专利名称：在牛mstn基因中引入移码突变的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域的基因工程技术，涉及一种通过基因打靶技术在牛MSTN基因中引入移码突变的方法，该移码突变是MSTN基因第4843bp到第4853bp共Ilbp缺失导致的。
背景技术：
生长/ 分化因子-8 (growth/difference factor-8, GDF-8)是 1997 年美国JohnHopkins大学医学院的Mepherron和Lee等研究小鼠的转化生长因子P (TGF-^ )超家族时发现的一种新的蛋白质因子基因，他们将这一基因命名为生长/分化因子_8，即 ⑶F-8。通过试验研究表明⑶F-8正常情况下编码一种蛋白，这种蛋白呈现出骨骼肌生长的负调控因子活性，从而把它称为肌生成抑制素(myostatin，即MSTN)。牛的MSTN基因位于2号染色体着丝点与微卫星标记(TGLA44)之间，距离着丝点微卫星标记(BTA2)约2 3cm，它是骨骼肌生长发育的负调节因子，属于TGF-P超家族成员，为不完全显性遗传。该基因含有2个内含子和3个外显子。第I个外显子与第2个外显子的长度分别是506bp和374bp ;第3个外显子的长度因poly (A)尾巴位点的不同而有所不同(1701bp、1812bp或1887bp)。两个内含子的长度分别为1840和2033bp。外显子与内含子连接区域序列遵守GT-AG规则。MSTN基因在不同物种间有高度的保守性。McPheffon和Lee以小鼠MSTN保守的C-末端编码序列为探针，对小鼠、大鼠、人、牛、猪、羊、鸡、火鸡及斑马鱼的MSTN的cDNA进行了克隆和测序，结果表明，各种动物的MSTN序列高度保守，其N-末端都有分泌必须的信号肽序列，都有类胰蛋白酶作用水解加工位点(RSRR)，都含有TGF- ^的超家族的富含半胱氨酸的保守区，并且在大鼠、小鼠、人、猪、鸡及火鸡的水解加工位点后的C-末端完全相同，同源率为100%。而牛、绵羊、狒狒的成熟蛋白中也仅有I 3个氨基酸不同；斑马鱼的MSTN的基因序列保守性较差，与其他动物的C-末端的同源性为88%。当该基因发生突变后，myostatin失活，失去生理功能。MSTN的生理功能是限制骨骼肌的生长，当它发生突变之后，这种限制作用就消失了，然后肌肉就表现过度发育，不仅肌纤维数目增多(hyperplasia),而且直径也增大(hypertrophy)。牛的肌肥大症又称肌纤维增生症(myofibrehyperplasia, MH)或双肌症(double muscling, DM),是由持续提高胴体品质的选育所产生的一种肌纤维肥大和骨骼肌数量增加的遗传突变表型。比利时兰牛(Belgian Blue)是一种典型的具有双肌表型的牛。Lee Se-Jin等对比利时兰牛的MSTN基因外显子进行了 PCR扩增、克隆和序列测定。结果表明，比利时兰牛的MSTN基因发生了突变，在外显子3上缺失了 11个核苷酸，导致此位点后阅读框架发生改变，并在此点后的第14个密码子处终止了阅读框架，从而使MSTN被截短。这种缺失位于C-端区第7个氨基酸上，使得MSTN失去了 102个氨基酸，因此，翻译出的是一个截断的蛋白，不能发挥其抑制肌肉生成的生物学功能，从而表现出双肌症状。双肌牛的表型特征是臀部、大腿、上臂、胸及起支撑作用的中前段肌肉群异常发达，皮下脂肪少，且有更多的脂肪沉积于肌纤维之间，皮肤薄，这些变化恰好符合人们所追求的高瘦肉率、肉质香嫩的育种目标。在生产中用双肌牛做终端父本所杂交改良的品种已经给人们带来了巨大的经济效益。
发明内容
鉴于MSTN基因的移码突变对产肉性状的影响，本发明的目的在于提供一种通过基因打靶将移码突变引入牛MSTN基因组中的方法，借助此方法可以得到拥有双肌症状的转基因牛，以改善其产肉性状，借此提高牛肉的品质与产量。本发明的技术方案如下一种在牛基因中引入MSTN基因移码突变的方法，包括以下步骤(I)带有移码突变的牛MSTN基因同源短臂的构建 合成构建的同源短臂是从牛MSTN基因第4741bp到第6681bp，包括部分内含子2和绝大部分的外显子3，但在第3外显子上缺失第4843bp到第4853bp，共llbp。得到的同源短臂共1930bp，并在其5’端引入了一个Xba I酶切位点，3’端引入了一个Pme I酶切位点。(2)牛MSTN基因同源长臂的构建合成构建的同源长臂是从牛的MSTN基因的第Ibp到第4740bp，包括1、2外显子，内含子I及部分内含子2，共4740bp，并在其5’端引入了一个PacI酶切位点，3’端引入了一个Not I酶切位点。(3)打靶载体的构建①用Pac I和Not I双酶切所述同源长臂及pFPC-1载体，通过连接酶连接，使所述同源长臂插入质粒载体PFPC-I的Pac I和Not I酶切位点；②用Xba I和Pme I双酶切所述同源短臂和步骤①获得的插入有同源长臂的质粒载体pFPC-1，通过连接酶连接，使所述同源短臂插入到Xba I和Pme I酶切位点，得到打靶载体 pFPC-MSTN ；(4)牛MSTN基因移码突变的引入①用Pac I或Pme I单酶切处理所述打靶载体pFPC-MSTN使其线性化，用脂质体转染试剂转染牛体细胞，同源重组后使筛选标记基因Neo-TK及移码突变引入牛MSTN基因中，用G418和DTA特性对成功进行同源重组的细胞株进行筛选；②用含有重组酶Cre基因的腺病毒载体转染293细胞，进行病毒包装，通过反复冻融转染293细胞收集病毒，利用收集的病毒感染步骤①所得的筛选后的细胞株，用Cre酶的活性删除Ioxp位点当中的筛选基因Neo-TK，用GANC筛选出成功删除Neo-TK后的细胞株；在牛基因中引入了 MSTN基因移码突变。而且、所述步骤(3)的①步中是用胶回收酶切产物得质粒载体pFPC-1 步中是用胶回收酶切产物得到打靶载体pFPC-MSTN，然后通过转化大肠杆菌DH5 a，酶切鉴定连接效果。而且、所述步骤(4)的①步中的用G418和DTA特性对成功进行同源重组的细胞株进行筛选是转染后24-40小时加入G418对同源重组细胞进行筛选。而且、所述步骤(4)的②步中的用含有重组酶Cre基因的腺病毒载体转染293细胞是首先构建含有重组酶Cre基因的载体pAdTrack-CMV，获得质粒载体pAdTrack-Cre ；然后将骨架载体pAd-Easy-1转化BJ5183菌株，获得pAd-Cre载体；然后利用Pac I酶切线性化载体pAd-Cre，转染293细胞。本发明的优点及效果I、本发明将插入点选在内含子中，这样可以使插入的LoxP等多余的序列位于内含子中，可以使基因组在打靶前后不受影响。2、本发明构建的打靶载体中包括筛选基因片段Neo-TK和Ioxp位点，不但可以利用Neo抗性对打靶成功的细胞进行筛选，同时可以利用Cre-loxp系统删除标记基因。3、本发明利用TK的特性对删除标记基因后的细胞进行筛选，保证最后得到的是不含筛选标记的移码突变。4、利用本发明在牛基因中引入MSTN基因移码突变的方法所得到的品种具有肌肉
群异常发达，皮下脂肪少，皮肤薄，高瘦肉率、肉质香嫩的特点，能够带来了巨大的经济效.、
Mo
图I是本发明质粒载体pFPC-1的结构示意图；图2是本发明打靶载体pFPC-MSTN的结构示意图。
具体实施例方式下面结合具体实施方案对本发明进一步说明，其具体实施方案应该理解为仅为举例说明，不是限定性的，不能以下述举例说明来限定本发明的保护范围。本发明的设计思路是根据应用Cre-LoxP系统将移码突变导入基因组的原理，设计两段同源臂，携带移码突变的外显子位于同源短臂上靠近筛选基因的一端。为了使基因组在打靶前后尽量不受影响，将插入点选在内含子中，这样可以使插入的LoxP等多余的序列位于内含子中。移码突变应尽量放在离正筛选标记基因较近的位置，移码突变位于牛MSTN基因第三外显子处，因此将打靶载体的插入点选在第2内含子上。下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细说明一种在牛基因中引入MSTN基因移码突变的方法，包括以下步骤(I)带有移码突变的牛MSTN基因同源短臂的构建构建的同源短臂从牛MSTN基因第4741bp到第6681bp，包括部分内含子2和绝大部分的外显子3，但在第3外显子上缺失第4843bp到第4853bp，共llbp，设计出的同源短臂共1930bp，并在其5’端设计了一个Xba I酶切位点，3’端设计了一个Pme I酶切位点，设计好的基因序列交由生物公司合成，最后得到包含Xba I和Pme I酶切位点的同源短臂。(2)牛MSTN基因同源长臂的构建构建的同源长臂从牛的MSTN基因的第Ibp到第4740bp，包括1、2外显子，内含子I及部分内含子2，共4740bp，并在其5’端设计了一个Pac I酶切位点，3’端设计了一个NotI酶切位点，设计好的基因序列交由生物公司合成，最后得到包含Pac I和Not I酶切位点的同源长臂。
(3)打靶载体的构建①用Pac I和Not I双酶切所述同源长臂及pFPC-1载体，连接，使所述同源长臂插入质粒载体PFPC-I的Pac I和Not I酶切位点；如图I或2所示。具体步骤是Pac I和Not I双酶切牛MSTN基因同源长臂反应体系50ii L反应体系，超纯水21 iiL，IOXFastDigest Buffer 5yL，同源长臂胶回收产物 20 u L, FastDigest Pac I 2 U L, FastDigest Not I 2 U L0反应条件37°CIh,65°C 15min ；
胶回收酶切产物；Pac I和Not I双酶切pFPC-1质粒载体反应体系40iiL 反应体系，超纯水 21 iiL，IOXFastDigest Buffer 5yL，质粒pFPC-110 u L，FastDigest Pac I 2 u L，FastDigest Not I 2uL。反应条件37°Clh,65°C 15min。胶回收酶切产物。连接两种胶回收酶切产物反应体系20 U L反应体系，同源长臂回收产物5 u L，质粒pFPC_l回收产物5 ii L，T4 DNALigase I u L, T4连接酶缓冲液2 y L，超纯水7 y L。反应条件22°C4h。转化大肠杆菌DH5 a，酶切鉴定连接效果。②用Xba I和Pme I双酶切所述同源短臂和步骤①获得的插入同源长臂后的质粒载体pFPC-1，连接，使所述同源短臂插入到Xba I和Pme I酶切位点，得到打靶载体pFPC-MSTN ;如图I或2所示。具体步骤是Xba I和Pme I双酶切所述同源短臂反应体系50ii L反应体系，超纯水21 iiL，IOXFastDigest Buffer 5yL，同源短臂胶回收产物 20 u L, FastDigest Nsi I 2 U L, FastDigest Pme I 2 U L0反应条件37°CIh,65°C 15min ；胶回收酶切产物；Xba I和Pme I双酶切步骤①获得的插入同源长臂后的质粒载体pFPC_l反应体系40 ii L反应体系，超纯水21 iiL，IOXFastDigest Buffer 5yL，步骤①获得的插入同源长臂后的质粒载体pFPC-1 10 V- L, FastDigest Nsi I 2 U L, FastDigestPme I 2 u L0反应条件37°CIh,65°C 15min。胶回收酶切产物。连接两种胶回收酶切产物反应体系20i! L反应体系，同源短臂片段回收产物5 y L，插入同源长臂后的质粒载体pFPC-1回收产物5 ii L，T4 DNALigase I u L, T4连接酶缓冲液2 y L，超纯水7 y L。反应条件22°C4h。转化大肠杆菌DH5 a，酶切鉴定，进一步经测序证实为正确连接，得到打靶载体pFPC-MSTN(图 2)。(4)移码突变的引入①用Pac I或Pme I单酶切处理所述打靶载体pFPC-MSTN使其线性化，备用；②在转染前一天把牛体细胞培养到六孔板内，使第二天细胞能达到约70-80%满，在进行转染前，每孔更换成新鲜的细胞培养液2ml ；按照脂质体转染试剂说明书转染牛体细胞，同源重组后使筛选标记基因Neo-TK及移码突变点引入牛MSTN基因第三外显子，用G418和DTA特性对成功进行同源重组的细胞株进行筛选；
具体步骤为把Lipofecter脂质体转染试剂轻轻混匀。在一洁净无菌离心管内依次加入4 u ILipofecter,适量不含抗生素和glutamine的DMEM溶液,及I. 5 u g线性化pFPC-MSTN,使最终体积为70 iil，用枪轻轻吹打混匀。15-25°C孵育15分钟。把70 ill Lipof ecter-线性化pFPC-MSTN混合物全部加入六孔板的一个孔内，轻轻混匀。细胞培养箱内培养5-6小时后，吸除含有Lipofecter-线性化pFPC-MSTN的培养液。每孔加入2ml新鲜细胞培养液继续培养。转染后24-40小时加入800ug/ml G418对同源重组细胞进行筛选，成功发生同源重组的细胞因含有Neo-TK正筛选标记基因而具有G418抗性而存活，非同源重组细胞因线性化pFPC-MSTN序列随机整合入细胞基因组，从而将副筛选标记基因DTA引入细胞，DTA的毒性将导致细胞死亡，保证筛选出的细胞为正确同源重组后的细胞。最终通过同源重组将筛选标记基因Neo-TK及移码突变引入了牛MSTN基因第3外显子。③用含有重组酶Cre基因的腺病毒载体转染293细胞进行病毒包装，收集腺病毒，感染步骤②成功同源重组后的细胞株，用Cre酶的活性删除Ioxp位点当中的筛选基因Neo-TK，用GANC筛选出成功删除Neo-TK后的细胞株；在牛MSTN基因组中引入了移码突变。具体步骤是本发明中构建的打靶载体中筛选基因片段Neo-TK两旁含有Ioxp位点，可以利用Cre-Ioxp系统删除标记基因。构建含有重组酶Cre基因的载体，在pAdTrack-CMV载体的多克隆位点，插入重组酶基因Cre，序列全长1032bp (EMBL数据库登陆号X03453)，获得质粒载体pAdTrack-Cre。将骨架载体pAd-Easy-1转化BJ5183菌株，筛选阳性克隆，扩增，以该菌株制备感受态细胞。用Pme I酶切pAdTrack-Cre,转化感受态BJ5183菌(含pAd-Easy-1),进行同源重组，筛选，获得pAd-Cre载体。利用Pac I酶切线性化载体pAd-Cre，转染293细胞，通过反复冻融转染的293细胞，收集病毒，测定病毒滴度。利用收集的病毒，感染②中同源重组后的细胞，利用Cre酶的活性删除Ioxp位点当中的筛选基因Neo-TK，利用GANC对处理后的细胞进行筛选，因TK可使无毒的GANC转变为毒性核苷酸，从而杀死细胞，所以Neo-TK未删除细胞因GANC的毒性作用不能存活，保证最后得到的是不含筛选标记基因的突变细胞，最终将移码突变引入牛MSTN基因第3外显子。本发明中构建的打靶载体中包括筛选基因片段Neo-TK和Ioxp位点，不但可以利用Neo抗性对打靶成功的细胞进行筛选，同时可以对利用Cre-loxp系统删除标记基因，并 利用TK的特性对删除标记基因后的细胞进行筛选，保证最后得到的是不含筛选标记的移
码突变。
权利要求
1.一种在牛MSTN基因中引入移码突变的方法，其特征在于包括以下步骤 (1)带有移码突变的牛MSTN基因同源短臂的构建 合成构建的同源短臂是从牛MSTN基因第4741bp到第6681bp，包括部分内含子2和绝大部分的外显子3，但在第3外显子上缺失第4843bp到第4853bp，共llbp。得到的同源短臂共1930bp，并在其5’端引入了一个Xba I酶切位点，3’端引入了一个Pme I酶切位点； (2)牛MSTN基因同源长臂的构建 合成构建的同源长臂是从牛的MSTN基因的第Ibp到第4740bp，包括1、2外显子，内含子I及部分内含子2，共4740bp，并在其5’端引入了一个Pac I酶切位点，3’端引入了一个Not I酶切位点； (3)打靶载体的构建 ①用PacI和Not I双酶切所述同源长臂及pFPC-1载体，通过连接酶连接，使所述同源长臂插入质粒载体PFPC-I的Pac I和Not I酶切位点； ②用XbaI和Pme I双酶切所述同源短臂和步骤①获得的插入有同源长臂的质粒载体pFPC-1，通过连接酶连接，使所述同源短臂插入到Xba I和Pme I酶切位点，得到打靶载体pFPC-MSTN ； (4)牛MSTN基因移码突变的引入 ①用PacI或Pme I单酶切处理所述打靶载体pFPC_MSTN使其线性化，用脂质体转染试剂转染牛体细胞，同源重组后使筛选标记基因Neo-TK及移码突变弓I入牛MSTN基因中，用G418和DTA特性对成功进行同源重组的细胞株进行筛选； ②用含有重组酶Cre基因的腺病毒载体转染293细胞，进行病毒包装，通过反复冻融转染293细胞收集病毒，利用收集的病毒感染步骤①所得的筛选后的细胞株，用Cre酶的活性删除Ioxp位点当中的筛选基因Neo-TK，用GANC筛选出成功删除Neo-TK后的细胞株；在牛基因中引入了 MSTN基因移码突变。
2.根据权利要求I所述的在牛基因中引入MSTN基因移码突变的方法，其特征在于所述步骤(3)的①步中是用胶回收酶切产物得质粒载体pFPC-1 ;②步中是用胶回收酶切产物得到打靶载体pFPC-MSTN，然后通过转化大肠杆菌DH5 a，酶切鉴定连接效果。
3.根据权利要求I所述的在牛基因中引入MSTN基因移码突变的方法，其特征在于所述步骤(4)的①步中的用G418和DTA特性对成功进行同源重组的细胞株进行筛选是转染后24-40小时加入G418对同源重组细胞进行筛选。
4.根据权利要求I所述的在牛基因中引入MSTN基因移码突变的方法，其特征在于所述步骤(4)的②步中的用含有重组酶Cre基因的腺病毒载体转染293细胞是首先构建含有重组酶Cre基因的载体pAdTrack-CMV，获得质粒载体pAdTrack-Cre ;然后将骨架载体pAd-Easy-1转化BJ5183菌株，获得pAd-Cre载体；然后利用Pac I酶切线性化载体pAd-Cre，转染293细胞。
全文摘要
本发明公开了一种在牛MSTN基因中引入移码突变的方法。本发明构建了一个牛MSTN基因移码突变的打靶载体，通过同源重组将移码突变引入牛MSTN基因第3外显子。首先合成出包含移码突变的MSTN同源短臂，使其在第3外显子上缺失11bp，形成移码突变；然后合成MSTN的同源长臂，利用酶切位点插入载体pFPC-1，构建出牛MSTN基因移码突变的打靶载体pFPC-MSTN。得到的打靶载体线性化后转染牛体细胞，通过同源重组在牛MSTN基因中引入移码突变，利用这种细胞可以在生产中得到MSTN基因移码突变的转基因牛，从而提高其产肉性状，提高牛肉的品质与产量。
文档编号C12N15/12GK102653764SQ201210126009
公开日2012年9月5日 申请日期2012年4月26日 优先权日2012年4月26日
发明者丁向彬, 刘新峰, 李光鹏, 李吉霞, 葛秀国, 郭宏 申请人:内蒙古大学, 天津农学院