专利名称：一株通过发酵甘草提高甘草次酸含量的内生真菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株内生真菌。
背景技术：
甘草为豆科(Leguminosae)甘草属(Glycyrrhiza Linn)属乌拉尔甘草(G. uralensis Fisch)，胀果甘草(G. inflate Bat)和光果甘草(G. glabra L)的干燥根和根茎，广泛分布于我国东北、西北及华北等地。甘草性味甘平，为补气类中药，具有补中 益气、清热解毒、润肺止咳、缓急止痛、调和药性等功效。中医处方离不开甘草，自古至今，广为药用，兼有“国老”的尊号。近年来，野生甘草因过度采挖强度而濒临灭绝，甘草已被列入《野生药材资源保护条例》的国家二级保护植物。甘草的主要成分为甘草次酸，具有防癌、抑癌的作用，是医药、化妆品、食品的生产原料。甘草次酸的来源主要有两个途径一是化学合成，二是从甘草中提取。上述两种途径均需要利用甘草资源，因此如何高效利用甘草资源是人们的研究热点。
发明内容
本发明提供了一株通过发酵甘草提高甘草次酸含量的内生真菌。本发明通过发酵甘草提高甘草次酸含量的内生真菌，它为产黄青霉(Penicilliumchrysogenum) RElI,已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No M2012047,保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2012年2月29日；它在PDA固体培养基上培养7d后，菌落直径为6 8cm，菌落为绿色，基质为黄色，菌丝较密集，菌落边缘整齐，紧贴培养基，产分生孢子，分生孢子头呈圆柱状，分生孢子单生，单细胞。本发明通过发酵甘草提高甘草次酸含量的内生真菌，它为产黄青霉(Penicilliumchrysogenum) RE 11,其ITS序列提交至NCBI网页，通过Blast搜索与所得到的序列相似性高的序列，并通过MEGA5. 03软件构建系统进化树，REll菌株的ITS序列与青霉属菌(Penicillium chrysogenum,编号GQ161752. I)菌株的相似性都达到了 99%以上，结合形态学观察结果，确定内生真菌REll为产黄青霉(Penicillium chrysogenum)。本发明通过发酵甘草提高甘草次酸含量的内生真菌，它为产黄青霉(Penicilliumchrysogenum) RElI,已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No M2012047,保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2012年2月29日。本发明利用微生物制药手段提取分离甘草健康植株的内生真菌RE11，以其发酵甘草，以HPLC法为分析手段测定经甘草内生真菌REll发酵甘草后甘草次酸的含量，结果甘草发酵后甘草次酸含量显著高于生药。将获得的内生真菌REll菌株通过形态学观察和ISSrDNA序列分析鉴定其种属。本发明通过发酵甘草提高甘草次酸含量的内生真菌，它为产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)RE11，能够以甘草为底物对其进行发酵可使甘草中的甘草次酸含量显著升高；甘草次酸是经典的抗炎药物目前在医药化妆品等领域中广泛应用，还具有防癌和抗癌作用；本发明对采用甘草内生真菌REll发酵甘草生产甘草次酸具有指导意义。
图I为具体实施方式
一中产黄青霉(Penicillium chrysogenum)REll的孢子显微结构图；图2为具体实施方式
一中产黄青霉(Penicillium chrysogenum) RElI的PCR扩增的电泳图，其中M泳道表示Marker, I泳道表示REll ;图3为具体实施方式
一中产黄青霉(Penicillium chrysogenum) REll的系统进化树图； 图4为具体实施方式
一中甘草次酸对照品的HPLC色谱图，其中I表示甘草次酸；图5为具体实施方式
一中甘草的HPLC色谱图，其中I表示甘草次酸；图6为具体实施方式
一中甘草加入对照品后甘草次酸的HPLC色谱图，其中I表示加对照品后甘早次Ife ；图7为具体实施方式
一中REll发酵甘草后甘草次酸的HPLC色谱图，其中I表示甘草次酸。
具体实施例方式具体实施方式
一本实施方式通过发酵甘草提高甘草次酸含量的内生真菌，它为产黄青霉(Penicillium chrysogenum)REll，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No M 2012047，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2012年2月29日。本实施方式中产黄青霉(Penicillium chrysogenum) RE 11,它在PDA固体培养基上培养7d后，菌落直径为6 8cm，菌落为绿色，基质为黄色，菌丝较密集，菌落边缘整齐，紧贴培养基，产分生孢子，分生孢子头呈圆柱状，分生孢子单生，单细胞。本实施方式中产黄青霉(Penicillium chrysogenum) RElI,其生长温度为28°C,生长pH值自然。本实施方式中通过发酵甘草提高甘草次酸含量的内生真菌，它为产黄青霉(Penicillium chrysogenum) RE 11,该菌株分离自健康的野生甘草的根莖，采自大庆地区，植株年龄3年，植株健壮，无病虫害，其样本现存于黑龙江大学生命科学学院生物制药专业实验室；它按以下步骤进行分离培养选取健康的野生甘草的根茎用自来水冲洗干净后以无菌滤纸吸干水分，切成Icm小段于无菌超净台内将甘草的根茎按下述方法进行表面消毒75%酒精浸泡lmin-2%次氯酸钠浸泡15min-无菌水冲洗3次；用无菌手术刀将野生甘草的根茎从中间切开，分别置于5%甘草提取液马铃薯固体分离培养基和5%甘草提取液马铃薯液体分离培养基中，于28°C恒温水浴摇床和恒温培养箱中，培养3 5d，待实验材料周围长出菌体，挑取菌体转入平板(5%甘草提取液马铃薯固体分离培养基)多次划线分离纯化，将纯化后的菌株置于斜面固体培养基中，4°C保存备用；其中5%甘草提取液马铃薯固体分离培养基每L由200g的马铃薯、20g的葡萄糖、20g的琼脂和余量的5%甘草提取液组成，pH值为7. O 7. 2，121°C下高压灭菌30min ；5%甘草提取液马铃薯液体分离培养基每L由200g的马铃薯、20g的葡萄糖和余量的5%甘草提取液组成，pH值为7. O 7. 2，121 °C下高压灭菌30min ；斜面固体培养基为取5mL5%甘草提取液马铃薯固体分离培养基装于试管中，121°C高压灭菌30min后，铺成斜面冷却，以备保存菌种。结果从野生甘草的根茎中分离出内生真菌RE11，并且阴性对照中对照平板和对照液体培养基内均无任何菌长出，多次重复均如此，证明所分到的菌是植物内生真菌，而不是表面的附生菌。筛选出的内生真菌RElI根据《真菌分类学》、《真菌鉴定手册》和《半知菌属图解》进行形态学鉴定，其菌落特征和孢 子形态与青霉属菌特征极为相近，孢子显微结构如图I所示；分子鉴定内生真菌REll发酵液抽滤得菌丝体用25%乙醇漂洗2次，灭菌的去离子水冲洗2次，离心去上清液，提取总DNA后进行目的片段的PCR扩增，将含有目标条带的PCR产物全部进行再一次的点样，用2 %的琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下用解剖刀将目的条带切下，用DNA胶回收试剂盒回收，制备感受态大肠杆菌细胞，将PCR产物与pMD18-T载体进行连接后，连接产物加入到感受态细胞中，进行进行菌落PCR验证；挑取单菌落进行大肠杆菌转化子的PCR检测，证明目的片段已成功转化进入感受态细胞中后，将克隆阳性菌株送上海生工生物工程技术服务有限公司测序；所测定的核苷酸序列在NCBI数据库中应用BLAST分析进行同源性比较，并根据分子生物学研究的基本原理选择相应种属代表菌株的18S rDNA 序列应用软件 CLUSTALX I. 83 和 MEGA5. 03 以近邻结合法(Neighbor-joining)构建系统发育树，bootstrap检验值> 50% (1000重复)，确定目标菌株的分类地位；内生真菌REll基因组经尿素法提取后，采用PCR扩增后凝胶成像结果如图2所示，在500bp附近得到一扩增片段(碱基序列见SEQ ID N0:1))，证明已成功从内生真菌REll菌株中提取出其基因组DNA ；根据内生真菌REll的ITS序列提交至NCBI网页，通过Blast搜索与所得到的序列相似性高的序列，并通过MEGA5. 03软件构建系统进化树(见图3)，REll菌株的ITS序列与青霉属菌(Penicillium chrysogenum,编号GQ161752. I)菌株的相似性都达到了99%以上，结合形态学观察结果，确定筛选出的内生真菌REll为产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)。本实施方式中产黄青霉(Penicillium chrysogenum) RElI,其发酵甘草提高甘草次酸含量的实验结果如表I所示，甘草内生真菌REll发酵甘草提高甘草次酸含量的实验结果表明，REll能够通过发酵甘草使其中的甘草次酸含量显著升高。表I
组别KEll发酵的甘草样甘草生药空白对照 PUA对照
品
甘草次酸含量 O. 516±0.0025 Λ 0.128 土 0.223 土 - (mg/g)Δ0.00110.0008注同生药组相比*Ρ< 0.05，#Ρ <0.01 ;同阴性对照组相比Λ P < O. 05，ΛΛ P
<0.01 ；PDA对照无甘草次酸产生。
本实施方式中产黄青霉(Penicillium chrysogenum) RElI,其发酵甘草提高甘草次酸含量的检测如下取干燥甘草根，用粉碎机粉碎后过40目筛。精确称取6g甘草粉，放入IOOmL三角瓶中，向其中加入30mL的蒸馏水，密封后，121°C高压灭菌30min。取出，作为底物。向已活化的REll菌株试管中加入无菌水，制成I X 106CFU/mL的菌悬液，将此菌悬液5mL加入到底物中，另取甘草粉加等量的无菌水作为空白对照，将制备好的样品于28°C，120r/min摇床培养14天。取出，冻干，即为甘草发酵样品，备用。每个样品做6个重复。精密称取甘草发酵样品lg，准确加入IOmL的色谱甲醇，称重，超声提取2h，取出， 放冷，以色谱甲醇补足重量，过滤，取续滤液4mL，于IOmL容量瓶中定容，待测。同时精密称取甘草生药Ig加入IOmL的色谱甲醇，称重，超声提取2h，取出，放冷，以色谱甲醇补足重量，过滤，取续滤液4mL，于IOmL容量瓶中定容，作为生药对照待测。甘草发酵前后甘草次酸含量的测定色谱条件色谱柱VenusiLXBP-C18 柱(4. 6mmX 250mm, 5 μ m)；流动相甲醇-水-冰醋酸(82 17 I)；流速ImL· mirf1 ；检测波长254nm；柱温25°C；进样量10μ L在色谱条件下，甘草内生真菌REll发酵甘草所制备的供试品与甘草次酸对照品相应位置的色谱峰一致，而且色谱峰经过对照品加入法得到了较好的确认，结果见图4、5、6和7,结论内生真菌REll为产黄青霉(Penicillium chrysogenum) RE 11,其以甘草为底物进行发酵能够使甘草中甘草次酸含量显著升高，本实施方式对采用甘草内生真菌REll生产甘草次酸具有指导意义。
权利要求
1. 一株通过发酵甘草提高甘草次酸含量的内生真菌，其特征在于它为产黄青霉(Penicillium chrysogenum) RElI,已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNo M 2012047，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2012年2月29日。
全文摘要
一株通过发酵甘草提高甘草次酸含量的内生真菌，它涉及一株内生真菌。通过发酵甘草提高甘草次酸含量的内生真菌，它为产黄青霉(Penicillium chrysogenum)RE11，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NoM 2012047，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2012年2月29日。本发明中通过发酵甘草提高甘草次酸含量的内生真菌，能够以甘草为底物对其进行发酵可使甘草中的甘草次酸含量显著升高；甘草次酸是经典的抗炎药物目前在医药化妆品等领域中广泛应用，还具有防癌和抗癌作用；本发明对采用甘草内生真菌RE11发酵甘草生产甘草次酸具有指导意义。
文档编号C12N1/14GK102643755SQ20121012626
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月26日 优先权日2012年4月26日
发明者孔德崴, 孙雅北, 白长胜, 谭佳音, 郑春英 申请人:黑龙江大学