Ndm-1 dna探针修饰的电极及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了NDM-1 DNA探针修饰的电极及其制备方法和应用，NDM-1 DNA探针修饰的电极是在金电极表面固定NDM-1 DNA探针，再封闭非特异性吸附位点而得，并且电极的制备方法简单、特异性好、灵敏度高；以该电极为工作电极、铂电极为对电极、饱和甘汞电极为参比电极、pH 7.4含2mmol/L K3Fe(CN)6-K4Fe(CN)6和5mmol/L KCl的磷酸盐缓冲液(PBS)为实验电解液组建电化学生物传感器，可以快速、特异、灵敏地检测NDM-1基因，为临床药物和食品中潜在耐药细菌的检测提供简单、快速、灵敏、特异、高通量的工具，具有较好的市场价值。
【专利说明】NDM-I DNA探针修饰的电极及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于检测领域，特别涉及NDM-I DNA探针修饰的电极，还涉及该电极的制备 方法和应用。
【背景技术】
[0002] NDM-I多重耐药菌是指携带NDM-I耐药基因的细菌，属于革兰阴性耐药菌。NDM-I 的全称是"新德里金属-目-内醜胺酶"，是1种高效耐药酶。研究显示，目前多重耐药菌正 在全球快速传播，其感染病例在全球均有分布，带来的风险越来越大，并且已经在人类重要 的致病菌志贺氏菌中发现了 NDM-1，预示了全球NDM-I多重耐药菌防控形势极为严峻。该病 菌可通过饮水等途径传染，表现症状为肠道感染，携带NDM-I耐药基因的细菌几乎对目前 临床上使用的大多数抗生素都具有抗药性，其感染后死亡率很高。抗生素滥用是NDM-I耐 药基因出现的首要原因，并且NDM-I基因可W在细菌之间传播，从而使对抗生素敏感的细 菌获得耐药性。因此，研发NDM-I直接快速特异的检测方法，对NDM-I在临床早诊早治具有 非常重要的意义。
[0003] 目前，NDM-I多重耐药菌的诊断主要包括表型筛查、表型确认和基因确证等3个步 骤。表型筛查是在细菌药物敏感性测定中，W美洛培南或亚胺培南纸片法化-B法）或最低 抑菌浓度one)测定法对肠杆菌科细菌产酶情况进行初步筛查；表型确认是采用双纸片协 同实验或亚胺培南（美洛培南）/邸TA复合纸片，进行K-B法药敏试验来判定产金属酶；基 因确证是采用NDM-I的基因特异引物进行PCR扩增及产物测序，确定菌株是否携带NDM-I 基因。但该些诊断方法存在着费时烦琐、敏感性和特异性较低及检测成本高等缺陷。
[0004] 在众多的检测技术中，传感器技术是最具发展前景的检测手段之一。生物传感器 主要是由生物膜与物理化学的换能器有机结合的一口交叉型学科，是一种先进的生物技术 检测方法，也是分子水平的微量、快速的分析方法，目前已经在生物工程和医疗等多个领域 得到迅速的发展。电化学DNA生物传感器是近年发展起来的一种新型生物传感器，主要是 利用单链DM作为敏感元件通过共价键合或化学吸附固定在固体电极表面，通过测定识别 杂交信息的电活性物质从而达到检测祀序列的目的。相对于其他类型传感器而言，电化学 DNA生物传感器具有分析时间短、设备微型化、特异性强、灵敏度高、检测限低、操作简捷、成 本低廉及无特殊场地要求等优点，目前电化学传感器已有应用于一些病原菌的检测，但尚 未见用电化学DNA生物传感器检测病原菌耐药基因的报道。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供NDM-I DNA探针修饰的电极；本发明的目 的之二在于提供NDM-I DNA探针修饰的电极的制备方法；本发明的目的之H在于提供检 测NDM-I的电化学生物传感器；本发明的目的之四在于上述电极或电化学生物传感器的应 用；本发明的目的之五在于提供利用检测NDM-I的电化学生物传感器检测NDM-I基因的方 法。
[0006] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0007] UNDM-I DNA探针修饰的电极，所述电极是在金电极表面固定NDM-I DNA探针，再 封闭非特异性吸附位点而得。
[000引优选的，所述NDM-I DNA探针的核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0009] 2、所述NDM-I DNA探针修饰电极的制备方法，包括如下步骤：
[0010] a.将金电极打磨，抛光，清洁，干燥，得清洁的金电极，备用；
[0011] b.向步骤a所得清洁的金电极表面滴加含NDM-I DNA探针的溶液，固定后用琉基 己醇溶液封闭，清洗得NDM-I DNA探针修饰的电极。
[0012] 优选的，步骤a是将金电极分别用0. 3 U m、0. 05 U m的Al2〇3粉末打磨抛光，每次打 磨后用水洗净，再分别于硝酸、丙丽和水中各超声洗涂，干燥，备用。
[0013] 优选的，步骤b是向步骤a所得清洁的金电极表面滴加NDM-I DNA探针浓度为 0. 5?2. 5 y M的溶液，固定后用浓度为Immol/L的琉基己醇溶液封闭，清洗得NDM-I DNA探 针修饰的电极。
[0014] 优选的，溶液中NDM-I DNA探针浓度为1. 5 y M。
[0015] 优选的，所述固定的条件为37C下恒温1小时。
[001引 3、检测NDM-I的电化学生物传感器，包括工作电极、对电极、参比电极和实验电解 液；所述工作电极为所述NDM-I DNA探针修饰的电极，所述对电极为笛电极，所述参比电极 为饱和甘隶电极，所述实验电解液为抑7. 4的含2mmol/L Ks化(CN)e-K4Fe(CN)e和5mmol/L KCl的磯酸盐缓冲液（PBS)。
[0017] 4、所述NDM-I DNA探针修饰的电极或所述检测NDM-I的电化学生物传感器在检测 NDM-I基因中的应用。
[0018] 5、利用所述检测NDM-I的电化学生物传感器检测NDM-I基因的方法，包括如 下步骤：将NDM-I DNA探针修饰的电极与样品溶液杂交反应，然后W NDM-I DNA探针修 饰的电极为工作电极，笛电极为对电极，饱和甘隶电极为参比电极，pH 7.4的含2mmol/ LKjFe (CN) e-K/e (CN) e和5mmol/L KCl的PBS为实验电解液构建电化学生物传感器，采用循 环伏安法进行扫描测定，电位扫描范围为-0. 3V?0. 7V，电位扫描速率为50mv/s，根据杂交 前后峰电流变化检测NDM-I基因浓度。
[0019] 本发明的有益效果在于；本研究利用探针的高特异性，针对NDM-I基因组序列，设 计NDM-I基因的特异性探针，将NDM-I基因的特异性探针修饰金电极后获得NDM-I DNA探 针修饰的电极，然后与电化学技术相融合获得检测NDM-I基因的电化学生物传感器，从而 构建检测NDM-I基因的平台，为多重耐药菌的检测提供简单、快速、灵敏、特异的工具。同时 本发明通过将电化学领域的检测手段引入到生物医学的领域，并探索了 NDM-I电化学生物 传感器在液相中的响应机理，为检测NDM-I基因的电化学生物传感器在生物医学检测中的 应用奠定了坚实的理论基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图： [002U 图1为不同修饰电极的循环伏安图。a;裸电极在抑7.4含2mmol/L K3[Fe(CN)J/ KJFe (CN) e]和5mmol/l KCl的PBS中的循环伏安曲线；b ;电极表面修饰探针在抑7. 4含 2mmol/L K3[Fe(CN)e]/K4[Fe(CN)J 和 5mmol/l KCl 的 PBS 中的循环伏安曲线；C ;琉基己醇 封闭电极在抑7. 4含2mmol/L Ks田e (CN)日]/? [Fe (CN)日]和5mmol/l KCl的PBS中的循环 伏安曲线；d ;检测液是大肠杆菌/金黄色葡萄杆菌溶液在抑7. 4含2mmol/L Ks [Fe (CN) J/ KJFe (CN) e]和5mmol/l KCl的PBS中的循环伏安曲线；e ;检测液中加入NDM-I祀序列后， 电极在抑7. 4 含 2mmol/L Ks [Fe (CN) e]/? [Fe (CN) e]和 5mmol/l KCl 的 PBS 中的循环伏安曲 线；f:裸电极在抑7.4 不含 2mmol/L Ks田e (CN)6]/?田e (CN)S]和 SmmoVl KCl 的 PBS 中的 循环伏安曲线。
[0022] 图2为不同浓度探针修饰电极的循环伏安图。
[0023] 图3为不同检测物质对传感器响应电流的影响。
[0024] 图4为电化学生物传感器定量检测NDM-I线性回归（C =NDM-I祀序列浓度（y g/ L)，LgC =NDM-I祀序列浓度的对数）。
【具体实施方式】
[0025] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
[0026] 本发明在长期压电传感器和漏声表面波传感器研究的基础上，将电化学分析方法 与生物检测技术相结合，自主创建了能够快速、特异、灵敏地检测NDM-I基因的电化学生物 传感器。
[0027] 实施例1、NDM-I DNA探针合成及修饰电极
[0028] 本发明针对NDM-I全基因组，设计NDM-I DNA探针，探针的具体序列为： 5' -gcttttggtggctgcctgat-3' (SEQ ID NO. 1)〇
[0029] NDM-I DNA探针修饰的电极，具体步骤如下：
[0030] a.金电极的清洗：取直径为3mm的金电极，分别用0. 3 y m、0. 05 y m的AI2O3粉末 打磨抛光成镜面，每次打磨后均用超纯水冲洗，再分别于硝酸、丙丽及超纯水中各超声洗涂 Smin，干燥，得清洗的金电极，备用。
[0031] b.NDM-1 DNA探针的固定；取20yL NDM-I DNA探针浓度为1.5ymol/L的溶 液滴加于已清洗的金电极表面，然后于37C下恒温箱中恒温1小时，再将电极浸入浓度 为Immol/L的琉基己醇溶液中封闭非特异性吸附位点1小时，封闭后用水清洗电极，即得 NDM-I DNA探针修饰的电极，4°C避光保存备用。
[0032] 实施例2、组建检测NDM-I的电化学生物传感器
[003引 WNDM-I DNA探针修饰的电极作为工作电极，饱和甘隶电极为参比电极，笛电极作 为对电极组建检测NDM-I的电化学生物传感器。将制备好的电化学传感器联入电化学工作 站，W pH 7. 4 的含 2mmol/L KsFe(CN)B-KJe(CN)B 和 5mmol/L KCl 的 PBS 为实验电解液，然 后在室温下利用循环伏安法进行扫描测定，工作电位为-0. 3V?0. 7V，扫描速度为50mV/s。 NDM-I的电化学生物传感器的检测原理为：利用NDM-I DNA探针修饰的电极表面发生核酸 杂交反应后，生成的杂交复合物阻碍了电极表面的电子传递，使传感器响应电流变化值增 大。该信号变化的大小A I与电极表面核酸杂交反应的程度成正相关，A I值越大，表明电 极表面修饰的NDM-I DNA探针与待测物结合的量越多。制备好的NDM-I DNA探针修饰的电 极测定的初始还原峰电流记为I。；核酸杂交反应结束后，测定的还原峰电流并记为I ;则峰 电流在核酸杂交反应前后变化A I = I - I。。W下W此原理为依据对NDM-I进行定量检测。
[0034] 实施例3、检测NDM-I固定不同修饰金电极的电化学特性
[0035] 利用循环伏安法表征电极在修饰及检测过程中的电化学特性，具体检测方法为： 将不同修饰的电极按实施例2的方法组建电化学生物传感器后，分别将电极浸泡在150 U L NDM-I祀序列终浓度为100 y g/L的溶液（pH7. 40. Imol/Lro巧中，在38°C恒温箱中杂交45 分钟后取出，利用循环伏安法表征电化学生物传感器检测固定不同修饰物金电极的电化学 特性。杂交过程中传感器采用H电极体系测量传感器电流，获得的循环伏安曲线（CV)如图 1所示。其中，曲线a为裸金电极在抑7. 4含有2mmol/L K3[Fe(CN)e]/K4[Fe(CN)e]和5mmol/ I KCl的PBS溶液中的循环伏安曲线，由于PBS溶液中加入了氧化还原探针K3[Fe (CN)e]/ KJFe (CN) 6]，因此出现了一对准可逆的氧化还原峰；曲线b为NDM-I DNA探针修饰电极在 口^.4含2111111〇1/11(3的(0脚6]/1(4的(0脚6]和5111111〇1/11((：1的？85溶液中的循环伏安曲线， 由于NDM-I DNA探针是非导电性物质，在一定程度上阻碍了电子传递，所W氧化还原峰的峰 电流有所降低；曲线C为琉基己醇封闭后的循环伏安曲线，可见琉基己醇在封闭非特异性 吸附位点的同时也阻碍了电子传递，因此峰电流值进一步减小；曲线d为NDM-I DNA探针修 饰电极与含有干扰物质（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌）的溶液反应后的循环伏安曲线，与曲 线C相比，电极在赔育前后响应电流基本保持不变；曲线e为NDM-I DNA探针修饰电极在含 有IOOy g/LNDM-1的溶液中赔育后的循环伏安曲线，由于电极表面的核酸杂交复合物是没 有电活性的生物大分子，进一步阻碍了电极表面的电子传输，因此氧化还原峰的峰电流较 曲线d明显降低。曲线f为NDM-I DNA探针修饰电极在抑7.4不含2mmol/LK3[Fe(CN)e]/ KJFe(CN)J和5mmol/l KCl的PBS溶液中的循环伏安曲线，由于体系中缺少氧化还原活性 物质，在-0.3V?0.7V扫描范围内，NDM-I DNA探针修饰电极在PBS溶液中未出现氧化还 原峰。W上实验结果表明，NDM-I DNA探针修饰电极能够检测NDM-I祀序列，W其为工作电 极组建的NDM-I电化学生物传感器可检测NDM-I祀序列。
[0036] 实施例4、NDM-I DNA探针最佳浓度的优化
[0037] 为了确定NDM-I DNA探针的最佳浓度，本实施例对NDM-I DNA探针的浓度进行了 优化实验。首先将NDM-I DNA探针溶液配制成浓度分别为0. 5 y M、1. 0 y M、1. 5 y M、2. 0 y M、 2. 5 y M的溶液，然后分另Ij将它们修饰于金电极表面，巧Ij备成不同浓度NDM-I DNA探针修饰 的电极，并测定其循环伏安响应电流，实验结果见图2。结果显示，修饰NDM-I DNA探针前后 NDM-I DNA探针修饰的电极的循环伏安曲线有明显的差别，说明探针已成功固定于电极上。 从图2还可W看出，NDM-I DNA探针修饰电极的电流响应变化值随NDM-I DNA探针浓度的 增大呈先增大后下降的趋势，当NDM-I DNA探针浓度由0. 5 y M依次增至1. 5 y M时，响应电 流变化值呈上升的趋势；而当NDM-I DNA探针浓度从1. 5 y M递增至2. 5 y M时，响应电流变 化值则呈递减趋势；其中，当NDM-I DNA探针浓度为1. 5 y M时，传感器的响应电流变化值最 大。因此，NDM-I DNA探针的最佳浓度为1. 5 y M。
[003引实施例5、NDM-I电化学生物传感器的特异性和灵敏度试验 [00測 （1)特异性试验
[0040] 将NDM-I DNA探针修饰电极分别与W下溶液共赔育30分钟；溶液①含有100 y g/ L NDM-I祀序列；溶液②含有IOOy g/L NDM-I祀序列及干扰物质（大肠杆菌、金黄色葡萄球 菌浓度分别为Img/L);③只含有干扰物质（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌浓度分别为Img/L); 溶液④PBS溶液。赔育完成后，将NDM-I DNA探针修饰电极与笛电极、饱和参比电极按实施 例2的方法构建成电化学生物传感器，W抑7. 4含有2mmol/L Ks [Fe KN) e]/?的KN) e]和 5mmol/l KCl的PBS为实验电解液，在室温下采用循环伏安法进行扫描测定，电位扫描范围 为-0. 3V?0. 7V，电位扫描速率为50mv/s。分别记录响应电流值，并将所得峰电流值进行 比较，评价电化学生物传感器的特异性，结果如图3所示。结果显示，在溶液①及溶液②中 赔育的电极在赔育前后响应电流变化值（A I)分别为7. 9 y A和7. 3 y A，而在仅含有干扰物 质的溶液③和空白溶液④中赔育的电极在赔育前后响应电流基本保持不变。W上实验结果 表明，本发明构建的NDM-I电化学生物传感器抗干扰能力强，对NDM-I具有良好的选择性， 并能对NDM-I进行精确检测。
[0041] (2)灵敏度（Sensitivity)实验
[004引利用检测NDM-I祀序列后的NDM-I DNA探针修饰电极再进行检测NDM-I祀序列 终浓度分别为 10-5 U g/L，10-4 y g/L，10-3 y g/L，10-2 y g/L，10-1 y g/L，1. 0 y g/L，101 y g/L， l02yg/L溶液，操作步骤相同与上述相同，然后检测反应前后响应电流的变化，检测进行杂 交反应所引起的电流响应差值A I及反应所需时间，并对响应电流变化差值A I与NDM-I 浓度做线性回归，实验重复3次取平均值，结果如图4所示。结果显示，在杂交反应初始阶 段，由于大分子核酸杂交复合物部分阻塞了电极表面的电子传输通道，与空白对照相比，其 氧化还原峰电流值明显降低。随着NDM-I浓度从ICT 5U g/L增加到IO2U g/L，杂交反应引起 的相位变化值呈先上升后趋于饱和的曲线方式，且W IO2U g/L NDM-I浓度为饱和点。从图 4还可W看出，NDM-I浓度在ICT5U g/L?IO2U g/L的范围内时，其浓度的对数值与峰电流 呈良好的线性关系。其中线性回归方程为；y = 1. 1452X巧.8954,相关系数为0.9934。产 生上述结果原因是在NDM-I浓度逐渐升高的过程中，电极表面固定的特异性探针也逐渐结 合上更多的NDM-1，从而引起更大的响应电流变化值，当NDM-I浓度升高至IO 2U g/L时，电 极表面固定的特异性探针与NDM-I的结合已全部饱和，因此当继续增加NDM-I浓度时，已经 无法引起更大的响应电流变化值。同样，当NDM-I浓度低于g/L时，由于电极表面固 定的特异性探针无法结合到足够数量的NDM-I而无法进行精确检测。上述结果表明我们自 主构建的电化学DNA生物传感器具有较宽的线性范围和较低的检测限。
[0043] 最后说明的是，W上优选实施例仅用W说明本发明的技术方案而非限制，尽管通 过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可W在 形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
【权利要求】
1. NDM-1DNA探针修饰的电极，其特征在于，所述电极是在金电极表面固定NDM-1DNA探 针，再封闭非特异性吸附位点而得。
2. 根据权利要求1所述NDM-1DNA探针修饰的电极，其特征在于：所述NDM-1DNA探针 的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
3. 权利要求1或2所述NDM-1DNA探针修饰电极的制备方法，其特征在于：包括如下步 骤： a. 将金电极打磨，抛光，清洁，干燥，得清洁的金电极，备用； b. 向步骤a所得清洁的金电极表面滴加含NDM-1DNA探针的溶液，固定后用巯基己醇溶 液封闭，清洗得NDM-1DNA探针修饰的电极。
4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤a是将金电极分别用0. 3 μ m、 0. 05 μ m的A1203粉末打磨抛光，每次打磨后用水洗净，再分别于硝酸、丙酮和水中各超声洗 漆，干燥，备用。
5. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤b是向步骤a所得清洁的金电 极表面滴加 NDM-1DNA探针浓度为0. 5?2. 5 μ Μ的溶液，固定后用浓度为lmmol/L的巯基 己醇溶液封闭，清洗得NDM-1DNA探针修饰的电极。
6. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：溶液中NDM-1DNA探针浓度为 1. 5 μ M。
7. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述固定的条件为37°C下恒温1小 时。
8. 检测NDM-1DNA的电化学生物传感器，其特征在于：包括工作电极、对电极、参比电 极和实验电解液；所述工作电极为权利要求1或2所述NDM-1DNA探针修饰的电极，所述 对电极为钼电极，所述参比电极为饱和甘汞电极，所述实验电解液为pH 7.4的含2mmol/ LK3Fe (CN) 6-K4Fe (CN) 6 和 5mmol/L KC1 的磷酸盐缓冲液。
9. 权利要求1?2任一项所述NDM-1DNA探针修饰的电极或权利要求8所述检测NDM-1 的电化学生物传感器在检测NDM-1基因中的应用。
10. 利用权利要求8所述检测NDM-1的电化学生物传感器检测NDM-1基因的方法，其 特征在于，包括如下步骤：将NDM-1DNA探针修饰的电极与样品溶液杂交后，然后NDM-1DNA 探针修饰的电极为工作电极，钼电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，pH 7. 4的含 2mmol/L 1(和_)6-1(如_)6和5_〇1/1 KC1的磷酸盐缓冲液为实验电解液构建电化学生 物传感器，采用循环伏安法进行扫描测定，电位扫描范围为-〇. 3V?0. 7V，电位扫描速率为 50mv/s，根据杂交前后峰电流变化检测NDM-1基因浓度。
【文档编号】G01N27/48GK104237354SQ201410557704
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年10月20日 优先权日:2014年10月20日
【发明者】张立群, 王云霞, 府伟灵 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院