专利名称：耐盐生香酵母筛选方法
技术领域：
本发明属于食品工业领域，特别是涉及一种耐盐生香酵母的筛选方法和工艺。
背景技术：
酱油是以粮油和其副产品为原料，经过酿造工艺制成的，具有特殊色香味有助于 促进食欲的液体调味品，消费量非常大。酱油酿造时，利用微生物所分泌的多种酶对原料进 行协同作用，因而发酵工艺在酱油酿造中对酱油质量极为重要，发酵工艺的好坏，将直接影 响酱油的质量与原料利用率。发酵方法很多，目前基本上可以分为低盐固态发酵及高盐稀 态发酵两类低盐固态发酵工艺，由于发酵时间短，原料利用率低，成曲质量不理想，产品档 次不高，口味、香味等远不能满足人们生活的需要。高盐稀态发酵工艺克服了传统作坊式 生产带来的种种弊端及产品缺陷，在卫生保障、营养价值、口味色泽等方面均有超前的优越 性。我国目前市场上出售的酱油多以低档产品为主，随着人们生活水平的提高，人们越来越 注重酱油的风味以及营养价值，所以高盐稀态发酵工艺无疑是酱油发酵工艺的所在趋势， 而高盐稀态发酵工艺首先需要有好的菌种，因而耐盐生香酵母菌种选育与筛选工艺也就成 为制造高档酱油产业的发展的关键工艺，是各个酱油企业以及各相关研究机构人们的研究 革:ο、目前全国90%以上的酱油酿造企业是用沪酿3. 042米曲霉菌种酿造酱油的，利用 米曲霉3. 042为出发菌种，诱变选育出一个适合现在我国普遍使用的高盐稀态发酵工艺的 菌种，改变其遗传结构和功能，通过筛选，从多种多样的变异体中筛选出产量高、性状优良 的耐盐生香酵母菌种突变株，并且找出发挥这个突变株最佳培养基和培养条件。得到提高 酱油成曲中性蛋白酶活力、酱油成品总氮和氨基酸态氮的含量，提高酿造酱油的外观、口味 等优良性能的耐盐生香酵母菌种，且由于此工艺具有速度快、收效大、成本较低，方便可行， 因此具有巨大的市场应用前景。
发明内容
本发明的目的是针对传统酱油生产中存在的诸多缺点，获得一种具有高效生香耐 盐酵母的筛选方法和工艺。本发明采取如下技术方案(1)出发菌种前培养，将米曲霉接入新鲜面，于30°C的培养箱中培养75°C，制备菌 悬液。(2)采用15W的紫外灯30cm处照射菌悬液，诱变菌种。(3)通过实验确定了米曲霉菌种初筛所用的培养基为双层酪蛋白平板、初筛选用 透明圈法，筛到比出发菌种优良的菌种。(4)将初筛获得的菌种，模仿企业生产曲房，用塑料筐盛成曲，放在生产曲房与生 产成曲同步培养进行复筛，使实验室方法与生产实际结合起来。(5)将得到酵母菌接入发酵培养基中经多次驯化培养，平板分离，使筛选菌种纯化。
具体实施方式
；实施例一将米曲霉接入新鲜斜面，于30°C的培养箱中培养75h，到孢子成熟。制备菌悬液， 用灭菌后的生理盐水洗下斜面孢子，倒入装有玻璃珠的45ml灭菌后的生理盐水中，振荡使 孢子分散。取以上制备好的菌悬液5ml于直径9cm的平皿中。紫外灯打开预热20min，以稳 定光波。将盛有菌悬液的平皿放置在离15W紫外线30cm处。打开皿盖，暴露在紫外光下照 射5min的时间，边照射边搅拌，力求使细胞均勻吸收紫外线光波。提高突变率。取0. Iml经 紫外线照射后的菌悬液涂皿，并且以未经紫外线照射过的菌悬液作对照皿，培养后，挑取菌 落，以待筛选。取玻璃珠20-30粒，放入250ml三角瓶中，加入0. 85%生理盐水50ml，塞上 棉塞，油纸包扎，常压灭菌，冷却后无菌操作。从待纯化复壮的菌种斜面取一环孢子放入三 角瓶中，振荡30min。取试管数支，每管加入9ml 0. 85%生理盐水，塞上棉塞，油纸包扎，经 0. IMPa 20min灭菌。冷却后进行梯度稀释，最后制成不同浓度的抱子悬浮液。通过实验确定 了米曲霉菌种初筛所用的培养基为双层酪蛋白平板、初筛选用透明圈法，保证k值和菌落 直径都相对有优势，筛选到比出发菌种优良的菌种。再将用透明圈法初筛出来的菌种，进行 三角瓶扩大培养，为了跟生产上相似的条件可以进行一次三角瓶扩大培养，32°C 72小时时 间培养，然后接黄豆、面粉制成成曲，检测蛋酶活力，以塑料筐盛成曲，成曲厚68mm或34mm， 放在曲池上与生产成曲同步培养，使复筛得来的耐盐生香酵母性蛋白酶活力都较出发菌种 高。将得到酵母菌接入发酵培养基中经多次驯化培养，平板分离，使筛选菌种纯化，通过性 能检测，即得到最佳耐盐生香酵母菌种。实施例二将米曲霉接入新鲜斜面，于31°C的培养箱中培养73h，到孢子成熟。制备菌悬液， 用灭菌后的生理盐水洗下斜面孢子，倒入装有玻璃珠的45ml灭菌后的生理盐水中，振荡使 孢子分散。取以上制备好的菌悬液6ml于直径9cm的平皿中。紫外灯打开预热23min，以 稳定光波。将盛有菌悬液的平皿放置在离15W紫外线30cm处。打开皿盖，暴露在紫外光下 照射5min的时间，边照射边搅拌，使细胞均勻吸收紫外线光波，提高突变率。取0. 15ml经 紫外线照射后的菌悬液涂皿，并且以未经紫外线照射过的菌悬液作对照皿，培养后，挑取菌 落，以待筛选。取玻璃珠20-30粒，放入250ml三角瓶中，加入0. 85%生理盐水50ml，塞上 棉塞，油纸包扎，常压灭菌，冷却后无菌操作。从待纯化复壮的菌种斜面取一环孢子放入三 角瓶中，振荡30min。取试管数支，每管加入IOml 0. 85%生理盐水，塞上棉塞，油纸包扎，经 0. IMPa 20min灭菌。冷却后进行梯度稀释，最后制成不同浓度的抱子悬浮液。通过实验确 定了米曲霉菌种初筛所用的培养基为双层酪蛋白平板、初筛选用透明圈法，保证k值和菌 落直径都相对有优势，筛选到比出发菌种优良的菌种。将用透明圈法初筛出来的菌种，进行 三角瓶扩大培养，为了跟生产上相似的条件可以进行一次三角瓶扩大培养，32°C 75小时培 养，然后接黄豆、面粉制成成曲，检测蛋酶活力，以塑料筐盛成曲，成曲厚68mm或34mm，放在 曲池上与生产成曲同步培养，使复筛得来的耐盐生香酵母性蛋白酶活力都较出发菌种高。 将得到酵母菌接入发酵培养基中经多次驯化培养，平板分离，使筛选菌种纯化，通过性能检 测，即得到最佳耐盐生香酵母菌种。
实施例三将米曲霉接入新鲜斜面，于33°C的培养箱中培养70h，到孢子成熟。制备菌悬液， 用灭菌后的生理盐水洗下斜面孢子，倒入装有玻璃珠的45ml灭菌后的生理盐水中，振荡使 孢子分散。取以上制备好的菌悬液5ml于直径9cm的平皿中。紫外灯打开预热25min，以稳 定光波。将盛有菌悬液的平皿放置在离15W紫外线30cm处。打开皿盖，暴露在紫外光下照 射一定的时间，边照射边搅拌，力求使细胞均勻吸收紫外线光波。提高突变率。取0.3ml经 紫外线照射后的菌悬液涂皿，并且以未经紫外线照射过的菌悬液作对照皿，培养后，挑取菌 落，以待筛选。取玻璃珠20-30粒，放入250ml三角瓶中，加入0. 85%生理盐水50ml，塞上 棉塞，油纸包扎，常压灭菌，冷却后无菌操作。从待纯化复壮的菌种斜面取一环孢子放入三 角瓶中，振荡35min。取试管数支，每管加入9ml 0. 85%生理盐水，塞上棉塞，油纸包扎，经 0. 15MPa 20min灭菌。冷却后进行梯度稀释，最后制成不同浓度的抱子悬浮液。通过实验确 定了米曲霉菌种初筛所用的培养基为双层酪蛋白平板、初筛选用透明圈法，保证k值和菌 落直径都相对有优势，筛选到比出发菌种优良的菌种。将用透明圈法初筛出来的菌种，进行 三角瓶扩大培养，为了跟生产上相似的条件可以进行一次三角瓶扩大培养，30°C 80小时时 间培养，然后接黄豆、面粉制成成曲，检测蛋酶活力，以塑料筐盛成曲，成曲厚68mm或34mm， 放在曲池上与生产成曲同步培养，使复筛得来的耐盐生香酵母性蛋白酶活力都较出发菌种 高。将得到酵母菌接入发酵培养基中经多次驯化培养，平板分离，使筛选菌种纯化，通过性 能检测，即得到最佳耐盐生香酵母菌种。实施例四将米曲霉接入新鲜斜面，于34°C的培养箱中培养68h，到孢子成熟。制备菌悬液， 用灭菌后的生理盐水洗下斜面孢子，倒入装有玻璃珠的48ml灭菌后的生理盐水中，振荡使 孢子分散。取以上制备好的菌悬液8ml于直径9cm的平皿中。紫外灯打开预热30min，以稳 定光波。将盛有菌悬液的平皿放置在离15W紫外线28cm处。打开皿盖，暴露在紫外光下照 射一定的时间，边照射边搅拌，力求使细胞均勻吸收紫外线光波。提高突变率。取0. Iml经 紫外线照射后的菌悬液涂皿，并且以未经紫外线照射过的菌悬液作对照皿，培养后，挑取菌 落，以待筛选。取玻璃珠20-30粒，放入250ml三角瓶中，加入0. 85%生理盐水60ml，塞上 棉塞，油纸包扎，常压灭菌，冷却后无菌操作。从待纯化复壮的菌种斜面取一环孢子放入三 角瓶中，振荡30min。取试管数支，每管加入9ml 0. 85%生理盐水，塞上棉塞，油纸包扎，经 0. 15MPa 15min灭菌。冷却后进行梯度稀释，最后制成不同浓度的抱子悬浮液。通过实验确 定了米曲霉菌种初筛所用的培养基为双层酪蛋白平板、初筛选用透明圈法，保证k值和菌 落直径都相对有优势，筛选到比出发菌种优良的菌种。将用透明圈法初筛出来的菌种，进行 三角瓶扩大培养，为了跟生产上相似的条件可以进行一次三角瓶扩大培养，32°C 75小时时 间培养，然后接黄豆、面粉制成成曲，检测蛋酶活力，以塑料筐盛成曲，成曲厚68mm或34mm， 放在曲池上与生产成曲同步培养，使复筛得来的耐盐生香酵母性蛋白酶活力都较出发菌种 高。将得到酵母菌接入发酵培养基中经多次驯化培养，平板分离，使筛选菌种纯化，通过性 能检测，即得到最佳耐盐生香酵母菌种。
权利要求
一种耐盐生香酵母筛选方法，其特征在于利用米曲霉3.042为出发菌种，诱变选育筛选得到适应高盐稀态发酵工艺的优良菌种。
2.根据权利要求1所述的一种耐盐生香酵母筛选方法，其特征在于所述的诱变选育 是采用15W的紫外灯在30cm处照射菌悬液而诱变菌种。 根据权利要求1所述的一种耐盐生香酵母筛选方法，其特征在于所述的筛选工艺 中初筛是用培养基为双层酪蛋白平板，用透明圈法，得到比出发菌种优良的菌种。
根据权利要求1所述的一种耐盐生香酵母筛选方法，其特征在于所述的复筛是将 初筛获得的菌种，模仿企业生产曲房，用塑料筐盛成曲，放在生产曲房与生产成曲同步培养 进行的。 根据权利要求1所述的一种耐盐生香酵母筛选方法，其特征在于所述的耐盐生香 酵母菌种是将复筛的酵母菌接入发酵培养基中经多次驯化培养，平板分离，使筛选菌种纯 化而得到的。
全文摘要
本发明为一种耐盐生香酵母筛选方法及其工艺，本发明是高盐稀态发酵制造酱油工艺中，诱变选育米曲霉3.042出发菌种，通过筛选得到适应高盐稀态发酵工艺的优良菌种，其方法是采用15W的紫外灯30cm处照射菌悬液而诱变菌种，用透明圈法，初筛到比出发菌种优良的菌种，再通过放在生产曲房与生产成曲同步培养进行复筛，最后将酵母菌经多次驯化培养，平板分离，使筛选菌种纯化，得到优质耐盐生香酵母。
文档编号C12N15/01GK101831386SQ200910037818
公开日2010年9月15日 申请日期2009年3月11日 优先权日2009年3月11日
发明者余遂贤, 元耿侨, 吴琼, 朱汉湖, 杨锡沛 申请人:开平市调味品技术创新中心