞恶转中可能发挥作用的lncrna，我们从具有表达差异性的lncrna中选取变化差异较显著的3个lncrna，用qrt-pcr的方法在ges-1-t细胞与ges-1-n细胞中检测其表达水平。此外，我们还通过qrt-pcr检测了胃癌细胞mkn-28和mgc-803中lncrnaenst00000424523.1的表达。qrt-pcr所使用的lncrna以及内参gapdh引物序列如表2所示，表2中forward为正向引物，reverse为反向引物；lncrnaenst00000424523.1的cdna引物序列forward-aatgcttggaatgtgggagc(如seqidno.1所示)，reverse-ggcagctttcaggggtttta(如seqidno.2所示)。

结果：分析变化差异较显著的3个lncrna，从检测结果中我们发现lncrnaenst00000424523.1，其ncbi基因号为loc101927497，是一个未曾被研究的lncrna。与ges-1-n细胞相比，lncrnaenst00000424523.1在ges-1-t中的表达明显下调(foldchange＝0.3974799±0.26，p<0.05)(如图2a所示)；lncrnaenst00000424523.1在mkn-28、mgc-803这两种胃癌细胞中同样表现为低表达水平(如图2b所示)。这些结果表明，lncrnaenst00000424523.1在mnng诱导的恶转细胞ges-1-t和胃癌细胞株中均表达下调，基因loc101927497有可能作为抑癌基因在mnng诱导胃癌过程中发挥重要作用。

表2

实施例3上调lncrnaenst00000424523.1的表达抑制胃癌细胞的增殖

方法：为了探讨基因loc101927497在mnng诱导胃癌过程中的功能，通过构建过表达载体pcdna-loc101927497，研究基因loc101927497在恶性转化胃癌细胞ges-1-t和胃癌细胞系mkn28中的作用。用pcdna-loc101927497分别转染ges-1-t和mkn-28细胞，48小时后，用qrt-pcr法检测lncrnaenst00000424523.1的过表达效果，并用cck-8试剂盒检测过表的lncrnaenst00000424523.1对胃癌细胞增殖的影响。

结果：转染pcdna-loc101927497后，lncrnaenst00000424523.1的表达水平在ges-1-t和mkn-28细胞均有明显上调(如图3a所示)；其次，过表达的lncrnaenst00000424523.1明显削弱ges-1-t细胞和mkn-28细胞的增殖(如图3b所示)。该结果表明上调lncrnaenst00000424523.1的表达水平对胃癌细胞的增殖能力有明显抑制作用。

实施例4下调lncrnaenst00000424523.1的表达促进胃癌细胞的增殖

方法：用sirna干扰lncrnaenst00000424523.1的表达，检测对ges-1-t细胞和mkn-28细胞增殖的情况。合成了3条特异性sirna：sirna-1、sirna-2、sirna-3(如表3所示)，用3条sirna分别转染ges-1-t细胞和mkn-28细胞，48小时后，用qrt-pcr检测lncrnaenst00000424523.1的表达水平以验证sirna的干扰效果，并进一步用cck-8试剂盒检测下调表达的lncrnaenst00000424523.1对胃癌细胞增殖的影响。

结果：转染3条sirna后，lncrnaenst00000424523.1的表达水平在ges-1-t细胞和mkn-28细胞中均有明显下降(如图4a所示)；敲低lncrnaenst00000424523.1的表达后，ges-1-t和mkn-28细胞增殖能力显著增强，且mkn-28细胞较为明显(如图4b所示)。

表3

最后所应当说明的是，以上实施例用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者同等替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110>广州医科大学附属第五医院

<120>lncrnaenst00000424523.1及其基因在诊断和治疗药物中的应用

<130>2017.7.3

<160>8

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

aatgcttggaatgtgggagc20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

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ggcagctttcaggggtttta20

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<213>人工序列

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ccuaggagauuucaguaaauu21

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<211>21

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uuuacugaaaucuccuagguu21

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<211>21

<212>rna

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<400>5

gccugccacuuaccuuaaauu21

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<212>rna

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uuuaagguaaguggcaggcuu21

<210>7

<211>21

<212>rna

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ccugccacuuaccuuaaauuu21

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<212>rna

<213>人工序列

<400>8

auuuaagguaaguggcagguu21