一种甘草次酸的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种甘草次酸的制备方法，包括（1）将β-葡萄糖苷酶液固定在多孔陶瓷球中得到多孔陶瓷球固定化酶，最后用丙烯酸树脂油性胶黏剂溶液对干燥后的多孔陶瓷球固定化酶进行包封；（2）将甘草用pH8～9的氨水渗漉提取制备甘草提取液；（3）将步固定化β-葡萄糖苷酶的多孔陶瓷球，装入柱床，然后将甘草提取液流入柱床进行酶反应，然后经沉淀、过滤、结晶得到甘草次酸。本发明所述的制备方法相比酸水解催化法，反应条件温和，不污染环境，且多孔陶瓷球固定化酶与游离的细胞或者酶催化法制备甘草次酸相比，酶催化体系更稳定，一次投入可以反复使用，生产效率大大提高，非常适合工业化大规模生产。
【专利说明】一种甘草次酸的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种甘草次酸的的制备方法，属于化学制备方法【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 甘草次酸是甘草提取物的深加工系列产品之一。甘草（Glycyrrhiza Uralensis Fisch)属于豆科植物。我国西部、俄罗斯及欧洲分布较多。自古以来，甘草在很多国家广 为药用，尤其在我国医药学中许多的配方中都有甘草和甘草浸膏。近年来，随着药理活性 实验方法的发展和完善，发现甘草具有明显的抗炎，抗溃疡作用和抗变态反应作用，上述 作用主要归因于甘草的主要成分甘草甜素和甘草次酸及其衍生物。因此，甘草次酸及其衍 生物的研究开发，是近几十年来各国科学家研究的热点之一。1937年，Ruzicka确定了甘 草次酸属于五环三燕类化合物，有不同的光学异构体如18 α-，18 β -甘草次酸。
[0003] 图1为18 β -甘草次酸结构式。
[0004] 如图1所示：18 β-甘草次酸，是甘草中所含三菇类化合物甘草甜素（即甘草酸 盐GL)水解后脱去两分子萄糖醛酸的产物。
[0005] 通常可以采用酸催化和酶促催化反应从甘草酸或者甘草提取物中制备甘草次酸。 众所周知，酸催化水解法制备甘草次酸产生废液不容易处理，对环境污染较重，而且副产物 多，收率低，因此该工艺的应用受到限制。微生物酶法转化，是利用β_葡萄糖苷酶水解去 除掉甘草酸两个糖醛酸侧链，相对酸水解法，反应条件温和、转化率高，但存在使用次数有 限，每次需要重新发酵制备酶，周期较长。例如在专利201110336688. 7中发酵真菌，应用真 菌水解酶加入到甘草酸溶液中进行转化制备甘草次酸。
【发明内容】
[0006] 为了克服现有技术问题，本发明的目的在于提供一种缩短酶催化的生产周期，提 高生产效率的甘草次酸的制备方法。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为： 一种甘草次酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： β -葡萄糖苷酶的固定化：向多孔陶瓷球中加入β -葡萄糖苷酶液，所述的多孔陶瓷球 和β -葡萄糖苷酶液的质量比为100 :〇. 3?1. 5,所述的β -葡萄糖苷酶液中β -葡萄糖 苷酶的质量百分含量为0.2?0.9%，然后加入戊二醛至终浓度为0.3?0.8%，在120r/min 的转速下室温震荡交联2?6h后，在45飞5°C温度条件下干燥8?10h得到多孔陶瓷球固定 化酶，最后用丙烯酸树脂油性胶黏剂对干燥后的多孔陶瓷球固定化酶进行包封； (2) 制备甘草提取液：将甘草用pH= 8?9的氨水渗漉提取，且漉的流速为5?8ml/ min. kg,所述的甘草的质量和氨水的体积比为lg : (8?12)ml，然后用浓度为0. 2、. 8mol/ L的磷酸调节溶液的pH至6. 0,得到含有甘草酸的甘草提取液； (3) 制备甘草次酸：将步骤（1)制备得到的固定化β -葡萄糖苷酶的多孔陶瓷球，装入 柱床，首先用浓度为50mmol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液淋洗，并控制柱床温度32? 45°C，然后将甘草提取液流入柱床进行酶反应，流速为0. 5~1. 5BV/h，流出液重复上样循环 3?4次，酶反应完毕，将反应液调节pH至2. 0,甘草次酸沉淀完全后过滤，最后用二氯甲烷 结晶2次，得到甘草次酸。
[0008] 进一步，步骤（1)中所述的多孔陶瓷球的孔径为50?200 μ m，直径3?5mm。
[0009] 步骤（1)中所述的β -葡萄糖苷酶液为β -葡萄糖苷酶通过浓度为50mmol/L的 柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配置而成，且所述的β-葡萄糖苷酶液中β-葡萄糖苷酶的质 量百分含量为0. 2?0. 9%。
[0010] 步骤（1)中所述的戊二醛溶液的浓度为〇· 2?0· 8%。
[0011] 且，步骤（1)中所述的丙烯酸树脂油性胶黏剂溶液的溶剂为丙酮，所述的丙烯酸树 脂油性胶黏剂溶液的终浓度为0. 2?0. 8%。
[0012] 多孔陶瓷材料是在材料成形与烧结的过程中通过控制孔径大小和分布而形成的 一类陶瓷产品。多孔陶瓷一直倍受生物、环保领域科研人员的青睐，这是因为它作为生物催 化剂的载体具有无毒害作用、稳定性优异、传质性能好、机械强度高、生物亲合性好、操作简 单、价廉易得等优点。固定化酶技术就是用化学或物理的方法将活性酶定位于材料的限定 空间中，并使其保持生物活性且可反复利用的生物技术，多孔陶瓷对生物的固定作用力主 要有以下几种：范德华力、静电引力、共价键等，多孔陶瓷微球具有很好的机械强度和装柱 后微球内的固定化酶具有很好的重复使用活性。
[0013] 本发明的有益效果为：本发明所述的制备方法相比酸水解催化法，反应条件温和， 不污染环境，且多孔陶瓷球固定化酶与游离的细胞或者酶催化法制备甘草次酸相比，酶催 化体系更稳定，一次投入可以反复使用，生产效率大大提高，非常适合工业化大规模生产。
【具体实施方式】
[0014] 下面结合具体实施例详细说明本发明。
[0015] 在本发明所述的所有实施例中，应用到的β-葡萄糖苷酶液为β-葡萄糖苷酶通 过浓度为50mmol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配置而成；且所述的丙烯酸树脂油性胶黏 剂溶液的溶剂为丙酮。
[0016] 实施例1 : 甘草次酸的制备方法包括以下步骤： (1) β -葡萄糖苷酶的固定化：向l〇g洗净干燥后的多孔陶瓷球(孔径为50 μ m，直径 3mm)中加入100ml β -葡萄糖苷酶液(所述的β -葡萄糖苷酶液中β -葡萄糖苷酶的质量 百分含量为〇. 6%)，然后加入戊二醛至终浓度为0. 3%，在120r/min的转速下室温震荡交联 4h后，在55°C温度条件下干燥8h得到多孔陶瓷球固定化酶，最后用终浓度为0. 2%的丙烯 酸树脂油性胶黏剂对干燥后的多孔陶瓷球固定化酶进行包封； (2) 制备甘草提取液：将100g甘草用lOOOmlpH 8?9的氨水渗漉提取，且漉流速为 5ml/min. kg),然后用0. 2mol/L的磷酸调节溶液的pH至6. 0,得到含有甘草酸的甘草提取 液； (3) 制备甘草次酸：将步骤（1)制备得到的固定化β-葡萄糖苷酶的多孔陶瓷球，装入 柱床，首先用浓度为50mmol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液淋洗，并控制柱床温度32°C，然 后将甘草提取液流入柱床进行酶反应，流速为〇. 5BV/h，流出液重复上样循环3?4次，酶反 应完毕，将反应液调节pH至2. 0,甘草次酸沉淀完全后过滤，最后用二氯甲烷结晶2次，得到 甘草次酸。
[0017] 经HPLC测试，所得产物甘草次酸的纯度> 98%。
[0018] 实施例2: 甘草次酸的制备方法包括以下步骤： (1) β-葡萄糖苷酶的固定化：向l〇g洗净干燥后的多孔陶瓷球(孔径为ΙΟμπι，直径 4mm)中加入100ml β -葡萄糖苷酶液(所述的β -葡萄糖苷酶液中β -葡萄糖苷酶的质量 百分含量为〇. 8%)，然后加入戊二醛至终浓度为0. 6%，在120r/min的转速下室温震荡交联 5h后，在50°C温度条件下干燥8h得到多孔陶瓷球固定化酶，最后用终浓度为0. 7%的丙烯 酸树脂油性胶黏剂对干燥后的多孔陶瓷球固定化酶进行包封； (2) 制备甘草提取液：将100g甘草用1200mlpH 8?9的氨水渗漉提取，且漉流速为 6ml/min. kg,然后用0. 3mol/L的磷酸调节溶液的pH至6. 0,得到含有甘草酸的甘草提取 液； (3) 制备甘草次酸：将步骤（1)制备得到的固定化β-葡萄糖苷酶的多孔陶瓷球，装入 柱床，首先用浓度为50mmol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液淋洗，并控制柱床温度35°C，然 后将甘草提取液流入柱床进行酶反应，流速为1. 〇BV/h，流出液重复上样循环3?4次，酶反 应完毕，将反应液调节pH至2. 0,甘草次酸沉淀完全后过滤，最后用二氯甲烷结晶2次，得到 甘草次酸。
[0019] 经HPLC测试，所得产物甘草次酸的纯度> 98%。
[0020] 实施例3 : 甘草次酸的制备方法包括以下步骤： (1) β -葡萄糖苷酶的固定化：向l〇g洗净干燥后的多孔陶瓷球(孔径为200 μ m，直径 5mm)中加入100ml β-葡萄糖苷酶液(所述的β-葡萄糖苷酶液中β-葡萄糖苷酶的质量 百分含量为〇. 7%)，然后加入戊二醛至终浓度为0. 8%，在120r/min的转速下室温震荡交联 6h后，在50°C温度条件下干燥9h得到多孔陶瓷球固定化酶，最后用终浓度为0. 8%的丙烯 酸树脂油性胶黏剂对干燥后的多孔陶瓷球固定化酶进行包封； (2) 制备甘草提取液：将100g甘草用lOOOmlpH 8?9的氨水渗漉提取，且漉流速为 86ml/min. kg),然后用0. 6mol/L的磷酸调节溶液的pH至6. 0,得到含有甘草酸的甘草提取 液； (3) 制备甘草次酸：将步骤（1)制备得到的固定化β-葡萄糖苷酶的多孔陶瓷球，装入 柱床，首先用浓度为50mmol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液淋洗，并控制柱床温度38°C，然 后将甘草提取液流入柱床进行酶反应，流速为1. 2BV/h，流出液重复上样循环3?4次，酶反 应完毕，将反应液调节pH至2. 0,甘草次酸沉淀完全后过滤，最后用二氯甲烷结晶2次，得到 甘草次酸。
[0021] 经HPLC测试，所得产物甘草次酸的纯度> 98%。
[0022] 此外，上述实施例1-3中所述的反应柱上的多孔陶瓷球固定化酶，均可以连续使 用90天，酶活力任然在90%以上。
[0023] 本发明按照上述实施例进行了说明应当理解，上述实施例不以任何形式限定本发 明，凡采用等同替换或等效变换方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1. 一种甘草次酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) β-葡萄糖苷酶的固定化：向多孔陶瓷球中加入β-葡萄糖苷酶液，所述的多孔陶 瓷球和β -葡萄糖苷酶液的质量比为100 :〇. 3?1. 5,所述的β -葡萄糖苷酶液中β -葡萄 糖苷酶的质量百分含量为〇. 2?0. 9%，然后加入戊二醛至终浓度为0. 3?0. 8%，在120r/ min的转速下室温震荡交联2?6h后，在45飞5°C温度条件下干燥8?10h得到多孔陶瓷球 固定化酶，最后用丙烯酸树脂油性胶黏剂对干燥后的多孔陶瓷球固定化酶进行包封； (2) 制备甘草提取液：将甘草用pH= 8?9的氨水渗漉提取，且漉的流速为5?8ml/ min. kg,所述的甘草的质量和氨水的体积比为lg : (8?12)ml，然后用浓度为0. 2、. 8mol/ L的磷酸调节溶液的pH至6. 0,得到含有甘草酸的甘草提取液； (3) 制备甘草次酸：将步骤（1)制备得到的固定化β-葡萄糖苷酶的多孔陶瓷球，装入 柱床，首先用浓度为50mmol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液淋洗，并控制柱床温度32? 45°C，然后将甘草提取液流入柱床进行酶反应，流速为0. 5~1. 5BV/h，流出液重复上样循环 3?4次，酶反应完毕，将反应液调节pH至2. 0,甘草次酸沉淀完全后过滤，最后用二氯甲烷 结晶2次，得到甘草次酸。
2. 根据权利要求1所述的一种甘草次酸的制备方法，其特征在于，步骤（1)中所述的多 孔陶瓷球的孔径为50?200 μ m，直径3?5mm。
3. 根据权利要求1所述的一种甘草次酸的制备方法，其特征在于，步骤（1)中所述的 β -葡萄糖苷酶液为β -葡萄糖苷酶通过浓度为50mmol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配 置而成，且所述的β -葡萄糖苷酶液中β -葡萄糖苷酶的质量百分含量为0. 2?0. 9%。
4. 根据权利要求1所述的一种甘草次酸的制备方法，其特征在于，步骤（1)中所述的戊 二醛溶液的质量浓度为2?6%。
5. 根据权利要求1所述的一种甘草次酸的制备方法，其特征在于，步骤（1)中所述的丙 烯酸树脂油性胶黏剂溶液的溶剂为丙酮，且所述的丙烯酸树脂油性胶黏剂溶液的终浓度为 0· 2 ?0· 8%。
【文档编号】C12P33/06GK104087646SQ201410347000
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月21日 优先权日:2014年7月21日
【发明者】魏元刚, 杨永安, 钟慧 申请人:江苏天晟药业有限公司