专利名称：一种壳聚糖修饰提高胆固醇氧化酶稳定性的方法
技术领域：
本发明涉及一种壳聚糖修饰提高胆固醇氧化酶稳定性的方法，属于酶工程技术领域。
背景技术：
胆固醇氧化酶(COD)是胆固醇代谢过程中关键酶，能专一性催化胆固醇转化为胆甾-4-烯-3-酮，它作为一种胆固醇检测酶应用于医疗检测领域。同时，在食品开发、抗虫基因工程、生物农药等方面也具有广泛应用价值。 由于胆固醇氧化酶在保存、运输过程中易失活，因此提高其稳定性是该酶大量应用的基础。目前，提高酶稳定性方法主要有，蛋白质工程、固定化、添加保护剂、化学修饰等，其中固定化是较为常用的方法。本发明中使用碳二亚胺法及戊二醛法修饰胆固醇氧化酶，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)是一种将氨基和羧基偶联的缩合剂，载体或蛋白羧基被碳二亚胺活化，生成中间产物，该产物再与蛋白氨基反应形成结合物；戊二醛作为双功能试剂，广泛应用于酶固定化中。
发明内容
本发明的目的是克服了上述现有技术中的缺点，提供提高胆固醇氧化酶稳定性的方法，本发明设计巧妙、条件温和、易操作、成本低、环境污染小、适于大规模应用。为了实现上述目的，本发明的技术方案一种壳聚糖修饰提高胆固醇氧化酶稳定性的方法，A、采用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺交联或B、采用戊二醛交联，步骤为
利用壳聚糖20000作为修饰工具，将壳聚糖的活性氨基与胆固醇氧化酶的活性氨基或羧酸基交联；反应时间为16-20小时，所述反应温度为4-10°C。为了实现上述目的，在交联之前需要研究胆固醇氧化酶分子表面羧酸基及氨基数目，所述单个胆固醇氧化酶分子表面羧酸基数目为45个，氨基数目为60个。较佳地，当采取EDC交联法时，所述酶分子游离羧酸基与壳聚糖氨基摩尔比1:10，游离羧基与EDC摩尔比为1: 2，所述反应pH为6. O。较佳地，所述反应时间为16-20小时，所述反应温度为4-10°C。较佳地,所述反应后使用S印harose 4B介质进行分子筛层析去除为反应物质。较佳地，当采取戊二醛交联法时，所述酶分子游离氨基与壳聚糖氨基摩尔比1:2，酶游离氨基与戊二醒摩尔比为1:2,所述反应pH为8. O。较佳地，所述反应时间为16-20小时，所述反应温度为4-10°C。较佳地,所述反应后使用Sepharose 4B介质进行分子筛层析去除为反应物质。所述固定化酶的热、pH和存储稳定性均优于游离酶。本发明的有益效果1、本发明在固定前，分析了胆固醇氧化酶分子表面酸性与碱性氨基酸分布情况，便于其后进行修饰；
2、本发明以壳聚糖20000为修饰物，通过化学合成法将其与胆固醇氧化酶连接；
3、本发明优化了胆固醇氧化酶修饰条件，增强了操作的精确性。
图1是胆固醇氧化酶分子表面羧酸基分布图。
图2是胆固醇氧化酶分子表面氨基分布图。图3是不同pH对修饰COD活力的影响。图4是游离羧基与EDC摩尔比及COD氨基与戊二醛摩尔比对修饰COD活力的影响。图5是原始酶和修饰酶的热稳定性。图6是原始酶和修饰酶的pH稳定性。图7是原始酶和修饰酶的存储稳定性。
具体实施例方式为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。实施例1胆固醇氧化酶羧酸基与壳聚糖氨基摩尔比对修饰COD活力的影响
取20-30g/L壳聚糖20000溶液于15 mL的离心管中，按照不同胆固醇氧化酶羧基与壳聚糖氨基摩尔比(1: 5、1:10、1:20、1:40、1:80、1:120)加入EDC和胆固醇氧化酶的量，加入磷酸缓冲液至总体积为10mL，调节溶液pH至6. 0，4-10°C、50 r/min振荡固定16-20小时。反应液上S印harose 4B层析柱进行分子筛层析，获得经过修饰后分子量上升的组分，测定酶活力，计算相对酶活力(%)。相对酶活力(％)=[修饰酶活力/ (初始酶活力一未偶联酶活力)]X 100%
将不同修饰的酶置于37°C水浴锅内，24小时后测定酶活力，计算酶活力保留率(%)。酶活保留率(％) = (24小时后修饰酶活力/初始修饰酶活力)X 100%
摩尔比过高，酶分子紧密堆积抑制底物与酶活性部位反应，造成酶活力下降，所以，摩尔比1:10对稳定性作用最佳,结果见表2。表I胆固醇氧化酶羧酸基与壳聚糖氨基摩尔比对修饰COD活力的影响
胆固醇氧化酶羧酸基与壳聚糖氨基摩尔比I酶活力保留率(%)_
1:120_49^_
178059.3
174065.4
172072.2
TTlO85.3
175丨74.3
胆固醇氧化酶酶活力单位定义37 °C、1分钟转化I ymol胆固醇生成胆
甾-4-烯-3酮的酶量定义为I个酶活单位(U)。胆固醇氧化酶酶活的测定方法胆固醇氧化酶催化氧化I mol胆固醇成为I mol胆甾-4-烯-3-酮，同时产生I mol过氧化氢。胆甾-4-烯-3-酮在240 nm处有最大吸收峰，而过氧化氢在过氧化氢酶的作用下能将4-氨基-安替比林、苯酚转化为醌亚胺呈红色，在500 nm处有最大吸收峰。通过检测紫外吸收强度或通过比色就可以测定胆固醇的含量，从而计算出胆固醇氧化酶的酶活单位。
3 mL溶液A ( 4_氨基-安替比林I mmol/L、苯酹6 mmol/L;叠氮钠O. 2 g/L;过氧化物酶5 000U /L ;磷酸钾缓冲液25 mmol/L, pH 7. 5)，150yL溶液B (胆固醇8.26 g/L; Triton X-100 4. 26 %;异丙醇为溶剂)，50yL 酶液，37 °C、反应 5 min，沸水浴3 min，于 500 nm 测吸光值 0D500。酶活(U/mL) =1. 6832 X0D500。实施例2不同pH对EDC法修饰COD活力的影响
取壳聚糖20000溶液于15 mL的离心管中，按照游离羧基与EDC摩尔比1:10、胆固醇氧化酶羧基与壳聚糖氨基摩尔比1:10加入EDC和胆固醇氧化酶的量，加入磷酸缓冲液至溶液总体积为 10mL，设计不同 pH 条件(5、5·5、6·0、6·5、7·0、7·5、8·0、8·5)，4-10 °C >50 r/min振荡固定16-20小时。反应液上S印harose 4B层析柱进行分子筛层析，获得经过修饰后分子量上升的组分，测定酶活力，计算相对酶活力(%)。相对酶活力(％)=[修饰酶活力/ (初始酶活力一未偶联酶活力)]X 100%
PH较低时，COD易失活，造成酶活力降低，pH过高时，则可能COD结构破坏，不利于EDC活化载体羧基，使得酶活力下降，因此反应最优PH为6. O,结果见图3。实施例3总羧基与EDC摩尔比对修饰COD活力的影响
取壳聚糖20000溶液于15 mL的离心管中，按照胆固醇氧化酶羧酸基与壳聚糖氨基摩尔比为1:10的比例添加胆固醇氧化酶的量，并且按照不同总羧基与EDC摩尔比(1:1、1:2、1: 5、10:1、1:20和1:40)加入EDC的量，加入磷酸缓冲液至溶液总体积为10mL，调节溶液pH至6. 0,4-10°C、50 r/min振荡固定16-20小时。反应液上Sepharose 4B层析柱进行分子筛层析，获得经过修饰后分子量上升的组分，测定酶活力，计算相对酶活力(%)。相对酶活力(％)=[修饰酶活力/ (初始酶活力一未偶联酶活力)]X 100%
当摩尔比较低时，酶活力逐渐降低，EDC浓度过高，可能引起酶分子内或分子间交联，造成酶分子失活变性，酶活力下降，因此反应最优摩尔为1:2结果见图4。实施例4胆固醇氧化酶氨基与壳聚糖氨基摩尔比对修饰COD活力的影响
取壳聚糖20000溶液于15 mL的离心管中，按照总氨基与戊二醛摩尔比1:2、不同胆固醇氧化酶氨基与壳聚糖羧基摩尔比(1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、1:10)加入戊二醛和胆固醇氧化酶的量，加入磷酸缓冲液至总体积为10mL，调节溶液pH至8. 0，4_10°C、50 r/min振荡固定16-20小时。反应液上S印harose 4B层析柱进行分子筛层析，获得经过修饰后分子量上升的组分，测定酶活力，计算相对酶活力(%)。相对酶活力(％)=[修饰酶活力/ (初始酶活力一未偶联酶活力)]X 100%
将不同修饰的酶置于37°C水浴锅内，24小时后测定酶活力，计算酶活力保留率(%)。酶活保留率(％) = (24小时后修饰酶活力/初始修饰酶活力)X 100%
摩尔比过高，酶分子紧密堆积抑制底物与酶活性部位反应，造成酶活力下降，所以，摩尔比1:10对稳定性作用最佳,结果见表2。表2胆固醇氧化酶氨基与壳聚糖氨基摩尔比对修饰COD活力的影响
权利要求
1.一种壳聚糖修饰提高胆固醇氧化酶稳定性的方法，其特征在于，A、采用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺交联或B、采用戊二醛交联，步骤为 A、采用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺交联用调整胆固醇氧化酶分子游离羧酸基与壳聚糖氨基摩尔比为1:10，胆固醇氧化酶分子的游离羧基与交联剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺EDC摩尔比为1:2，控制EDC交联pH为6.0，反应温度为4-10°C，反应16-20小时； 或B、采用戊二醛交联调整胆固醇氧化酶分子游离氨基与壳聚糖氨基摩尔比为1:2，胆固醇氧化酶游离氨基与交联剂戊二醛摩尔比为1:2，控制戊二醛交联pH为8. 0，反应温度为4-10°C，反应16-20小时； 采用A或B交联后,均使用Sehparose 4B介质进行分子筛层析,去除未修饰的蛋白和壳聚糖。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述壳聚糖分子量为20000。
全文摘要
一种壳聚糖修饰提高胆固醇氧化酶稳定性的方法，属于酶工程技术领域。本发明通过交联剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)或戊二醛等对胆固醇氧化酶与壳聚糖20000进行连接，修饰后的酶在热、pH和存储稳定性方面均优于游离酶，本发明易操作、成本低、环境污染小、适于大规模应用。
文档编号C12N9/04GK103013968SQ20121056104
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月21日 优先权日2012年12月21日
发明者辛瑜, 夏小乐, 张玲, 王武 申请人:江南大学