专利名称：一株耐冷卡马西平降解菌及其筛选方法和在含卡马西平废水处理中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程、环境生物技术领域，涉及一株耐冷卡马西平降解菌株Pseudomonas sp. CBZ-4及其在低温城市污水处理中的应用。
背景技术：
药品和个人护理用品(Pharmaceuticaland personal care products,PPCPs)是近些年新兴的微量有机污染物，在环境中广泛存在，在地表水、地下水、污泥、城市污水厂排水，甚至饮用水中均能被检测到。PPCPs类物质质量浓度通常很低，结构复杂，难降解，其对生物及人类存在的环境健康风险还有待探究。消炎药、抗生素等药物因在日常生活中广泛使用而在环境中检出率较高，其中卡 马西平(Carbamazepine, CBZ)通常被作为环境中PPCPs污染状况的指不化合物。卡马西平是一种治疗癫痫、抑郁症和神经痛的常见药物，患者服用后部分母体或其代谢产物会随粪便排出进入环境。卡马西平化学名是5H-二苯并[b，f]氮杂卓-5-甲酰胺，是含氮的芳香族化合物，分子量为236. 269 g/mol，化学结构复杂，含量在几到几十μ g/L (见
I)。卡马西平具有药物活性成分，低浓度下难于生物降解，一般城市污水处理厂传统的物化及生物处理方法都很难将其高效的去除。另外，低温会对城市污水厂中PPCPs类化合物的生物降解起到严重的抑制作用。目前，卡马西平这一类物质对人类健康及环境的危害研究刚刚开展，相关的排放标准及法律法规还未建立起来。但是欧洲立法认为卡马西平对环境具有长期的负面影响，已经将其列为危害水生生物的有毒物质之一。因此，对于卡马西平这类痕量有机污染物去除方法的研究将成为水污染控制领域的热点之一。生物法能够有效降解、矿化有机污染物，作用时间长，廉价，有毒副产物少，因此从自然界中筛选土著低温卡马西平降解菌，用于生物强化处理低温城市污水，是解决PPCPs类化合物污染的行之有效的方法。因此,对于新分离菌株Aewt/offioftas sp. CBZ-4,对其生理生化及生长降解特性、对卡马西平的降解效果进行深入研究都是必须的，填补了此类污染物微生物降解研究的空白。
发明内容
本发明的目的在于从自然界中分离筛选卡马西平降解菌Pseudomonas sp.CBZ-4,为有机污染物卡马西平的生物降解处理提供高效的菌种，能够在低温下进行生物降解去除，提高城市污水厂以及制药废水处理厂出水水质，为水质净化奠定了理论基础。本发明提供的菌株为Aewi/offioaas sp. CBZ-4,已于2012年3月27日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”(简称CGMCCJias :北京市朝阳区大屯路)，其保藏号CGMCC No. 5943。耐冷的卡马西平降解菌Pseudomoims sp. CBZ-4具体筛选方法按以下步骤进行一、向250mL锥形瓶中加入IOOmL以卡马西平为唯一碳源、能源的无机盐液体培养基(100mg/L)和IOmL新鲜活性污泥，在温度10°C，转速150r/min的条件下摇床培养12d，获得富集菌液；二、取IOmL富集菌液加入IOOmL新鲜的卡马西平无机盐液体培养基，重复步骤一的培养条件，获得驯化菌液；三、驯化菌液倍比稀释不同梯度(10' 10_2、10' 10_4、10_5)，分别取100 μ L稀释菌液涂布于卡马西平无机盐固体培养基中，于10°C恒温箱中培养疒10d，获得卡马西平降解菌群；四、挑取不同颜色和形态的菌落进行三区划线，获得单菌落 ’五、重复操作步骤四3 4次，获得纯种卡马西平降解菌；六、操作步骤五中得到卡马西平降解菌接种到卡马西平无机盐液体培养基中，于温度10°C，转速150r/min的条件下摇床培养7d，测定0D_，即完成低温卡马西平降解菌的筛选。七、将筛选出的纯种低温卡马西平降解菌接种到斜面富集培养基，于4 0C下保存；
步骤一和六中，卡马西平无机盐液体培养基成分相同，由1.5 g KH2PO4, O. 15 gMgSO4 · 7H20、O. 5 g (NH4)2SO4^O. 5 g NaCl,3. 5 g K2HPO4' O. I g 卡马西平、I. O mL 微量元素溶液溶于IOOOmL的蒸馏水中，调节pH到7. O ； 步骤三和四中，卡马西平无机盐固体培养基成分相同，均是由1.5 g KH2PO4, O. 15 gMgSO4 ·7Η20、O. 5 g (NH4)2SO4^O. 5 g NaCl,3. 5 g K2HPO4, O. I g 卡马西平、18g 琼脂、1.0mL微量元素溶液溶于IOOOmL的蒸懼水中，调节pH到7. O ；
步骤七中斜面富集培养基成分为1.5 g KH2PO4, O. 15 g MgSO4 ·7Η20、0.5 g(NH4)2SO4^O. 5 g NaCl,3. 5 g K2HP04、2g 蛋白胨、18g 琼脂、1.0 mL 微量元素溶液溶于IOOOmL的蒸馏水中，调节pH到7. O ；
上述微量元素溶液的成分相同，均是由O. I g CuSO4 ·5Η20、O. 3 g MnSO4 · 4H20、0. 2g ZnSO4 · 7H20、2. O g NaHCO3 · IOH2O, O. 5 g CoCl2 · 6H20、0. 05g CaCl2 · 2Η20、0· 5gFeSO4 · 7H20、0. 02g (NH4)6Mo7O2 · 4H20 溶于 IOOOmL 的蒸馏水中。本发明以哈尔滨某城市污水处理厂生物处理单元中获取新鲜活性污泥作为菌种来源，进行卡马西平降解菌的富集分离，整个筛菌过程均在低温(10 0C)条件下进行。培养基在121 °C，高压蒸汽灭菌20分钟后使用。驯化过程采用一次性投加高浓度卡马西平(100mg/L),每个驯化周期结束时，取培养菌液的10%接种到新鲜的卡马西平无机盐液体培养基中，将此驯化菌液涂布在卡马西平无机盐固体培养基中，反复三区划线，分离出一株高效低温卡马西平降解菌株sp. CBZ-4。菌株CBZ-4的培养特征为原子力显微镜观察为短杆菌(见
2)，培养皿观察菌落较小、乳白色、圆形、略有凸起、易挑起，菌液为乳白色。16S rDNA菌种鉴定采用华舜生物公司生产的细菌基因组DNA小量抽提试剂盒(W6511)说明书进行操作，提取菌液DNA。PCR反应体系为去离子水17. 3 μ L，10XPCRBufferr 2. 5 μ L, dNTP 2 μ L，上下游引物各 I μ L，rTaq 酶 0· 2 μ L，模板 DNA I μ L，共计25 μ L。PCR反应流程为94 0C预变性5min，30个循环94 °C变性30s，58 0C退火30s，720C延伸lmin30s，再于72 0C延伸10min，4 0C 30min。使用TIANGEN公司生产的胶回收试剂盒对所扩增的目的片段进行回收纯化。将回收产物连接到PMD18-T载体(Takara公司)上，16 0C连接lh。将连接产物转入大肠杆菌DH5 α感受态细胞中，LB固体培养基37 °C过夜培养。挑取阳性克隆菌落，采用PCR扩增的办法进行鉴定，能够扩增出大小相符的目的片段的菌液，送交测序公司测序。通过Blast程序进行同源性比较,菌株CBZ-4与Pseudomonassp. Nj-59基因序列(accession no. AM491463)有99%的相似性。耐冷的卡马西平降解IPsGudomorms sp. CBZ-4的16S rDNA序列如下,系统进化树见
3。GCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTAGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGC ATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGAGTCTTGAACTCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATCCAATGAACTTTCTAGAGATAGATTGGTGCCTTCGGGAACATTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTAATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGAGGACGGTTACCACGGTGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTAATCGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGo耐冷卡马西平降解菌sp. CBZ_4应用在含卡马西平废水处理中。本发明提供的菌株AeutZoffioftas sp. CBZ-4在应用前需在卡马西平无机盐培养基中进行驯化，培养条件为温度10 °C，pH 7.0，摇床转速150r/min好氧培养。该菌株在低温生境中对卡马西平具有一定的降解，且对雌激素类化合物也具有一定的降解能力，包括17α-炔雌醇(EE2)、17β-雌二醇(E2)、雌酮(El)，苯酚、邻甲酚、对甲酚等酚类以及苯胺类化合物也能被菌CBZ-4利用(见表1)，说明CBZ-4具有广泛的底物广谱性。本发明提供的菌株Aewt/offlmas sp. CBZ-4在100mg/L的卡马西平无机盐液体培养基中，于10 0C, pH 7. 0，150r/min条件下连续培养144h，测定菌液的生长情况及卡马西平的去除效果，144h内降解率达到46. 6%，见
4。本发明提供的菌株AeutZoffioftas sp. CBZ-4制备成休眠细胞后进行不同浓度卡马西平降解实验。菌株CBZ-4于10 0C, pH 7.0,150r/min条件下连续培养6 15d，从IOmg/L 160 mg/L九个浓度梯度下对卡马西平均有一定程度的降解，见
5。表I CBZ-4的底物广谱性实验
权利要求
1.一株耐冷的卡马西平降解菌sp. CBZ-4,属于sp.,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 5943。
2.根据权利要求I所述的耐冷的卡马西平降解菌Aewt/offioftas·sp. CBZ-4,其特征在于经16S rDNA鉴定CBZ-4为假单胞菌属iPseudomonas \原子力显微镜观察为短杆菌,培养皿观察菌落较小、乳白色、圆形、略有凸起、易挑起，菌液为乳白色。
3.根据权利要求I或2所述的耐冷的卡马西平降解菌Aewt/offioftassp. CBZ-4的筛选方法，其特征在于按以下步骤进行一、向250mL锥形瓶中加入IOOmL以卡马西平为唯一碳源、能源的无机盐液体培养基(100mg/L)和IOmL新鲜活性污泥,在温度10°C,转速150r/min的条件下摇床培养12d，获得富集菌液；二、取IOmL富集菌液加入IOOmL新鲜的卡马西平无机盐液体培养基，重复步骤一的培养条件，获得驯化菌液；三、驯化菌液倍比稀释不同梯度(10' 10_2、10' 10_4、IO-5),分别取100 μ L稀释菌液涂布于卡马西平无机盐固体培养基中，于10°c恒温箱中培养7 10d，获得卡马西平降解菌群；四、挑取不同颜色和形态的菌落进行三区划线，获得单菌落；五、重复操作步骤四3 4次，获得纯种卡马西平降解菌；六、操作步骤五中得到卡马西平降解菌接种到液体卡马西平无机盐培养基中，于温度10°C，转速150r/min的条件下摇床培养7d，测定OD66tl,即完成低温卡马西平降解菌的筛选；七、将筛选出的纯种低温卡马西平降解菌接种到斜面富集培养基，于4 0C下保存； 步骤一和六中，卡马西平无机盐液体培养基成分相同，由1.5 g KH2PO4, 0. 15 gMgSO4 · 7H20、0.5 g (NH4)2SO4^O. 5 g NaCl,3. 5 g K2HPO4' 0. I g 卡马西平、I. O mL 微量元素溶液溶于IOOOmL的蒸馏水中，调节pH到7. O ； 步骤三和四中，卡马西平无机盐固体培养基成分相同，均是由1.5 g KH2PO4, 0. 15 gMgSO4 ·7Η20、0.5 g (NH4)2SO4^O. 5 g NaCl,3. 5 g K2HPO4, 0.1 g 卡马西平、18g 琼脂、1.0mL微量元素溶液溶于IOOOmL的蒸懼水中，调节pH到7. O ； 步骤七中斜面富集培养基成分为1.5 g KH2PO4, 0. 15 g MgSO4 ·7Η20、0.5 g(NH4)2SO4^O. 5 g NaCl,3. 5 g K2HP04、2g 蛋白胨、18g 琼脂、1.0 mL 微量元素溶液溶于IOOOmL的蒸馏水中，调节pH到7. O ； 上述微量元素溶液的成分相同，均是由0. I g CuSO4 ·5Η20、0. 3 g MnSO4 · 4H20、0. 2g ZnSO4 · 7H20、2. O g NaHCO3 · IOH2O, 0. 5 g CoCl2 · 6H20、0. 05g CaCl2 · 2Η20、0· 5gFeSO4 · 7H20、0. 02g (NH4)6Mo7O2 · 4H20 溶于 IOOOmL 的蒸馏水中。
4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于步骤六卡马西平降解体系中OD66tl值为0.471。
5.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于培养基均在121°C下灭菌20 min后使用。
6.权利要求I或2所述的耐冷的卡马西平降解菌sp.CBZ-4在含卡马西平废水处理中的应用。
全文摘要
一株耐冷的卡马西平降解菌Pseudomonassp.CBZ-4，它涉及药品及个人护理品(PPCPs)这一类污染物中卡马西平药物的微生物降解去除，它解决了城市污水处理厂中传统的污水处理工艺难以有效去除环境中微量污染物，尤其在冬季处理效果差等问题，通过取冬季某城市污水处理厂活性污泥，低温(10oC)富集驯化卡马西平降解菌，倍比稀释、平板划线、分离和纯化卡马西平降解菌群；反复划线筛选，得到纯种耐冷卡马西平降解菌Pseudomonassp.CBZ-4；该菌株在144h内对卡马西平去除率达到46.6%，并对其他芳香族化合物具有一定的降解性能。本发明所提供的菌株应用于低温城市污水生物强化处理或二沉池废水深度处理，以及较难处理的制药废水中，对于实现污水中新兴微量有机污染物高效生物降解去除具有重大意义。
文档编号C12R1/38GK102864097SQ20121012580
公开日2013年1月9日 申请日期2012年4月26日 优先权日2012年4月26日
发明者李昂, 蔡蕊, 马放, 崔迪, 张斯 , 庞长泷, 邱天 申请人:哈尔滨工业大学宜兴环保研究院, 江苏哈宜环保研究院有限公司