一种辅助诊断待测胎儿是否为21-三体综合征患者的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种辅助诊断待测胎儿是否为21-三体综合征患者的试剂盒，包括核苷酸测序工具、samtools-0.1.19软件、21-三体综合征筛查程序和记载如下操作规程的载体：(1)取正常对照血样本以及待测血样本，测序；(2)在21-三体综合征筛查程序中调用samtools-0.1.19软件，将正常对照血样本以及待测血样本的测序结果输入21-三体综合征筛查程序，输入“perl?T21.pl?ctrl?test?n”，程序输出xi(i＝1～n)；是xi(i＝1～n)的平均值；sd(x)是xi(i＝1～n)的标准差；t(n-1)(x)是自由度为n-1的t分布的概率密度函数；如果p﹤0.01，待测胎儿为候选的21-三体综合征患者；如果p﹥0.01,待测胎儿为候选的非21-三体综合征患者。
【专利说明】一种辅助诊断待测胎儿是否为21-三体综合征患者的试剂 合 品
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种辅助诊断待测胎儿是否为21-三体综合征患者的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 21-三体综合征，又称先天愚型或Down综合征，是小儿最为常见的由常染色体畸 变性所导致的出生缺陷类疾病。现代医学证实，21-三体综合征发生率与母亲怀孕年龄有相 关，系21号染色体的异常（多了一条21号染色体）。高龄孕妇、卵子老化是发生不分离的 重要原因。
[0003] 21-三体综合征患儿的表征如下：
[0004] (1)具明显的特殊面容体征，如眼距宽、鼻根低平、眼裂小、眼外侧上斜、有内眦赘 皮、外耳小、舌胖、常伸出口外、流涎多、身材矮小、头围小于正常，头前/后径短、枕部平呈 扁头、颈短、皮肤宽松、骨龄常落后于年龄、出牙延迟且常错位、头发细软而较少、前1?闭合 晚、顶枕中线可有第三囟门、四肢短、韧带松弛、关节可过度弯曲、手指粗短、小指中节骨发 育不良使小指向内弯曲、指骨短、手掌三叉点向远端移位等，常见通贯掌纹、草鞋足，拇趾球 部约半数患儿呈弓形皮纹；
[0005] (2)常呈现嗜睡和喂养困难，其智能低下表现随年龄增长而逐渐明显，智商25? 50,动作发育和性发育都延迟；
[0006] (3)男性唐氏婴儿长大至青春期，也不会有生育能力；而女性唐氏婴儿长大后有 月经，并且有可能生育；
[0007] (4)患儿常伴有先天性心脏病等其他畸形，因免疫功能低下，易患各种感染，白血 病的发生率比一般增高10?30倍，如存活至成人期，则常在30岁以后即出现老年性痴呆 症状。
[0008] 羊水细胞染色体检查（羊膜腔穿刺），即在B超引导下，将针通过孕妇腹部刺入羊 水中，抽取羊水，对胎儿细胞进行染色体分析，适宜孕16?20周的孕妇），是唐氏综合征产 前诊断的一种有效方法。羊膜腔穿刺筛查结果为"高危"的孕妇需要经胎儿脐静脉穿刺确 诊胎儿是否为唐氏综合征患儿。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是提供一种辅助诊断待测胎儿是否为21-三体综合征患者的试剂 盒。
[0010] 本发明提供了一种辅助诊断待测胎儿是否为21-三体综合征患者的试剂盒，包括 核苷酸测序仪器、samtools-0. 1. 19软件、21-三体综合征筛查程序和记载有如下操作规程 和判断标准的载体：
[0011] (1)取一个正常对照血样本以及待测血样本，提取各个样本的基因组DNA，测序， 得到各个样本的全基因组测序结果；
[0012] (2)在21-三体综合征筛查程序中调用samtools-ο. 1. 19软件，将步骤（1)得到的 正常对照血样本的全基因组测序结果以及步骤（1)得到的待测血样本的全基因组测序结 果输入21-三体综合征筛查程序，输入以下命令"perl T21.pl Ctrl test η, η为10以上 30以下的自然数"，程序输出Xi (i = 1?η);
[0013] Τ ^ 1---(η-1):歹是叉力=1?η)的平均值；sd(x)是xji = 1?η)的 标准差；
[0014] Ρ = (X)是自由度为η-1的t分布的概率密度函数；
[0015] 如果p < 0.01，待测胎儿为候选的21-三体综合征患者；如果p > 0.01，待测胎 儿为候选的非21-三体综合征患者。如果p= 0.01，需要进行胎儿脐静脉穿刺检查。
[0016] 所述21-三体综合征筛查程序的计算机语言如下：
[0017] use Fi lellandle; $sciraplel=$ARGV[0]; $sampic2=$ARGV[l]; Iwindow nurabcr=$ARGV[2]; preprocess($5；amp.lel); Itotal l=gettoial (.fsamploL stats*); _rcsi=sUuregi()n($samplol· ehr21. sam#/, 48129895, Iwindow number， 1)； pr〇|3roccs.s (Jsatnp Ic2); $lola 12-gellolal ($saruple2. sials^); §ros2^statrcgion($sarapIc2. ^ chr21. samw, 48129895, $window number, $totai 2); Tor($ i =0;$ i <=$#rcs1：$ i ++} $ros=$resl[$iJ-$rcs2[$i]; if (Ires no * 0*) {print $rcs.〃\n〃:] }；
[0018] mh proprocoss { my($sample); sysiemC^saiiiiooIs viinv ~bq 10 ' Ssample. ' bam tf m\ Isampie, ΓΠ ten'eni banT); system(^samtooIs index $Miple,-filtered bam〃）； system(^samtoo1s idxstats l^ampic, v f \ I torod. bam >' Ie. 〃. stats"）； system(^sarntno 1 s view Isamplc, ^ t'\ 1 tered. bam vhr2\ y\ $samp ?ο. ^ chr21. sam^); } sub gettotal ( iny ; my $ Πι-now l:i 1 ci land I o; $fh~?>opon ($st); my $1o1h1-0; whi lc?$fh>) { chomp($ ); my #1i ne-spli t/\i;? $ ; llotal-Stotal+SIinc[2]; $ ill->(： lose; reUrni $ total; 1; sub statregion{ my (Sfllc, $lotal, Iwindow number, Sreads)=§ ; my Istep^int($total/Swindow number); my $fh二new Fi1eHand1e:
[0019] my iarrayl; $ΓΗ->οροη ($f'i 1c); whi lo (<$('h>) { ilino=split;\t/,$ ； $i dx1 = 1nt(($1ine[3])/$stop); i f($array1[$idxl] == undeΓ) {$arrayl[$idxl]=D;}; $array1[$idxl]++; h for($ i =0;$ i <=$#array1;$ i ++) { i Γ ($array 1 [$ i ] == undeΓ) { $arrayl[$i]=0; Seise { $array1[$ i]=$arrayI[$ i]/$reads; }； h $fh->close; return iarrayl;
[0020] 所述21-三体综合征筛查程序的编程语言：Perl。
[0021] 所述21-三体综合征筛查程序的操作系统：Linux。
[0022] 所述21-三体综合征筛查程序的运行条件：系统中已经安装samtools-0. 1. 19。
[0023] η具体可为20。
[0024] 所述正常对照血样本具体可为已生产下正常婴儿的母亲处于孕12周-孕24周时 抽取并留存的外周血。
[0025] 所述待测血样本具体可为待测孕妇处于孕12周-孕24周时抽取的外周血。
[0026] 所述核音酸测序仪器可为 Ion Torrent? Personal Genome Machine? (PGM) (life techonologies)〇
[0027] 无创21三体产前检验能在不对母体和胎儿产生危害的情况下以较高的精度和灵 敏度得到胎儿罹患21-三体综合症的风险率。
[0028] 本发明的优势如下：
[0029] (1)传统的方法需要构造一个正常样本的分布，为了保证分布的准确性，至少需要 10个以上的正常样本的数据，这使得测序的成本大大增加了；本发明提供的方法只需要一 个已知的正常样本就能检验受试样本。样本量需求小，成本低。
[0030] (2)在传统的方法中，需要构造一个正常样本的分布，但是这很难保证每次测序 的条件都相同，因此可能会对数据造成一定的噪声，从而降低所构造的分布的准确性；本发 明提供的方法是在同一次测序中同时测了正常样本和受试样本，能够保证测序条件完全相 同，从而降低了噪声，使得测序结果更加准确。
【具体实施方式】
[0031] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。
[0032] 患儿母体血样本为已进行胎儿脐静脉穿刺检查并确认怀有21-三体综合征胎儿 的孕妇（均为知情同意的志愿者）处于孕12周-孕24周时抽取并留存的外周血。取17 个来自不同孕妇的外周血，依次命名为Runl_bc001、Runl_bc004、Runl_bc005、Run2_bc005、 Run2_bc007、Run3_bc015、Run3_bc016、Run4_bc005 和 Run4_bc015、Run5_bc001、Run6_ bcOOl、Run7_bc002、Run7_bc006、Run8_bc028、Run9_bc007、Run9_bc028、Run9_bc029。
[0033] 正常对照血样本为已生产下正常婴儿的母亲（均为知情同意的志愿者）处于孕12 周-孕24周时抽取并留存的外周血。取28个来自不同孕妇的外周血，依次命名为Runl_ bc002、Runl-bc003、Runl-bc006、Run2-bc008、Run3-bc012、Run3-bc013、Run3-bc014、Run4- bc013、Run4_bc016、Run4_bc020、Run5_bc005、Run5_bc014、Run5_bc021、Run5_bc022、Run5_ bc026、Run6_bc014、Run6_bc015、Run6_bc017、Run6_bc019、Run6_bc024、Run7_bc012、Run7_ bc014、Run8-bc017、Run8-bc022、Run8-bc024、Run9-bcOll、Run9-bc015、Run9-bc017。
[0034] 由于待测血样本的未知性，患儿母体血样本和正常对照血样本均可作为待测血样 本。
[0035] 21-三体综合征筛查程序的计算机语言如下：
[0036] use I"i leliaiitile; $sampici^$ARCSV[0]; $samplo2^$ARGV[i]; Iwindow ηιιπ]?)〇Γ-§ΑΙ?(}ν[2]; proprocoss($sampIol); $ioinΠ-goltoln! sini^); (frcs 1 -slat region (l.sninp 1 c 1. ^ chr21. sam", 18129895, Sw i ndmv number, S total 1); prcprocoss($samplc2); $lniai2-golintai ($snii]plo2. ; #rcs2二statregi on 爾)i e2. " chr21.snnf, 48129B95f Swi ndow number,Stolal 2)； for($i=0;$i<^$#resl;$i++) { Ircs^lresl[$i]-$res2[$ij; if($res nc ' 05) {print $res,\rT;} }； sub preprocess ( my (Isrimple) =t.....; system(''samtool s view -bq 10 ' $sa_3]e,· bam '細備pie, fi 1 tered. bam^); system(^Srimtao 1 s index "，$sample. " Π 1 tereci banT); system('samtools idxstats ' Ssampie, filtered ban >' $saraple,. stats#); systcro(〃samtoc) i s vim ' $sa呵)1 c, fi 1 tered. bam chr2〖>' $samp]e, chr2l. sam〃）；
[0037] } Huh get total i my ($sl)^(f ; my Jfh-ncw In IoUandfc; $rh~>operi ($st); ray $ total-0; whilo (<$fh>) { chomp(I ); my (I! ino^sj.)!! t/\t/? $ ; $total^Stotal+$1inc[2]; }; $fh->close; return $total; }: sub statregion{ my ($files ftotal, $window number, $readK)=i ; my Jstcp-int($total/|window number); my Jfh^new FileHaodle; my farrayl; $ fh~>opcn($fi1c); whiIe (<$fh>) { il inc-spli i/\t/, $ ; lidxl^intfdl i ne[3])/Jstep)： i f ($array 1 ?"$? dxl ] = undcf) {$arrayi [lidxlJ^O;}; larrayl[$idxl]++; }；
[0038] for($ i =0;S i <=$#array1;$i++) { i f($arrayl [Si j - under) { $arra>I[$i]-0; } else { larray1f$ i]=$array1[$ i1/$roads; }； }； ,$f'h->c 1 osc; return iarray1;
[0039] 21-三体综合征筛查程序的编程语言：Perl ;
[0040] 21-三体综合征筛查程序的操作系统：Linux ;
[0041] 21-三体综合征筛查程序的运行条件：系统中已经安装samtools-0. 1. 19 ;
[0042] 21-三体综合征筛查程序的使用方法：
[0043] 将21-三体综合征筛查程序的计算机语言保存为一个文本文件，命名为T21. pi ;
[0044] 待测血样本的全基因组的序列文件名为test, bam ;
[0045] 正常对照血样本的全基因组的序列文件名为Ctrl, bam ;
[0046] 设定将21号染色体平均分为η个窗口（即输入以下命令：perl T21. pi Ctrl test n ;n为10以上30以下的自然数），得到正常对照血样本和待测血样本在21号染色体上η 个窗口中对应的序列的百分含量的差值，即Xi = Controli-Testi，（i = 1?η)。
[0047] 实施例、采用本发明的方法辅助诊断待测胎儿是否为21-三体综合征患者
[0048] 1、取至少一个正常对照血样本，以及若干个待测血样本，提取各个样本的基因 组 DNA，使用 Ion Xpress? Barcode Adapters 65-80 Kit (life techonologies)并按 说明书进行操作，将多个基因组DNA同时进行测序，测序仪器为Ion Torrent? Personal Genome Machine+?:+ (PGM) (life techonologies),得到各个样本的全基因组测序结果。
[0049] 2、在21-二体综合征筛查程序中调用samtools-0. 1. 19软件，将步骤1得到的正常 对照血样本的基因组测序结果以及步骤1得到的待测血样本的全基因组测序结果输入21-三 体综合征筛查程序，输入以下命令"perl T21.pl Ctrl test20"，程序输出Xi(i = l?20)。
[0050] Γ = ---^==?t(20- 1): 是 Xi (i = 1 ?20)的平均值；sd(x)是 Xi (i = 1 ? 20)的标准差；
[0051] P = t(19) (X)是自由度为19的t分布的概率密度函数；
[0052] 如果p < 0.01，待测胎儿为候选的21-三体综合征患者；如果p > 0.01，待测胎 儿为候选的非21-三体综合征患者；如果p = 0. 01，需要进行胎儿脐静脉穿刺检查。
[0053] 3、对21-三体综合征筛查程序的原理分析如下：
[0054] 将正常对照血样本的21号染色体分成20个等长的窗口，得到每个窗口中的 DNA片段数目，计算出每个窗口中的DNA片段数目占全基因组DNA片段总数的百分比， ControliU = 1 ?20);
[0055] 第1个窗口中属于21号染色体的DNA片段数目占全基因组DNA片段总数的百分 比命名为Control^ ;
[0056] 第2个窗口中属于21号染色体的DNA片段数目占全基因组DNA片段总数的百分 比命名为Control 2 ;
[0057] ......;
[0058] 第20个窗口中属于21号染色体的DNA片段数目占全基因组DNA片段总数的百分 比命名为Control 2。；
[0059] 将待测血样本的21号染色体分成20个等长的片段，得到每个片段中的片段数目， Test! (i = 1 ?20);
[0060] 第1个窗口中属于21号染色体的DNA片段数目占全基因组DNA片段总数的百分 比命名为Tesi^ ;
[0061] 第2个窗口中属于21号染色体的DNA片段数目占全基因组DNA片段总数的百分 比命名为Test 2 ;
[0062] ......;
[0063] 第20个窗口中属于21号染色体的DNA片段数目占全基因组DNA片段总数的百分 比命名为Test 2(l ;
[0064] χ! (i = 1 ?20) = Controli-Testi, (i = 1 ?20)。
[0065] 4、结果见表1至表9。
[0066] 每个表格表不每一次独立的测序，比如表1中有6个样本，表明这6个样本是一起 测序的。由于这6个样本均为已知样本，对6个样本两两比较。斜体数值表示正常对照血 样本和患儿母体血样本比较的P值。粗体数值表示正常对照血样本与正常对照血样本比较 的P值。斜体与粗体以外的数值表示患儿母体血样本与患儿母体血样本比较的P值。
[0067] 表 1
[0068]
【权利要求】
1. 一种辅助诊断待测胎儿是否为21-三体综合征患者的试剂盒，包括核苷酸测序仪 器、samtools-O. 1. 19软件、21-三体综合征筛查程序和记载有如下操作规程和判断标准的 载体： (1) 取一个正常对照血样本以及待测血样本，提取各个样本的基因组DNA，测序，得到 各个样本的全基因组测序结果； (2) 在21-三体综合征筛查程序中调用samtools-0. L 19软件，将步骤（1)得到的正 常对照血样本的全基因组测序结果以及步骤（1)得到的待测血样本的全基因组测序结果 输入21-三体综合征筛查程序，输入以下命令"perl T21.pl Ctrl test η，η为10以上30 以下的自然数"，程序输出Xi (i = 1?η); T = ?t(n-1): 1是 XiQ = l ?n)的平均值；sd(x)是 Xi(i = 1 ?n)的标 准差； ρ二t(Iri) (X)是自由度为η-1的t分布的概率密度函数； 如果p < 0.01，待测胎儿为候选的21-三体综合征患者；如果p > 0.01，待测胎儿为 候选的非21-三体综合征患者； 所述21-三体综合征筛查程序的计算机语言如下： 11 so !:i lollandlo; $sampIoi-$ARGV[0]; $samp I ο2-$ΑΗ(?ν [ 11; $winrk)w num〖K、r=$AR(;V[2]; preproccss($ samp lei); Itotali-geltoial($samplol, stats^); ires 1-siairegi on($sampIo1, ^ chr2l, 48129895, $window number,$totaII )* proproci^ss ($smnpl o2); .fiolH^-getlolal ($saniplo2, siats^); i#rcs2:::staircg i on ($samp I c2, ^ chr21, sam^, 48129895, $w i ndow number, $iota 12 )? / I iV.>r($i-0;$i<-S#resl;$i++) { Ircs-Srcsl[$i]-$ro^2[$i]; if($r〇K no 1 0*) ?print $vch. ^\η^;} 1； sub preprocess { my($sample)-t : HysUmiC smilmtl h view ?bq 10 '$sampldam ? $ sample. " -- I tered. bamw); syslomCsamioo I s i nelex Ssample. # -- I iered. bam/#); syHiomr^sanit-oa 1 s irkst-nis $SHiiipl e. " Π l ?νηπ? 1η：ιιιι >", Isamplin stats^); system (^samtoo I s view ' $調聯 I e, fi I iered. bam chr21 $ sample, ^ <'hr2L sam^); sub gel tola I{ my ; my Jrh-rKm1 );i leilrtmlle; $fh >npon($si); my $ iota NO; whi !o(?rh>) i chomp($ ); my il ine~~spl i i/\i/5 $ ; inc[2]; 1； $i'h - 丨 ose; return h sub stfilregion { my (Srn.e，$wiiiduw m腦ber* $reads)=i ; my $stcp~irit ($total/$window number); my $i'h=new l:i Idlandle; my iarray1; $i'h?>opcri($ri Ic); whi le(<$rh>) { ili nc=spli t/\l/,$ ; $ i dx! = i nt (($ l i ric [3]) /$stcp); i Γ ($array I [Jicixl] == undc Γ) {$array1[$idxi]=0;}: Iarray1[$i dxl]++; h for($i =0;$i<=$#arrayl;$i++) { i Γ ($array 1 [$i ] == undeΓ) { Iarray1[$i]=0; } else { Jmnray i[$ i]=$errayl[$i]/$reuds; }； h $fh->close; return farraj1; K
【文档编号】C12Q1/68GK104152553SQ201410347118
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年7月21日 优先权日:2014年7月21日
【发明者】师咏勇, 沈佳薇, 温祖佳 申请人:上海交通大学