专利名称：：月季耐盐株系的离体快速筛选方法
技术领域：
：本发明属于农业生物
技术领域：
，具体涉及月季耐盐株系的离体筛选与快速增殖的方法。
背景技术：
：月季(yfo^cM.)是世界花卉市场上最重要的切花种类之一。在荷兰切花拍卖额中，月季连续多年排名第一，居世界四大切花之首，同时月季也是我国乃至云南省的第一大切花，是切花种类中的重中之重，创造出巨大的经济效益。但在月季的栽培和生产过程中，耐盐性已成为制约切花月季品质和产量提升的关键因素之一，且当前切花月季的栽培模式多为设施栽培，在连作模式下的生产，造成温室土壤盐分积累逐年递增，使月季在高盐基质下的产量降低，影响了丰产性。前人的研究表明培育耐盐品种是解决土壤盐渍化问题的关键。常规耐盐性筛选常采用幼苗或植株等材料进行田间筛选，使经物理或化学等诱变后的组培无性系再经长期增殖、生根、移栽成活后形成一定数量的幼苗后，才能进行田间筛选；若筛选出耐盐突变株则还需再通过组培、扦插或嫁接等方式进行扩繁，存在时间周期长，不利耐盐突变株系的快速筛选及大量增殖，加之土地和劳动力成本较高，需耗费更多的人力与物力。目前，耐盐品种培育的新技术方面常有(1)体细胞无性系的变异及筛选在组织培养过程中，由于培养条件的变化，如植物激素、添加甲基磺酸乙酯等化学诱变剂、射线处理等物理诱变等方法使植物体产生突变。例如中国专利，专利号为ZL0311539.8的"番茄耐盐性状的筛选"，中国专利,专利申请号为200610118700.6的"一种利用组织培养筛选耐盐番茄的方法"，中国专利，专利号为ZL03150784.0的"耐盐性番茄植株培育方法"，均是将材料在含有不同浓度NaCl的培养基中培养，选择出抗盐的变异植株。(2)组织培养结合射线辐照处理诱发突变体如郑海柔等，"酸枣组织培养结合，0-Y射线辐照诱发突变体"，上海农业学报，2004，20(1):13-18。王磊的"丰花月季组培苗辐射诱变研究及遗传变异研究"，东北农业大学硕士毕业论文，2007。现有技术存在以下缺陷(1)在体细胞无性系的变异及筛选中还没有对切花月季这一大花卉种类进行耐盐祐系的离体快速筛选研究，如上述专利。(2)在组织培养结合射线辐照处理诱发突变体研究中，如王磊的"丰花月季组培苗辐射诱变研究及遗传变异研究"(东北农业大学硕士毕业论文，2007)，重点是用组织培养材料在辐射剂量的研究和利用RAPD技术在早期对月季辐射后代进行鉴定和选择研究上，并未利用组织培养技术对月季辐射后代的耐盐筛选进行研究。郑海柔等的"酸枣组织培养结合，0-Y射线辐照诱发突变体"(上6海农业学报，2004，20(1):13-18)中除所选作物不同外，在组织培养结合，o-Y射线辐照诱发突变体中也未有针对性地进行耐盐株系的筛选。目前，将6°Co-Y射线等物理诱变与耐盐选择压力结合进行月季耐盐株系离体筛选的研究还未见报道，将6°C0_Y射线等物理诱变与耐盐选择压力结合对月季耐盐株系的离体快速筛选的研究也还未见报道。
发明内容本发明的目的是解决月季品种选育周期长，杂交选育2年才能开花以及田间耐盐性筛选易造成土壤盐滞化的问题，提供一种月季耐盐株系的离体快速筛选方法。本发明克服了现有技术中(1)传统月季耐盐品种筛选中土地和劳动力成本较高、周期较长的局限；(2)在已报道的耐盐性筛选技术中还没有针对月季的方法，而其它作物耐盐选择压力的浓度并不适应于月季种类；G)在组织培养结合辐照处理诱发突变体的研究中，存在未利用组培的离体筛选技术对月季辐射后代的耐盐筛选进行研究等缺陷。因此，本发明在利用成熟组织培养技术的基础上，创新地将6GCo-Y射线物理诱变与6°Co_Y射线物理诱变之前的组织培养技术和，o-Y射线诱变之后的耐盐选择压力有机结合，以对月季耐盐株系进行离体筛选，重点研究了耐盐突变株系的离体筛选、继代增殖、壮苗、生根、移栽等关键技术，本发明通过多年的探索，成功地研究出在短时间内可获得一定数量的变异植株，适合于选育周期长的木本花卉如月季耐盐株系的离体快速筛选，成功建立起月季耐盐株系的离体快速筛选方法，以满足月季产业化应用及可持续发展的需求。本发明各步骤的效果好，各步骤之间具有系统性、整体性，大幅提高了变异率，为月季耐盐新品种的选育提供了一种新的思路和方法。本发明与现有技术相比，有以下有益效果1、本发明筛选出的株系，在耐盐性选择压力下的苗高、叶片数和地径三个指标，均表现出明显的耐盐性。2、本发明所建立的技术方法还具备了重复性好的优点，通过2个不同品种的3次独立实验的开展，其结果均表现得稳定、一致(在表4与表5的效果比较中已体现,表中实施例各处理均有效地筛选出了耐盐株系,证明了本发明方法重复性好，结果是稳定、一致的。)3、本发明还具备了适用范围广的优势，通过试验了月季"维西利亚(Versilia)"和"坦尼克(Tinete)"等多个品种，均筛选出稳定遗传的耐盐突变株系。4、本发明显著提升了突变频率与成活率，本发明的诱变群体选择叶片再生体系，不仅可直接利用叶片再生及无性系增殖过程中诱发的突变现象，而且利用上述的叶片再生无性变，从耐盐性筛选的成活率反应出的耐盐性变异率，可看出实施例1与实施例2的耐盐性筛选的总平均成活率为17.8%，比对照1平均提高16.41%，比对照2平均提高17.8%，显著提升了突变频率与成活率(由耐盐性筛选筛选的成活率来体现，因对照2全部死亡，说明未进行叶片再生和物理诱变的植株未变异，经耐盐性筛选后成活的均是发生耐盐性变异的株系)。5、本发明通过2次的耐盐性筛选，最大程度地剔除了假阳性植株，保证筛选出的耐盐性株系均是稳定遗传的突变体。6、本发明的耐盐性筛选的总成活率高，为13.9%23.7%，比对照1提高了13.9°/021.35%，比对照2提高了13.9%23.7%。7、本发明所建立起的耐盐突变株系的离体快速筛选方法，不仅实现了变异株系的定向筛选与快速鉴定，并可将变异株系进行快速繁殖，縮短育种周期，可快速筛选出耐盐性良好的突变株系，提高了育种效率，加快了育种进程，而且利于克服田间筛选易造成土壤盐渍化的不良影响。8、本发明体现了植物组织培养的优势，整个筛选过程基本控制在瓶内进行离体筛选，使整个筛选过程易于操作和控制，不受土壤等外界因素与季节、气候、病虫害等条件的制约。本发明过程是所选用材料为利用月季叶片愈伤组织或直接再生的不定芽作为处理材料，经适宜的^Co-Y射线诱变，再将物理诱变的诱变材料经过诱变恢复培养、耐盐株系的离体快速筛选、耐盐株系的快速增殖与再筛选、恢复培养及壮苗、生根培养等关键技术，快述筛选出明显具备耐盐性的耐盐突变株系。本发明的技术方案如下，按以下步骤进行1、初始外植体的选择与灭菌，选择生长健壮、无病虫害危害及病毒症状表现的当年生新枝，剪成每段含12个侧芽的茎段，剪去叶片后放入含适量洗衣粉的洗衣粉水中浸泡35min，自来水清洗干净，在0.10.2。/。的氯化汞(HgCl2)溶液中处理2025min，1%2%的次氯酸钠溶液中处理2025min，无菌水洗34次后，进行萌芽诱导；2、萌芽诱导，在无菌条件下，将上述茎段两头各切去少许茎秆后接入下列萌芽培养基中培养，在温度为23°C±2°C，光照时间为1012h/d，光照强度为20003000Lx的环境条件下，培养1520d，可见幼芽从叶腋处萌发，伸长形成不定芽；'MS基本培养液6-苄基氨基嘌呤(6-BA)0.10.5mg/L萘乙酸(NAA)0.10.3mg/L蔗糖琼脂pH3、增殖培养，在无菌条件下，转入下列的增殖培养基中；MS基本培养液6-苄基氨基嘌呤(6-BA)萘乙酸(NAA)蔗糖琼脂pH2030g/L5.56.0g/L5.66.0将步骤2获得的不定芽切成长1.0cm土O.lcm的茎段，0.51.2mg/L0.10.5mg/L2535g/L5.06.0g/L5.66.0在温度为25。C士2。C，光照时间为1012h/d，光照强度为20003000Lx的条件下，培养2030d，每个茎段可萌发形成几个不定芽，增殖率达34倍；4、增殖苗的持续继代，将步骤3增殖所获得的不定芽在无菌条件下分切为单芽或茎段，接入与步骤3相同的增殖培养基中，在与第3步骤相同的培养环境下进行培养，可获得大量的无根不定芽，该不定芽具有茎秆粗壮、叶片厚实、叶色浓绿、生长健壮的特点；5、叶片直接再生，将步骤4增殖所获得的大量不定芽，在无菌条件下切取生长健壮的中上部小叶片，带叶柄接入下列叶片直接再生培养基中；MS基本培养液噻苯隆(TDZ)0.52.0mg/L萘乙酸(NAA)0.11.0mg/L蔗糖2535g/L琼脂5.57.0g/LpH5.66.0在温度为23°C±2°C，光照时间为1214h/d，光照强度为20003000Lx的条件下，培养1525d，从叶片表面尤其是叶柄处可直接再生不定芽；6、叶片间接再生，将步骤4增殖所获得的大量不定芽，在无菌条件下切取生长健壮的中上部小叶片，切成lcm2士2mn^1.5cm2土2mn^的小叶块，接入下列叶片愈伤诱导培养基中；MS基本培养液2，4一二氯苯氧乙酸(2,4-D)0.52.0mg/L6-节基氨基嘌呤(6-BA)2.05.0mg/L萘乙酸(NAA)0.11.0mg/L蔗糖2535g/L琼脂5.06.0g/LpH5.66.0先在温度为22X:士2。C，无光的条件下暗培养810d后，转入光照培养，光照时间为1214h/d，光照强度为20003000Lx的条件下，培养1015d，即诱导形成大量愈伤组织，将表面粗糙、色泽较绿的愈伤组织转接于下列愈伤分化培养基中；MS基本培养液6-苄基氨基嘌呤(6-BA)0.82.5mg/L萘乙酸(NAA)0.050.8mg/L蔗糖2535g/L琼脂5.06.0g/LpH5.66.0在温度为22。C土2。C，光照时间为1214h/d，光照强度为20003000Lx的条件下，培养3545d即可从愈伤组织上分化出不定芽；7、物理诱变处理，将步骤5和步骤6所获得的再生不定芽切成1cm土2mm长的茎段，转入步骤3的增殖培养基内，并将生长1015d材料连瓶直接用5060Gy的6QCo-Y射线进行辐射处理，剂量率为0.5Gy/min;8、诱变恢复培养，将步骤7所获得的诱变材料转入步骤3的增殖培养基内，进行35代的恢复培养，培养条件同步骤3;9、耐盐株系的离体快速筛选，将经步骤8恢复培养后获得的诱变材料转入到添加1015g/L的NaCl的步骤3的增殖培养基内，进行离体快速筛选，培养条件同步骤3，筛选20d-26d后，将成活株系进行转接；10、耐盐株系的快速增殖与再筛选，将经步骤9筛选出的耐盐株系转接至步骤3的培养培养基内，培养条件亦同步骤3，进行恢复培养与快速增殖，稳定增殖68代后，转入添加1012g/L的NaCl的步骤3的增殖培养基内，培养15d-25d后筛选除去耐盐性的假阳性植株(假阳性植株死亡，真正的耐盐突变株则存活下来)；11、恢复培养及壮苗，将经步骤10再筛选获得的耐盐突变株系转接至步骤3的培养培养基内，培养条件亦同步骤3，进行恢复培养与快速增殖，稳定增殖56代后，转入下列壮苗培养基内；1/2MS基本培养液6-节基氨基嘌呤(6-BA)萘乙酸(NAA)蔗糖琼脂pH0.30.5mg/L0.20.5mg/L2030g/L5.56.0g/L5.66.0培养条件为温度20°C±2°C，光照时间1214h/d，光照强度20003000Lx,经2535d壮苗后，不定芽明显增高，茎秆变粗，生长更健壮；12.生根培养，将步骤11恢复培养及壮苗后形成的不定芽切成1.0cra土2mm1.5cm±2mm高的带茎尖的不定芽，转接至下列生根培养基内；1/2MS基本培养液萘乙酸(NAA)0.10.5mg/L口引哚乙酸(IAA)0.00.5mg/L蔗糖2025g/L琼月旨5.06.0g/L'pH5.66.0在温度为20°C±2°C，光照时间为1012h/d，光照强度为20003000Lx的条件下，培养1525d即可从不定芽上长出根，形成完整的具根无菌苗；13.移栽成活，将步骤12经耐盐性离体快速筛选获得的生根苗从瓶内取出，洗净培养基，移入腐质土珍珠岩为2:1的混合基质内，栽后浇足水，适当保湿，移栽1周内相对湿度应保持在80%以上，4050d成活；移栽成活后，与对照一起用含NaCl58g/L的自来水浇灌，2535d后对照明显变黄，生长不良，耐盐突变株系则生长状况较好，明显具备耐盐性。具体实施例方式下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案及其有益效果，使本领域技术人员进一步理解本发明，但并不构成对本发明的限制。实施例l:月季品种维西利亚(Versilia)耐盐株系的离体快速筛选本实施例所用材料为月季品种维西利亚(Versilia)，作3个处理，各处理2次重复。处理1按以下步骤进行，处理2和处理3除表1所列措施不同外，其余方法均与处理1相同。处理l按以下步骤如下1、初始外植体的选择与灭菌，选择生长健壮、无病虫害危害及病毒症状表现的当年生新枝，剪成每段含(12)个侧芽的茎段，剪去叶片后放入放有少量洗衣粉的水中浸泡5min，自来水清洗干净，在0.2n/。的氯化汞(HgCl2)溶液中处理20min，2%的次氯酸钠溶液中处理25min，无菌水洗3次后，进行萌芽诱导；2、萌芽诱导在无菌条件下，将茎段两头各切去少许茎秆后接入MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.1mg/L+20g/L蔗糖+5.5g/L琼月旨，pH5.6的萌芽培养基中培养，在温度为(23土2)。C，光照时间10h/d，光照强度3000Lx的环境条件下，培养15d，可见幼芽从叶腋处萌发，伸长形成不定芽；3、增殖培养在无菌条件下，将步骤2获得的不定芽切成长1.0cm士2mm的茎段转入MS+6-BA1.0mg/L+NAAO.lmg/L+25g/L蔗糖+5g/L琼脂，pH5.6的增殖培养基中。在温度为(25土2)。C，光照时间10h/d，光照强度3000Lx的条件下，培养20d，每个茎段可萌发形成34个不定芽，增殖率达3.3倍；4、增殖苗的持续继代将步骤3增殖所获得的不定芽在无菌条件下分切为单芽或茎段，接入与步骤3相同的增殖培养基中，在与步骤3相同的培养环境下进行培养，可获得大量的无根不定芽，该不定芽的特点为茎秆粗壮、叶片厚实、叶色浓绿、生长健壮；5、叶片直接再生将步骤4增殖所获得的大量不定芽，在无菌条件下切取生长健壮的中上部小叶片，带叶柄接入MS+TDZ0.5mg/L+NAAO.lmg/L+25g/L蔗糖+5.5g/L琼脂，pH5.6的叶片直接再生培养基中。在温度为(23士2)°C，光照时间12h/d，光照强度3000Lx的条件下，培养20d，从叶片表面尤其是叶柄处可直接再生出不定芽；6、叶片间接再生将步骤4增殖所获得的大量不定芽，在无菌条件下切取生长健壮的中上部小叶片，切成1cm2±2mm2的小叶块，接入MS+2，4-D0.5mg/L+6-BA2.0mg/L+NAAO.lmg/L+25g/L蔗糖+5.0g/L琼脂，pH5.6的叶片愈伤诱导培养基中。先在温度(22±2)°C，无光的条件下暗培养8d后，转入光照培养，光照时间12h/d，光照强度3000Lx的条件下，培养10d，即诱导形成大量愈伤组织，将表面粗糙、色泽较绿的愈伤组织转接于MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.05mg/L+25g/L蔗糖+5.0g/L琼脂，pH5.6的愈伤分化培养基中。在温度为(22士2)°C，光照时间12h/d，光照强度3000Lx的条件下，培养35d即可从愈伤组织上分化出不定芽；7、物理诱变处理将步骤5和步骤6所获得的再生不定芽切成1cm士2mm长的茎段，12转入步骤3的增殖培养基内，并将生长10d左右的材料连瓶直接用50Gy的6QCo-Y射线进行辐射处理，剂量率为0.5Gy/min;8.诱变恢复培养将步骤7所获得的诱变材料转入步骤3的增殖培养基内，进行3代的恢复培养，培养条件同步骤3;9.耐盐株系的离体快速筛选，将经歩骤8恢复培养后获得的诱变材料转入到添加15g/L的NaCl的步骤3的增殖培养内，进行离体快速筛选，培养条件同步骤3，筛选20d后，将成活株系进行转接；10.耐盐株系的快速增殖与再筛选，将经步骤9筛选出的耐盐株系转接至歩骤3的培养培养基内，培养条件亦同步骤3，进行恢复培养与快速增殖，稳定增殖6代后，转入添加10g/L的NaCl的步骤3的增殖培养基内，培养25d后筛选除去耐盐性的假阳性植株(假阳性植株死亡，真正的耐盐突变株则存活下来)；11.恢复培养及壮苗，将经步骤10再筛选获得的耐盐突变株系转接至步骤3的培养培养基内，培养条件亦同步骤3，进行恢复培养与快速增殖，稳定增殖5代后，转入1/2MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.2mg/L+20g/L蔗糖+5.5g/L琼脂，pH5.6的壮苗培养基内；培养条件为温度(20士2)°C，光照时12h/d，光照强度3000Lx，经25d壮苗后，不定芽明显增高，茎秆变粗，生长更健壮；12.生根培养，将步骤11恢复培养及壮苗后形成的不定芽切成1.0cm士2mm高的带茎尖的不定芽，转接至1/2MS+NAA0.5mg/L+20g/L蔗糖+5.0g/L琼脂，pH5.6的生根培养基内；在温度为(20士2)'C，光照时间10h/d，光照强度3000Lx的条件下，培养15d即可从不定芽上长出根，形成完整的具根无菌苗；13.移栽成活，将步骤(12)经耐盐性离体快速筛选获得的生根苗从瓶内取出，洗净培养基，移入腐质土珍珠岩为2:1的混合基质内。栽后浇足水，适当保湿，移栽1周内相对湿度应保持在80%以上，45d成活后，与对照一起用含NaC15g/L的自来水浇灌，35d后对照明显变黄，生长不良，耐盐突变株系则生长状况较好，明显具备耐盐性。实施例1处理2与实施例1处理3中未作说明的处理措施，如各步骤的培养温度、移栽1周内的相对湿度等均与实施例1中的处理1相同，各步骤中有所区别的措施见表1。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>实施例2:月季品种坦尼克(Tinete)耐盐株系的离体快速筛选本实施例所用材料为月季品种坦尼克(Tinete)，除所用材料的品种与实施例1不同外，同样作3个处理，各处理2次重复。处理l、处理2和处理3均分别与实施例1的处理l、处理2和处理3相同，不再赘述。对照设置情况说明对照l:上述实施1与实施2的每个处理均同步设置2个对照，所用月季品种也相应一致，对照1是不进行步骤7的物理诱变处理，直接将经步骤5和歩骤6的叶片诱导再生苗进行后续的耐盐性筛选，相同的处理代码代表除不进行6°Co-Y射线辐射诱变的步骤7处理，以及步骤8的恢复培养外，其余各歩骤均与实施例中的同一处理代码相同。与表1相同，表2中未作说明的处理措施，如各步骤的培养温度、移栽1周内的相对湿度等均与实施例1中的处理1相同，各步骤中有所区别的措施见表2，若对照中某些耐盐性筛选歩骤出现所有植株全部死亡的情况时，则再选取相近似的处理材料进入下一步骤处理。表2对照1各步骤采取的处理措施<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>对照2:对照2是除不进行步骤7的物理诱变处理外，还不进行步骤5与步骤6的叶片诱导处理，直接将经过步骤4增殖获得的大量不定芽材料进行后续的耐盐性筛选，相同的处理代码代表除不进行步骤5的叶片直接再生与步骤6的叶片间接再生、步骤7的6°Co-Y射线辐射诱变处理，以及步骤8的恢复培养外，其余各步骤均与实施例中的同一处理代码相同。与表1相同，表3中未作说明的处理措施，如各步骤的培养温度、移栽1周内的相对湿度等均与实施例1中的处理1相同，各歩骤中有所区别的措施见表3。表3对照2各歩骤采取的处理措施<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>实施效果比较实施效果主要通过实施1、实施2各处理间的重复性，以及实施例各处理与两个对照措施相比，在耐盐株系的离体快速筛选方面的效果比较两方面进行体现，祥见表4和表5。表4和表5表明1、本发明获得的耐盐性筛选方法能准确地将变异植株快速筛选出来，并且经过实施例1与实施例2的3次独立实验的开展，证明本发明重复性好(在表4与表5中效果比较已体现，其实施例各处理均有效地筛选出了耐盐株系，证明了本发明方法是可重复的、重复性好，结果是稳定、一致的。)。耐盐性筛选的总成活率高，为13.9%23.7%。2、实施例各处理所有筛选出的株系，经步骤13处理后，从苗高、叶片数与地径三个指标进行分析，均表现出明显的耐盐性。3、对照l由于经过了步骤5和步骤6的叶片再生环节，可获得一定的体细胞无性系变异植株，因此，在处理1和处理3中获得了一定数量的耐盐株系，但成活率与本发明的实施例相比，明显降低，仅为1.82%2.35%;对照2由于既不经过叶片再生，又不经过辐射诱变，因此在步骤10就已全部死亡，无成活植株。4、以上证明本发明建立起的耐盐性筛选方法重复性好，且能达到有效剔除假阳性植株，获得具稳定遗传的耐盐性植株。耐盐性筛选的平均总成活率为17.8%，比对照1提高16.41%，比对照2提高17.8%。所得数据计算方法如下本发明耐盐性筛选的平均总成活率K实施例1-2中供6个处理的最终耐盐成活率之和)/6=(15.6%+21.3%+14.8%+17.5%+23.7%+13.9%)/6=17.8%;对照1耐盐性筛选的最终平均耐盐成活率=(对照1各3个处理的最终耐盐成活率之和)/3=(2.35%+0+1.82%)/3=1.39%;对照2耐盐性筛选的最终平均耐盐成活率=(对照2各3个处理的最终耐盐成活率之和)/3=(0+0+0)/3=0;本发明耐盐性筛选的总成活率比对照1的平均提高率=17.8%-1.39%=16.41%;本发明耐盐性筛选的总成活率比对照2的平均提高率=17.8%-0=17.8%。表4表明本发明的耐盐性筛选的总成活率为13.9%23.7%，表5表明对照1的耐盐性筛选总成活率为02.35%;因此，本发明的耐盐性筛选的总成活率比对照l提高的计算为13.9%-0=13.9%，和23.7%-2.35%=21.35%，即比对照1提高了13.9%21.35%;表5表明对照2的耐盐性筛选总成活率为0;因此，本发明的耐盐性筛选的总成活率比对照2提高的计算为13.9%-0=13.9%，和23.7%_0=23.7%，即比对照2提高了13.9%23.7%。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表5对照1和对照2效果比较汇总表<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>注表中各处理的数据均是每个处理的两次重复的平均值。200810233663.2势滔a被17/17:K权利要求1.一种月季耐盐株系的离体快速筛选方法，其特征在于，按以下步骤进行(1)初始外植体的选择与灭菌，选择生长健壮、无病虫害危害及病毒症状表现的当年生新枝，剪成每段含1～2个侧芽的茎段，剪去叶片后放入含适量洗衣粉的洗衣粉水中浸泡3～5min，自来水清洗干净，在0.1～0.2％的氯化汞溶液中处理20～25min，1％～2％的次氯酸钠溶液中处理20～25min，无菌水洗3～4次后，进行萌芽诱导；(2)萌芽诱导，在无菌条件下，将上述茎段两头各切去少许茎秆后接入下列萌芽培养基中培养，在温度为23℃±2℃，光照时间为10～12h/d，光照强度为2000～3000Lx的环境条件下，培养15～20d；MS基本培养液6-苄基氨基嘌呤0.1～0.5mg/L萘乙酸0.1～0.3mg/L蔗糖20～30g/L琼脂5.5～6.0g/L全文摘要本发明公开了一种月季耐盐株系的离体快速筛选方法，属农业生物
技术领域：
。本发明由初始外植体的选择与灭菌、萌芽诱导、增殖培养、增殖苗的持续继代、叶片直接再生、叶片间接再生、物理诱变、诱变恢复培养、耐盐株系的离体快速筛选、耐盐株系的快速增殖与再筛选、恢复培养及壮苗、生根、移栽13个步骤组成。本发明利用月季叶片愈伤组织或直接再生的不定芽作为处理材料，重点研究了耐盐突变株系的离体筛选技术、继代增殖、壮苗与生根培养四个关键环节。其方法重复性好，且能达到有效剔除假阳性植株，获得具稳定遗传的耐盐性植株，其耐盐性筛选的平均总成活率约达18％，比对照1约提高16％，比对照2约提高18％，大幅提高了耐盐性筛选效率。文档编号A01G31/00GK101422132SQ20081023366公开日2009年5月6日申请日期2008年12月1日优先权日2008年12月1日发明者唐开学,颢张,王丽花,王继华,瞿素萍,艳苏申请人:云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所