专利名称：一种罗非鱼激活素受体ⅱb重组蛋白的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体地，涉及一种罗非鱼激活素受体IIB重组蛋白的制备方法及其应用。
背景技术：
激活素(activin)属于转化生长因子β (TGF-β)超家族成员，是一类具有多种功能的生长和分化因子，具有调节垂体分泌卵泡刺激素(FSH)、促进红细胞系的分化等作用。激活素通过与靶细胞膜上的受体结合而传递信号，其受体分为两种类型即I型(ActRI)和II 型(ActR II )。激活素受体ActR (activin receptor)属于单次跨膜丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，由胞外结构域，跨膜结构域和胞内激酶结构域三部分组成。从AtT20细胞克隆的受体命名为激活素II型受体，目前在脊椎动物中发现两种激活素II型受体的存在，如ActRIIA或ACVR2，第二种激活素受体ActRIIB，或者称为ACVR2B。II型受体需要和I型受体结合形成二聚体才能发挥作用，I型受体招募并磷酸化受体调控的SMAD (R-SMAD), R-SMAD转位到细胞核中发挥转录因子的作用。ActRIIB有多种配体,如Myostatin通过与其结合调节肌肉生长。Myostatin，属TGF-beta超家族成员，是公认的肌肉生长的负调控因子。阻断Myostatin-ActRIIB-RSMAD途径对调控肌肉生长有重要意义。在小鼠，牛，狗等哺乳动物和金鱼等硬骨鱼中对该途径进行调控收到良好的临床上和生产上良好的效果。罗非鱼(Tilapia)，隶属于鲈形目、鲈形亚目、丽鱼科、罗非鱼属。目前被养殖的有15种，生长迅速，尤以幼鱼期生长更快。中国现已成为最大的罗非鱼生产国，截至2008年，我国罗非鱼产量占全球产量的49%。全球范围内对罗非鱼的需求仍在增加，使罗非鱼产量更快地增长是解决这一状 况的关键。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了满足罗非鱼需求的快速增长，公开了一种罗非鱼激活素受体IIB细胞外结构域基因片段。本发明的另一个目的是公开了一种罗非鱼激活素受体IIB蛋白的细胞外结构域。本发明的另一个目的是公开了一种罗非鱼激活素受体IIB基因。本发明的另一个目的是公开了一种罗非鱼激活素受体IIB蛋白。本发明的另一个目的是公开了扩增罗非鱼激活素受体IIB基因片段的引物。本发明的另一个目的是公开了一种含有罗非鱼激活素受体IIB细胞外结构域基因片段或罗非鱼激活素受体IIB基因的载体。本发明的另一个目的是公开了一种罗非鱼激活素受体IIB重组蛋白的制备方法。本发明的另一个目的是公开了一种罗非鱼激活素受体IIB重组蛋白在制备鱼苗苗种促生长剂或添加剂中的应用。为了实现上述目的，本发明是通过以下技术予以实现的一种罗非鱼激活素受体IIB细胞外结构域基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所
/Jn ο一种罗非鱼激活素受体IIB蛋白的细胞外结构域，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2 所示。一种罗非鱼激活素受体IIB基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。一种罗非鱼激活素受体IIB蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示。一对用于扩增罗非鱼激活素受体IIB基因片段引物，引物可以为F和R，其引物序列如SEQ ID NO: 5 6所示；或者引物为F7和R7，其序列如SEQ ID NO: 7 8所示；序列如SEQID NO: 5^6所示引物F和R是用于扩增罗非鱼激活素受体IIB细胞外结构域基因片段；序列如SEQ ID N0:7 8所示引物F7和R7是用于扩增罗非鱼激活素受体IIB基因的。进一步地，所述引物F含有KpnI内切酶位点，引物R含有终止密码子和HindIII内切酶位点。一种载体，所述载体包含SEQ ID NO:1或SEQ ID N0:3的基因片段。针对SEQ IDNO:1片段，该载体为大肠杆菌克隆载体pCR2.1-ActRIIB ;针对SEQ ID N0:3片段，载体为大肠杆菌表达载体pQE30- ActRIIB。进一步地，本发明提供了一种重组株，是由上述载体(表达载体)6转入大肠杆菌中所得。优选地，是上述 获得的表达载体PQE30- ActRIIB转入大肠杆菌M15中所形成的大肠杆菌重组株 PQE30- ActRIIB-M15。进一步地，本发明公开了一种罗非鱼激活素受体IIB重组蛋白的制备方法，包括如下步骤
51.将权利要求6或7所述表达载体转入大肠杆菌中，利用氨苄青霉素抗性基因筛选阳性转化子；
52.将阳性转化子接种在含有氨苄青霉素的液体培养基中，培养过夜，次日接种于相同培养基中，并经IPTG诱导，培养后收集菌体，经分离纯化得到重组罗非鱼激活素受体IIB。优选地，制备方法如下
51.将所述表达载体PQE30-ActRIIB转入大肠杆菌M15中，利用氨苄青霉素抗性基因筛选阳性转化子PQE30- ActRIIB-M15 ；
52.将阳性转化子pQE30-ActRIIB-M15接种在含有氨苄青霉素的液体培养基中，培养过夜，次日接种于相同培养基中，并经IPTG诱导，培养后收集菌体，经分离纯化得到重组罗非鱼激活素受体IIB。更优选地，步骤S2为将阳性转化子pQE30- ActRIIB-Ml5接种在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，370C，200转/分培养过夜，次日接种于相同培养基中，并经IPTG诱导，37°C，200转/分培养，10小时后收集菌体，经分离纯化得到重组罗非鱼激活素受体IIB。更优选的，步骤S2中所述IPTG的诱导浓度为lmmol/L。一种如上所述罗非鱼激活素受体IIB重组蛋白在制备鱼苗苗种促生长剂或添加剂中的应用。氨基酸序列分析表明罗非鱼激活素受体IIB成熟肽是罗非鱼激活素受体IIB原切除信号肽后的一个片段，既罗非鱼激活素受体IIB原第22位以后的氨基酸序列，而罗非鱼激活素受体IIB的胞外结构域则相当于23至134位氨基酸。游离形式的罗非鱼激活素受体IIB的胞外结构域能够与膜结合的受体竞争结合Myostatin等配体,进而发挥其促生长活性；本发明的罗非鱼激活素受体IIB全长基因是以激活素受体IIB罗非鱼肌肉总RNA反转录得到的cDNA为模板，经PCR和RACE方法扩增而得到的。总的来说，本发明用于表达罗非鱼ActRIIB胞外区重组蛋白的基因序列是以罗非鱼激活素受体IIB全长基因双链DNA为模板，经PCR方法扩增而得到的，它来源于罗非鱼激活素受体IIB胞外结构域所对应的基因片段。按照上述的罗非鱼ActRIIB重组蛋白的基因序列，它正好是罗非鱼激活素受体IIB全长基因67bp至402bp (相当于23位至134位氨基酸)的胞外区段，其核苷酸序列及其所编码的氨基酸序列如序列表所示。本发明还构建了含有上述罗非鱼ActRIIB胞外区重组蛋白的基因序列的载体；特别是含有该基因的大肠杆菌克隆载体以及表达载体。这些载体的构建方法是按常规方法，将通过PCR方法合成的罗非鱼激活素受体IIB基因经酶切和分离纯化后，接入到已有的相应载体的相应酶切位点(即Kpn I取HindIID之间，即构建成所需的含有罗非鱼激活素受体IIB基因的表达载体。上述含罗非鱼 激活素受体IIB基因的大肠杆菌表达载体优选由本发明合成的罗非鱼激活素受体IIB基因与大肠杆菌表达载体pQE30构建成的重组表达载体，命名为pQE30- ActRIIB0本发明还用上述含有罗非鱼激活素受体IIB基因的相应表达载体分别构建了能高效表达罗非鱼激活素受体IIB基因的大肠杆菌重组株。本发明的上述能表达罗非鱼激活素受体IIB大肠杆菌重组菌株优选由含有罗非鱼激活素受体IIB基因的表达载体pQE30- ActRIIB转化大肠杆菌M15而得到的菌株，命名为 pQE30- ActRIIB-M15。本发明还提供了利用上述大肠杆菌重组株生产罗非鱼激活素受体IIB的方法。即将将菌种接种在含有氨苄青霉素的液体培养基中，培养，并经IPTG诱导，进一步培养，经分离纯化得到重组罗非鱼激活素受体IIB产品。罗非鱼激活素受体IIB具有重大的经济价值，采用常规的基因工程技术，可利用本发明的罗非鱼激活素受体IIB基因和重组株pQE30- ActRIIB-M15，生产重组罗非鱼激活素受体IIB蛋白，并可进一步用作制备鱼苗苗种促生长剂或添加剂。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果
通过本发明提供的罗非鱼激活素受体IIB重组蛋白的制备方法得到罗非鱼激活素受体IIB胞外结构域能够与膜结合的受体竞争结合Myostatin等配体,进而发挥其促生长活性，从而能促进罗非鱼鱼苗的快速生长。
图1.以罗非鱼肌肉总RNA反转录得到的cDNA为模板的激活素受体IIB基因中间片段PCR扩增产物的凝胶电泳分析图；M.分子量标准；1. PCR扩增产物。图2.罗非鱼激活素受体IIB基因5’端片段合成的第二次PCR凝胶电泳分析图；M.分子量标准；1. PCR扩增产物。图3.罗非鱼激活素受体IIB基因3’端片段合成的第二次PCR凝胶电泳分析图；Μ.分子量标准；1. PCR扩增产物。图4.以罗非鱼激活素受体IIB cDNA为模板的PCR扩增产物(罗非鱼激活素受体IIB基因0RF)的凝胶电泳分析图；M.分子量标准；1. PCR扩增产物。图5.重组表达载体pQE30- ActRIIB的构建过程示意图。图6.质粒pQE30_ ActRIIB的酶切分析；M. 分子量标准；Plasmid:pQE30-ActRIIB/ Kpn Ι+HindIII 酶切鉴定。图7.重组罗非鱼激活素受体IIB基因表达产物的SDS-PAGE凝胶电泳；M :蛋白分子量；1为目的蛋白。图8.重组罗非鱼激活素受体IIB基因表达产物的Western blot鉴定图谱；NC :阴性对照，I为目的蛋白。图9.不同处理对罗非鱼体重增长的影响；灰线对照，绿线=ReActRIIB组，红线抗体组；对照组，ReActRIIB组和抗体组中的鱼分别进行腹腔注射PBS，ReActRIIB和抗体，剂量为10mg/kg体重，连续处理4周。在第二周后，ReActRIIB组，抗体组相对于对照组出现显著性差异(P〈0. 05)，第四周出现极显著差异(p〈0. 01);*代表显著性差异，**代表极显
著差异。图10.不同处理对罗非鱼肝体比的影响；对照组，ReActRIIB组和抗体组中的鱼分别进行腹腔注射PBS，ReActRIIB和抗体，剂量为10mg/kg体重，连续处理4周。第四次注射一周后取罗非鱼全肝组织并称重，结果显示各处理组间肝体比没有显著性差异。图11.对照组肌纤维切片染色。
图12. reActRIIB处理组肌纤维切片染色。图13.抗体处理组肌纤维切片染色。图14.统计不同处理对罗非鱼肌肉纤维的影响；对照组，ReActRIIB组和抗体组中的鱼分别进行腹腔注射PBS，ReActRIIB和抗体，剂量为10mg/kg体重，连续处理4周。第四周后，取肌肉组织并经石蜡切片和HE染色观察不同处理罗非鱼肌肉纤维的影响，结果表明ReActRIIB和抗体组与对照组肌纤维直径相比均出现极显著差异(p〈0. 01)，而ReActRIIB和抗体组之间没有显著性差异(p>0. 05)。**代表极显著差异。
具体实施例方式下面结合附图和实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施例1
罗非鱼激活素受体IIB基因中间片段的合成
根据NCBI中已发表的人和各种动物的激活素受体IIB的cDNA序列的同源性比较结果，以与罗非鱼亲缘性最近的几种鱼类的激活素受体IIB cDNA的保守序列为模版，设计合成两对简并引物。其中第一对简并引物的上游引物Fl的序列如SEQ ID N0:9所示。为5’ -GTAWGWVRKKTTBYKRTGHCKRTA-3’，下游引物 Rl 的序列如 SEQ ID NO: 10 所示。为 5’ -GCRACDCRGGAGTGYHTBTWCTWYAACG-3’ ；第二对简并引物的上游引物F2的序列如SEQ ID NO: 11所示。为5，-TTBYKRTGHCKRTACAYCCA-3’，下游引物R2的序列如SEQ ID NO: 12所示。为5’ -AGTGYHTBTWCTWYAACGYAAYTGG-3’。第一轮PCR以罗非鱼激活素受体IIB肌肉总RNA反转录得到的cDNA为模板，PCR反应条件为94°C预变性3分钟。每轮反应中94 V变性15秒，60°C 退火 15s (每个循环降低O. 5°C)，72 °C延伸20秒共进行15个循环；再进行94 °C变性15秒，52°C退火 15s，72 °C延伸20秒，共进行13个循环。第二轮PCR以第一轮PCR的产物为模板，经两轮PCR方法扩增425bp的中间片段序列。第二轮反应条件为94°C预变性3分钟。每轮反应中94 V变性15秒，56 °C退火15秒，72 °C延伸20秒共进行40个循环。PCR反应结束后，PCR扩增产物进行电泳检测，其电泳鉴定图见图1。从图1可见PCR扩增了一段长约425bp的DNA序列。将425bp的扩增产物连接到pCR2.1载体上得到重组质粒。将重组质粒进行序列测定，测序结果与Genebank的序列进行比较，结果表明克隆的PCR产物是罗非鱼激活素受体IIB基因的中间片段。实施例2
罗非鱼激活素受体IIB基因3’端片段的合成
依据已测序的ActRIIB中间片段的序列设计了两条下游引物R3和R4以进行嵌套PCR。引物R3的序列如SEQ ID NO: 13所示；(R3引物的序列为5’ -GGAAAACCCTCAGGTCTTCTTC-3’ ;引物 R4 的序列如 SEQ ID NO: 14 所示。R4 引物的序列为 5，-GTGCTGTCCCTGGCCCTTGTTC-3’)。第一次PCR以在5’端进行加尾的反转录的cDNA为模板，经降落PCR方法扩增3’端的核苷酸序列，反应条件为94 V预变性3分钟，随后进行30个循环的反应。94°C变性15秒，64 °C退火15秒(每个循环降低O. 6 °C), 72 V延伸I分钟。最后72°C延伸7分钟。第二次PCR以第一次的PCR产物的100倍稀释液为模板。第二次反应的条件和第一次反应条件相同。
经第二轮PCR后，得到的产物约为1. 3kb。将其连接到pCR2.1载体上得到重组质粒pCR2. l-ActRIIB-3’。将重组质粒pCR2. l-ActRIIB-3’用pCR2.1载体的一对通用引物进行序列测定，测序结果与Genebank的序列进行比较，结果表明克隆产物是激活素受体IIB罗非鱼激活素受体IIB 3’端基因。PCR扩增产物的电泳鉴定图见图2。实施例4
罗非鱼激活素受体IIB基因5’端片段的合成
依据已测序的ActRIIB 3’端序列设计了两条下游引物R5和R6以进行嵌套PCR。引物R5的序列如SEQ ID NO: 15所示；引物R6的序列如SEQ ID NO: 16所示；(R5引物的序列为5’-CTCCATGTTGGTTCCGTGCTTCTC-3’，R6 引物的序列为 5’ -TTGCCATGACTGCTTATCCTGAACTG-3’)第一次PCR以反转录的cDNA为模板，经降落PCR方法扩增3’端的核苷酸序列，反应条件为94 0C预变性3分钟，随后进行40个循环的反应。94°C变性30秒，68 °C退火30秒(每个循环降低O. 5 °C), 72 V延伸I分钟。最后72°C延伸7分钟。第二次PCR以第一次的PCR产物的100倍稀释液为模板。第二次反应的条件为将第一次反应条件中的退火温度改为52 °C，其它条件与第一次反应条件相同。经第二轮PCR后，得到的产物约为lkb。将其连接到pCR2.1载体上得到重组质粒pCR2. l-ActRIIB-5’。将重组质粒pCR2. l-ActRIIB-5’用pCR2.1载体的一对通用引物进行序列测定，测序结果与Genebank的序列进行比较，结果表明克隆产物是激活素受体IIB罗非鱼激活素受体IIB 5’端基因。
PCR扩增产物的电泳鉴定图见图3。实施例5
激活素受体IIB罗非鱼激活素受体IIB基因全长序列的拼接
将已经测序的ActRIIB中间片段、5’RACE片段和3’RACE片段进行拼接，得到罗非鱼激活素受体IIB基因的ORF为1545bp，推测出其氨基酸序列。ActRIIB基因ORF全长序列如SEQ ID NO:3所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。实施例6
罗非鱼激活素受体IIB基因的合成
根据拼接好的罗非鱼激活素受体IIB基因cDNA全序列，设计合成一对引物F7和R7，其核苷酸序列如SEQ ID N0:7、所示。上游引物F7从起始密码子开始，其核苷酸序列为5’ -TCAGGTGCTGGACTCTTTGGG-3’ ；下游引物R7至终止密码子结束，其核苷酸序列为5’ -AGCGGAACATGTCTTTTTCATGGC-3’。以罗非鱼受体IIB基因cDNA为模板，经PCR方法扩增激活素受体IIB全长ORF序列。PCR反应条件为94°C预变性2分钟，98 V变性10秒，50V退火30秒，68°C延伸2分钟。反应40个循环。然后加入Blend Taq-plus-，72°C延伸5分钟。将扩增的激活素受体IIB基因插入到pCR2.1载体中构建质粒pCR2.1-ActRIIB.PCR扩增产物的电泳鉴定图见图4。实施例7
含罗非鱼激活素受体IIB细胞外结构域基因片段的大肠杆菌表达载体pQEO-ActRIIB的构建
设计一对引物F和R，其核苷酸序列如SEQ ID N0:5飞所示。上游引物F的核苷酸序列为5’ -CGGGTACCGAAGC GGAGACCCGGG-3’(该引物含有KpnI内切酶位点)；下游引物R的核苷酸序列为5’ -CCAAGCTTTCA (ATG) 6TACTCGGGGTGGAGGCTGG-3’(该弓I物含有终止密码子和HindIII内切酶位点)，以载体pCR2.1-ActRIIB为模版进行PCR扩增，PCR反应的条件为940C预变性2分钟，98 V变性10秒，55 V退火15秒，72°C延伸30秒。反应40个循环。PCR反应结束后，进行PCR产物的回收，接着再将PCR回收产物和载体PQE30分别用KpnI和HindIII进行双酶切，酶切之后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收产物。PCR回收产物经Kpn I和HindIII双酶切后分离纯化到约336bp的基因片段，该片段为罗非鱼激活素受体IIB细胞外结构域基因片段；大肠杆菌表达载体PQE30经限制酶Kpn I及HindIII双酶切后分离纯化到3. 4kb的大片段，将分离纯化到的3. 4kb的大片段与336bp的罗非鱼激活素受体IIB基因片段按1:3混合，用Invitrogen T4连接酶14°C连接16小时后热激法转入大肠杆菌DH5a中，筛选具有氨节青霉素抗性的转化子,参照E. Z. N. A Plasmid ExtractionKit说明书的步骤提取质粒，筛选大小重组质粒，用限制酶Kpn I及HindIII双酶切重组质粒，得到336bp和3. 4kb的两个片段，大小分别与罗非鱼激活素受体IIB基因和表达载体PQE30大小相同，证明罗非鱼激活素受体IIB基因已克隆入大肠杆菌表达载体pQE30中，重组质粒命名为pQE30-ActRIIB。质粒构建图和酶切分析图分别见图5及图6。实施例8
高效表达罗非鱼激活素受体IIB细胞外结构域基因片段的大肠杆菌重组株pQE0-ActRIIB-M15 的构建
热激法将pQEO-ActRIIB转化E. coli M15中，在含氨苄青霉素和卡那霉素的LB平板上筛选转化子，参照E. Z. N. A Plasmid Extraction Kit说明书的步骤进行
质粒的提取，质粒经测序和Kpn I及HindIII双酶切鉴定，获得含pQEO-ActRIIB的阳性重组转化子pQEO-ActRIIB-ΜΙ5。实施例9
利用大肠杆菌基因工程菌pQE0-ActRIIB-M15生产重组罗非鱼胚胎期激活素受体IIB挑取大肠杆菌基因工程菌pQE0-ActRIIB-M15单菌落接种在含有100ug/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 0C，200转/分培养过夜，次日按1:50接种量接种于适当体积的相同培养基中，37°C培养至A600为O. 5 O. 6，加入IPTG (终浓度为lmmol/1 )，于37°C诱导培养10小时后收菌。合成罗非鱼激活素受体IIB在大肠杆菌基因工程菌pQE0-ActRIIB-M15中已获得闻效表达。取少量细胞加2X电泳上样缓冲液，煮沸5分钟后按标准方法跑SDS-PAGE凝胶电泳。结果见图7，显示经诱导的pQE0-ActRIIB-M15在约15kD的位置上出现一条新的蛋白带，未诱导的pQEO·-ActRIIB-Ml5该条带很弱，证明罗非鱼激活素受体IIB已在pQEO-ActRIIB-M15 中诱导表达。将重组罗非鱼激活素受体IIB采用免疫印迹(Western blot)方法进行免疫活性鉴定。一抗为抗His标签的单克隆抗体，二抗为羊抗鼠IgG-HRP。结果见图8，显示抗His标签的单克隆抗体能识别我们用大肠杆菌表达的融合ActRIIB蛋白，结合pQEO-ActRIIB重组子的DNA测序结果，证明得到的蛋白是重组罗非鱼激活素受体IIB。实施例10
重组ActRIIB及其多克隆抗体对罗非鱼肌肉生长的生理作用
所有实验用罗非鱼驯养于注入流动性河水的水泥池中，在自然光照周期和自然水温下驯养10天。在驯养和实验处理期间，每天下午4点定时投喂一次。将所有鱼随机分到不同网箱中，对照组，ReActRIIB注射组和抗体注射组分别设有三个重复。腹腔注射处理对照组，ReActRIIB组和抗体组分别注射PBS，ReActRIIB和抗体，每周一次，连续注射4周。齐[J量如下表。
权利要求
1.一种罗非鱼激活素受体IIB细胞外结构域基因片段，其特征在于核苷酸序列如SEQID NO:1 所示。
2.一种罗非鱼激活素受体IIB蛋白细胞外结构域，其特征在于氨基酸序列如SEQ IDNO: 2所示。
3.一种罗非鱼激活素受体IIB基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示。
4.一种罗非鱼激活素受体IIB蛋白，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示。
5.一对用于扩增罗非鱼激活素受体IIB基因片段引物，其特征在于引物序列如SEQ IDNO:5 6所示；或者引物序列如SEQ ID N0:7 8所示。
6.一种载体，其特征在于含有权利要求1或3所述的基因片段。
7.根据权利要求6所述载体，其特征在于，所述载体为大肠杆菌克隆载体pCR2.1-ActRIIB ;或者所述的载体为大肠杆菌表达载体pQE30- ActRIIB。
8.—种重组株，其特征在于是由权利要求6或7所述的表达载体6转入大肠杆菌中所得。
9.一种罗非鱼激活素受体IIB重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤 51.将权利要求6或7所述表达载体转入大肠杆菌中，利用氨苄青霉素抗性基因筛选阳性转化子； 52.将阳性转化子接种在含有氨苄青霉素的液体培养基中，培养过夜，次日接种于相同培养基中，并经IPTG诱导，培养后收集菌体，经分离纯化得到重组罗非鱼激活素受体IIB。
10.一种根据权利要求2、4或9任一所述罗非鱼激活素受体IIB重组蛋白在制备鱼苗苗种促生长剂或添加剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种罗非鱼激活素受体ⅡB细胞外结构域基因片段。所述基因片段是以罗非鱼肌肉总RNA为模板，经RT-PCR和RACE方法而得到的罗非鱼激活素受体IIB基因，将罗非鱼激活素受体IIB基因克隆到载体pCR2.1中得到克隆载体pCR2.1-ActRIIB；以载体pCR2.1-ActRIIB为模板，设计罗非鱼激活素受体ⅡB细胞外结构域基因片段引物F和R，经PCR反应得到细胞外结构域基因片段；本发明还公开了一种含有罗非鱼激活素受体ⅡB细胞外结构域基因片段的表达载体pQE30-ActRIIB，将表达载体pQE30-ActRIIB导入大肠杆菌中进行表达获得罗非鱼激活素受体ⅡB重组蛋白，该蛋白可以应用于鱼苗苗种促生长剂或添加剂的制备。
文档编号C12N9/12GK103045623SQ201210560849
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月21日 优先权日2012年12月21日
发明者李文笙, 邝中雷 申请人:中山大学