专利名称：一种柑橘果酒酿造酵母菌的筛选及柑橘果酒生产方法
技术领域：
本发明涉及一种高品质柑橘果酒酿造酵母菌的筛选及柑橘果酒生产方法，属于生物工程领域。
背景技术：
我国是世界上最大的水果生产国，而水果深加工业却一直很薄弱。果酒是以水果为原料经过发酵而成的低度饮料酒，富含糖、有机酸、酯类及多种维生素，含有丰富的具有增强免疫功能的S0D。果汁中的主要成分是糖类，酵母菌则是以糖类物质为基质进行发酵，生成酒精和一定量的香味物质。所以酵母品种是酿造果酒的关键因素之一，酵母性状的好坏直接影响到所酿果酒的口感和风味，决定果酒品质的优劣。果酒有很多种，其中以葡萄酿造的葡萄酒规模最大，目前使用的果酒酵母多为葡萄酒酿造专用酵母。我国是柑橘生产大国，具有丰富的资源，但高品质柑橘酒酿造酵母很少。因此筛选出一种高品质柑橘果酒酿造用酵母菌是柑橘果酒生产的关键课题。尽管果酒因其具有的营养和保健作用而备受现代人喜爱，但果酒酵母菌在生产或者发酵品质上仍然存在不少的问题1、专用发酵菌种缺乏，目前果酒生产中所采用的酵母大多数为葡萄酒酵母，这种酵母是针对葡萄酒生产工艺的特点开发出来的，在其他果酒生产中效果并不好。市场上缺少高品质的柑橘果酒酿造用的酵母菌。2、产品风味不稳定用筛选的纯种酿酒酵母作为发酵菌种酿造的酒通常风味过于平淡。因此，目前选育果酒酵母已不只局限于酿酒酵母cere而扩展到水果中天然存在的一些产香酵母、产酯酵母,如孢汉逊酵母属Hanseniaspora、克勒克酵母属JHoecAera和毕赤酵母属/7ZcAia等酵母的选育。这些酵母会对果酒的总体风味产生积极的影响，能生成很多芳香物质和特殊风味成分，使酒的风味特征明显改善。
3、产品质量不稳定有的新果酒产品刚上市不久，就出现了质量问题，主要表现为颜色加重、氧化感增加、果香变淡，严重时有失光、沉淀现象。果酒的质量不稳定与酵母菌的质量有关。本发明以野生柑橘-皱皮柑CYtrw1S verrucosa Hort.为原料，以发酵力和发酵原酒品质作为指标，筛选出了一株高品质柑橘果酒发酵专用酵母菌。
发明内容
本发明从江汉平原广泛分布的一种野生柑橘-皱皮柑的汁液中，采用微生物分离纯化的方法，获得了一种高品质果酒酿造专用酵母菌。该酵母菌经培养，用于柑橘果酒的酿造，酒质稳定、口感柔和。该酵母菌具有良好的应用前景。本发明高品质果酒酿制用酵母菌的筛选纯化及培养是这样进行的。具体步骤为1、将野生皱皮柑剥皮，榨汁，装入瓶中，在适宜温度下，皱皮柑汁液可进行自行发酵，酒体散发果香味，但品质不稳定，酒液呈淡淡酸味。证实野生皱皮柑中存在酿造果酒所用的酵母菌。2、收集自行发酵带酒香的皱皮柑汁液，吸取0.2mL涂布均匀涂布于装有已灭菌固体豆芽汁培养基的培养皿上，28°C恒温箱培养2d后进行镜检。从中挑取生长菌落良好，有明显酵母菌菌落特征，呈酒香的菌体。在无菌操作台上，挑取选定的酵母菌划线接种于新鲜斜面培养基上，培养3d。除了酵母菌外还伴有少量霉菌，进一步进行纯化，挑取形态特征突出的酿酒酵母菌分区划线，重复以上步骤:T5次，直到分离出纯单菌株。经培养，单菌株在斜面培养基上生长的菌落呈乳白色，酵母菌长势良好，并伴有浓郁的酒香味。将该分离纯化培养的柑橘果酒酿造专用酵母菌于2012年11月22日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No =2012472,名称为酿酒酵母ZGJ-KfeccAart與fcmcerevisiae ZGJ-1 )。保藏地址中国.武汉.武汉大学。以下简称ZGJ-1。ZGJ-1菌株的菌学特性
a、形态特征细胞个体呈球形或椭圆形，大小为5. 2MmX 12. 7Mm0单个或成双，芽殖；培养物为奶油状；菌落中间呈圆锥状凸起、表面光滑、边缘整齐；有浓郁的酒香味，在培养基上生长速度快。b、生理生化特征ZGJ-1与GenBank上其他酵母菌的18S rRNA和26S rRNA核苷酸序列的一致性分别为99%和97%,该菌株属于酿酒酵母cerevisiae0在碳源的氧化测定中，当以蔗糖、a -D-葡萄糖为唯一碳源时，GZJ-1具有强氧化能力，测定结果呈阳性，菌株生长能力好，代谢产物积累显著；当以D-棉子糖为唯一碳源时，GZJ-1氧化能力呈弱阳性，菌株生长能力较弱，代谢产物积累不显著。在碳源利用上，ZGJ-1可以有效利用蔗糖和a -D-葡萄糖，其次利用D-棉子糖和水苏糖，不能利用龙胆二糖、麦芽糖、D-半乳糖、核糖醇等。该菌株 最适生长温度范围为26 28°C。本发明应用酿酒酵母ZGJ-1 (CCTCC No :2012472)用于柑橘果酒酿造的生产方法，其步骤为
1、原料处理选用成熟度高、无腐烂的柑橘为原料，清洗一去皮、分瓣一蒸锅蒸3飞min，钝化柑橘中的酶一用榨汁机打成浆一用灭菌的双层纱布过滤于发酵瓶中一得到柑橘果浆，测出果浆的总糖度10%，并记录结果；
2、果汁澄清(果胶酶处理):测定柑橘果浆的原始pH(pH=4. 5)，分装在灭菌的发酵瓶中，加入0. 2%的果胶酶，50°C静置澄清4h，待澄清完全，取上清液调整柑橘果浆糖度为20% (若没有达到，则加白砂糖进行微调)。3、主发酵在含澄清已灭菌的果汁发酵瓶中，按照比例为5 10% (最佳7%)加入上述扩培后的种子液，同时按6(T80mg/L的比例加入偏重亚硫酸钾，在20±1°C条件中静置发酵扩12天，过滤即得柑橘果酒发酵原液；
4、果酒品质的指标测定结果测定发酵原液的各项指标，用pH酸度计测酸度、糖度计测糖度、用酒精计测乙醇含量。结果表明，用酿酒酵母ZGJ-1所酿造的果酒，其酸度(以柠檬酸计，mol/L)为0. 28、糖度(以葡萄糖计，g/L)为5. O、酒度(％vol)为12，三项指标显示该发酵液已达到果酒国标要求。该果酒的品质指标明显优于皱皮柑自行发酵15d后的果酒品质(酸度为0. 26、糖度为5. 0和酒度为4)。5、发酵原酒品质(感官评定)发酵产出的酒液经后酵2°C贮藏2个月即为成品柑橘果酒。外观评价色泽和澄清度。用酿酒酵母ZGJ-1所酿造的果酒颜色为淡黄色，为柑橘果酒应有之色泽，酒体澄清透明、有光泽；具有纯正和谐的柑橘果香，口味清爽细腻，酒体丰满，具有柑橘果酒的独特性。高品质果酒酿造酵母菌ZGJ-1的凝聚性及发酵力测定1、凝聚性试验将酿酒酵母ZGJ-1与法国原装酿酒酵母K1、市售安琪酵母分别接种于豆芽汁液体培养基中，25°C培养5d。取培养液以3500 r/min离心15min，收集酵母细胞，然后用无菌水洗涤2 3次。准确称取酵母泥lg，放入15mL的离心管中，然后加入IOmL醋酸缓冲溶液摇匀，使其成悬浮状态，并在20°C水浴中静置20min，再将此悬浮液连续摇动5min，使酵母重新悬浮，再静置，在20min内每Imin记录I次沉淀酵母的容积，根据悬浮液静置IOmin的沉淀容积确定凝聚性的强弱。本发明酵母菌的本斯值为2. 3mL，凝聚性为较强-适中，比法国酿酒酵母Kl和市售安琪酵母的凝聚性好，达到了优质酵母的标准。2、发酵力的测定采用失重法测定发酵力。将活化好的酿酒酵母ZGJ-1接入已灭菌的豆芽汁液体培养基，25°C发酵。发酵时每24h测I次重量,培养12d，以不接菌种的豆芽汁培养基作为空白对照。培养12d后，ZGJ-1的总发酵力达到了 12. 79g/50mL。在发酵过程中失重高峰在前5d，说明该酵母菌发酵旺盛期是前5d，发酵力为7. 36g/50mL。本发明的优点及应用前景
本发明从江汉平原广泛分布的一种野生柑橘-皱皮柑的汁液中分离得到了一株适应柑橘发酵的优良菌株。由于该菌株是从皱皮柑汁液中分离出来的，皱皮柑偏酸(PH=4. 5)、偏苦，所以该酵母菌株能够用于生产耐受果汁酸度的果酒。通过鉴定该菌株为酿酒(高产酒)酵母菌类型。将本发明酵母菌ZGJ-1与法国酿酒酵母Kl及市售安琪酵母三种菌株产气性能、产酒精能力、凝聚性、产香能力及感官评定进行比较，发现本发明酵母菌的发酵能力强、发酵特性好、发酵所得柑橘果酒品质优，且酒体澄清透明、色泽淡黄，具有果酒的典型风味。利用酿酒酵母ZGJ-1酿造的营养型 柑橘果酒，品质良好，已展现出良好的利用潜力。
图1本发明酵母菌株ZGJ-1的菌落形态，
图2本发明酵母菌株ZGJ-1的细胞形态(400X )。
具体实施例方式 实施例1 :高品质果酒酿制用酵母菌ZGJ-1的分离、纯化及培养1、将野生皱皮柑剥皮，榨汁，装入瓶中，在适宜温度下，皱皮柑汁液可进行自行发酵，酒体散发果香味，但品质不稳定，酒液呈淡淡酸味。初步判定野生皱皮柑中存在有酿酒用酵母菌。2、在无菌操作台上，将此酵母菌涂布于含有灭菌豆芽汁固体培养基的培养皿上，放入28°C恒温箱中培养。3d后，发现培养基中除了酵母菌外还伴有少量霉菌。挑取酵母菌接种在重新配制的新鲜培养基上，培养3d后，重复以上步骤，直到分离出酵母菌纯单菌株。在培养基上菌落呈乳白色，酵母菌长势良好，较湿润、透明，并伴有酒香味(见图1)。根据菌落特征，确定为酿酒酵母cerevisiae系列。挑取酵母菌单菌体做装片,在显微镜下可以观察到酵母菌的形态(见图2)。细胞为圆形或椭圆形，大小为5. 2MfflX 12. 7Mm。将该菌株进一步划线培养后送鉴定，命名为酵母菌ZGJ-1，保藏号为CCTCC No :2012472。实施例2 :将酵母菌ZGJ-1 (CCTCC No =2012472)用于酿造柑橘果酒1、原料处理选用成熟度高、无腐烂的新鲜柑橘IOkg为原料。清洗一去皮、分瓣一蒸锅蒸:T5min，钝化柑橘中的酶一用榨汁机打成浆一用灭菌的双层纱布过滤于灭菌后发酵罐中—得到柑橘果浆。测出果汁的总糖度，并记录结果。2、果胶酶处理测定柑橘果浆的原始pH，加入0. 2%的果胶酶，50°C下静置澄清4h，待澄清完全，取上清液调整柑橘果浆糖度为20%，若没有达到，则加白砂糖进行调节。3、主发酵在灭菌的发酵瓶中，加入5^10% (最佳7%)的本发明酵母菌ZGJ-1，按6(T80mg/L的比例加入偏重亚硫酸钾，在20土1°C条件中静置发酵9_12d，即得柑橘果酒发酵液。4、果酒品质的测定结果用本酵母菌所酿造的果酒，其酸度(以柠檬酸计，mol/L)为0. 28、糖度(以葡萄糖计，g/L)为5. O、酒度(％vol)为12 (若发酵液继续保温发酵3d，酒度可达到18)，符合果酒国标要求。该酿造果酒的品质指标也明显优于皱皮柑自行发酵15d后的果酒品质(酸度为0. 26、糖度为5. 0和酒度为4)。实施例3 :柑橘果酒酿造时果胶酶添加量的确定1、选用成熟度高、无腐烂的新鲜柑橘为原料；清洗一去皮、分瓣一蒸锅蒸T5min，钝化柑橘中的酶一用榨汁机打成浆一用灭过菌的双层纱布过滤于发酵瓶中一得到柑橘果浆。测出果汁的总糖度，并记录结果。2、果胶酶处理测定柑橘果浆的原始pH，分装在灭菌的发酵瓶中并编号，分别加入含量为0. 1%、0. 2%、0. 3%和0. 4%的果胶酶。将发酵瓶放在50°C恒温箱内静置澄清4h，然后分别取上清液在波长610nm处测定透光率，并记录结果。若透光率越大，则表明过果汁的澄清度越高。由表I知添加0.2%的果胶酶，透光率可达到95%，果汁清澈。故本发明所采用果胶酶添加量为0. 2%。表I不同果胶酶用量下发酵液的粘度
权利要求
1.一种柑橘果酒酿造酵母菌，保藏号为CCTCC NO: 2012472;具备发酵能力强、产酒高、产香好的特点。
2.一种柑橘果酒生产方法，其步骤为 ⑴原料处理选用成熟度高、无腐烂的柑橘为原料，清洗一去皮、分瓣一蒸锅蒸3-5min，钝化柑橘中的酶一用榨汁机打成浆一用灭菌的双层纱布过滤于发酵瓶中一得到柑橘果浆，测出果浆的总糖度，并记录结果； ⑵果汁澄清及果胶酶处理测定柑橘果浆的原始PH，分装在已灭菌的发酵瓶中，加入0.2%的果胶酶，50°C静置澄清4h，待澄清完全，取上清液调整柑橘果浆糖度为20%，若没有达到，则添加白砂糖进行微调； ⑶将保藏号为CCTCC NO: 2012472的酿酒酵母ZGJ-1用豆芽汁培养基进行斜面培养，然后进一步在250mL灭菌的三角瓶内进行逐级扩培，最终制备种子液； ⑷主发酵在含澄清已灭菌的果汁发酵瓶中，按照比例为5 10%加入上述扩培后的种子液，同时按6(T80mg/L的比例加入偏重亚硫酸钾，在20± 1°C条件中静置发酵9-12d，过滤即得柑橘果酒发酵原液； (5)果酒品质的指标测定发酵完后，用pH酸度计测酸度、糖度计测糖度、用酒精计测乙醇含量； (6)发酵产出的原酒液经后酵2°C贮藏2个月即得成品柑橘果酒。
3.根据权利要求2所述的一种柑橘果酒生产方法，其特征在于步骤中，上述果胶酶最佳加入量为0. 2% ;上述种子制备液最佳加入量为7%。
全文摘要
本发明提出了一种柑橘果酒酿造酵母菌，保藏号为CCTCC NO2012472，及其用它酿造高品质柑橘果酒的生产方法。其步骤为原料处理、果汁澄清(果胶酶处理)、发酵种子制备、主发酵、过滤除渣得原酒液，再经后酵2℃贮藏2个月即为成品柑橘果酒。利用本发明酿造的柑橘果酒颜色为淡黄色，酒体澄清透明、有光泽；具有纯正独特的柑橘果香，口味清爽细腻，酒体和谐丰满，余味悠长，具备柑橘果酒的典型特征。此发明将为果农在柑橘深加工方面打开一条致富之路。
文档编号C12N1/18GK103045495SQ20121056188
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月22日 优先权日2012年12月22日
发明者彭宇, 孙美玲, 杨艳燕, 杨登想, 杨烨, 刘芳, 柴静 申请人:湖北大学