生物素连接酶在磁性微球表面的定向共价固定方法
【专利摘要】本发明公开了一种生物素连接酶在磁性微球表面的定向共价固定方法，该方法包括：首先，利用基因工程技术表达出N端带MLAQGS序列及多聚组氨酸序列的生物素连接酶重组蛋白；然后，利用谷氨酰胺转胺酶的催化作用，将所述生物素连接酶重组蛋白中的谷氨酰胺的?NH2与氨基化修饰磁性微球表面的?NH2形成共价连接，从而实现将生物素连接酶以共价结合方式定向固定在磁性微球载体表面。本发明建立的一种BirA酶的固定化新方法，可以充分保持其酶学催化活性，并重复使用，提高酶的使用效率及降低使用成本。
【专利说明】
生物素连接酶在磁性微球表面的定向共价固定方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物化学领域，具体的说是涉及一种定向固定的酶，即利用生物学方 法将生物素连接酶(BirA)以共价结合的方式定向固定在磁性微球载体表面。
【背景技术】
[0002] 生物素连接酶，又称生物素-蛋白连接酶、BirA酶，是由大肠杆菌BirA基因编码的1 个双功能蛋白，该酶可作为一种阻遏蛋白对合成生物素的操纵子产生抑制作用，更为重要 的是它能活化生物素形成生物酰5 '腺苷酸，再将生物素转移到生物素受体蛋白上。通过在 目的蛋白上加入1个能被BirA酶识别的肽序列（可生物素化的序列，如Avi-tag)，BirA酶即 可将生物素结合到目的蛋白上，标记过程为酶促反应，较目前最为常用的化学偶联技术制 备蛋白质-生物素偶联物相比，具有高效、位点特异及操作方便等特点。由于BirA酶的生物 素化能力，作为一种重要的试剂在蛋白质标记技术方面应用广泛，如蛋白质纯化、细胞分 选、免疫分析等。
[0003] BirA酶是大肠杆菌的固有成分，天然表达量很低，价格昂贵。BirA酶应用于催化目 的蛋白生物素化是在液体环境下，游离酶在反应液中和产物在一起，反应后酶不能回收重 复利用，也使得产物的分离纯化更为复杂，因此发展一种固定化的BirA酶，不仅保持其酶学 催化活性，并重复使用，提高酶的使用效率及降低使用成本，具有重要意义。尽管酶的固定 化方法有多种，但目前最常用的固定方法是共价结合法，即酶蛋白的非必需基团通过共价 键和载体形成不可逆的连接。然而酶的高级结构对环境十分敏感，物理因素、化学因素和生 物因素均可使酶丧失活力。基于化学法的共价结合固相化行为由酶蛋白分子的-nh 2、-C00H、-OH或-SH等活性基团与固相载体表面活性基团发生共价键结合，由于上述活性基团 在蛋白质分子内的位置不确定性和不唯一性，导致这种共价结合没有固定的结合模式，当 连接位点位于酶活性位点或附近基团时影响酶的催化活性。
[0004]谷氨酰胺转胺酶(Transglutaminase)又称转谷氨酰胺酶，可以催化蛋白质分子内 的交联、分子间的交联、蛋白质和氨基酸之间的连接以及蛋白质分子内谷氨酞胺基的水解， 利用该反应可以将一些限制性氨基酸引入蛋白质以改善蛋白质结构，从而提高蛋白质的功 能性质及其营养价值。目前微生物来源的谷氨酰胺转胺酶（微生物谷氨酰胺转氨酶， Microbial transglutaminase，简称MTG)已广泛应用于食品等行业。谷氨酰胺转胺酶的机 理是催化酰基转移的酶，以肽链中谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基作为酰基供体。酰基受体可 以是多肽链中赖氨酸残基的氨基、伯胺基或水，当酰基受体为多肽链中赖氨酸残基的ε_ 氨基时，形成蛋白质分子内和分子间的连接；当酰基受体是多肽链中或者其他大分子的伯 胺基时，形成蛋白质-蛋白质或蛋白质-其他大分子的分子间连接，原理如下。
[0005] Ri-G1uCONH2+NH2-R2^Ri-GluCONH-R 2+NH3+
【发明内容】
[0006] 针对上述现有技术，本发明的目的在于提供一种由谷氨酰胺转氨酶(MTG)催化实 现B i r A酶在磁性微球表面的位点特异性的共价结合固定方法。利用本发明的立体定向固定 方法，可实现BirA酶特异性位点的共价偶联，且保持BirA酶的高催化活性。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] 本发明的第一个目的是提供一种生物素连接酶的位点特异性的共价定向固定方 法，包括以下步骤:首先，利用基因工程技术表达出N端带MLAQGS(甲硫氨酸-亮氨酸-丙氨 酸-谷氨酰胺-甘氨酸-丝氨酸）序列及多聚组氨酸序列的生物素连接酶重组蛋白（命名为 Gln-BirA重组蛋白）；然后利用谷氨酰胺转胺酶的催化作用，将Gln-BirA中的谷氨酰胺的-NH2(供体)与氨基化修饰磁性微球表面的-NH 2(受体)形成共价连接，从而实现利用生物学方 法将生物素连接酶(BirA)以共价结合方式定向固定在磁性微球载体表面，可以充分保持其 酶学催化活性，并重复使用，提高酶的使用效率及降低使用成本。
[0009]经过对大量的识别序列进行筛选得到，本发明优选MLAQGS(甲硫氨酸-亮氨酸-丙 氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸-丝氨酸)序列，进一步对其进行研究，得到在N端修饰MLAQGS序列 时，所得到的Gln-BirA重组蛋白的酶活性较高。
[0010] 优选的，所述多聚组氨酸序列为6聚组氨酸序列(6XHis序列）。
[0011] 优选的，所述利用基因工程技术表达出N端带至少含有谷氨酰胺序列的生物素连 接酶重组蛋白的步骤如下：
[0012] 首先，构建N端带MLAQGS(甲硫氨酸-亮氨酸-丙氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸-丝氨酸)序 列及多聚组氨酸序列的BirA酶重组蛋白的重组表达载体，采用大肠杆菌表达目的蛋白，然 后所得目的蛋白利用固定化金属螯合亲和层析法（IMAC)Ni亲和层析纯化，得到纯化后的 Gln-BirA重组蛋白。
[0013]进一步优选的，表达出Gln-BirA重组蛋白的具体步骤为：利用基因工程技术构建 表达质粒载体pMLAQGS-His-BirA，E·coliBL21(DE3)表达Gln-BirA重组蛋白，頂ACNi亲和 层析纯化Gln-BirA重组蛋白。经过大量试验验证和分析，采用E.coli BL21(DE3)可高效表 达Gln-BirA重组蛋白。
[0014]优选的，BirA酶共价、定向连接固定在磁性微球表面的具体方法为:利用微生物谷 氨酰胺转氨酶的催化作用，在Gln-BirA重组蛋白N端MLAQGS序列的谷氨酰胺(Q)的γ-羧酰 胺基(供体)与氨基化修饰磁性微球表面的-ΝΗ2 (受体)形成共价键，从而将BirA酶共价、定 向连接固定在磁性微球表面。
[0015]优选的，所述BirA酶共价、定向连接固定在磁性微球表面的具体操作方法为：
[0016]将氨基化的磁性微球、生物素连接酶重组蛋白（Gln-BirA重组蛋白）和谷氨酰胺转 胺酶(MTG)混合反应，反应之后经磁分离收集反应后的微球，即得到共价连接生物素连接酶 的磁性微球。
[0017]进一步的，上述反应的缓冲体系为roS，pH7.5~8.5;将反应之后得到的微球进一 步采用含有Tween-20的PBS溶液洗涤，得到共价连接生物素连接酶的磁性微球。
[0018] 进一步的，所述反应温度为20~30°C，反应时间为5~7h。
[0019] 更进一步，优化的混合反应体系为：lmL反应体系中，含lmg氨基化磁性微球(直径 0 · 5~1 · Ομπι)，0 · 5mg重组BirA酶，10U MTG，反应缓冲体系为20mM的PBS(pH 8 · 0)，24°C震荡 反应6h。经磁分离收集反应后的微球，用含质量分数为0.01 %TWeen-20的roS溶液洗涤数 次，每次5min。本发明经过大量试验得到上述优化的反应体系，使最终得到的固定化酶的酶 活力较高。
[0020] 本发明中所述的6XHis序列为六个组氨酸HHHHHH，其特点是分子量小，基本不改 变蛋白质的生物结构，不改变蛋白质的溶解性，它使蛋白质的纯化变得极为方便，根据组氨 酸上的咪唑环可以与二价金属离子结合的原理，利用金属离子亲和层析技术纯化带有His 标签的蛋白，即将含有目的蛋白的裂解液通过固定的二价金属离子(通常是二价Ni离子)填 料，带有6*his标签的蛋白质即与填料结合，其它蛋白不与填料结合，最后再用高浓度的咪 唑即可将目的蛋白洗脱下来。6XHis序列为蛋白质重组技术中经常用到的一种标签。
[0021] 本发明中所述的重组表达载体的定义是:能携带插入的外源核酸序列进入细胞中 进行表达的载体。
[0022]本发明中所述的氨基化修饰磁性微球为本领域技术人员常规得到的，比如为氨基 化修饰的四氧化三铁微球。
[0023]本发明的第二个目的是提供一种采用上述方法制备得到的固定化生物素连接酶。 [0024]本发明的第三个目的是提供一种上述的固定化生物素连接酶在作为蛋白质标记 试剂中的应用。主要应用方向为蛋白质纯化、细胞分选、免疫分析等。本发明的有益效果是： [0025] (1)本发明所提供的固定化BirA酶，是利用生物学方法在BirA酶的特定位点实现 共价结合的定向固定，避免了化学共价结合法的随机偶联，有利于保持固定后BirA酶催化 活性。本发明建立的一种BirA酶的固定化新方法，可以充分保持其酶学催化活性，并重复使 用，提高酶的使用效率及降低使用成本。
[0026] (2)载体在酶固定化技术中发挥着关键作用，所以在固定化酶的过程中选择合适 的载体非常重要。本发明通过对多种载体进行筛选，结果得到使用氨基化磁性微球可以实 现BirA酶良好的共价偶联，能够快速与酶反应，不仅酶的固定量较高，并且酶活力良好。 [0027] (3)本发明经过大量的实验得到利用基因工程技术表达出N端带MLAQGS序列及多 聚组氨酸序列的生物素连接酶重组蛋白（命名为Gln-BirA重组蛋白），其形成的固定化酶不 仅酶固定量(蛋白偶联量)较高，而且其酶活性也较高。
【附图说明】
[0028] 图1为N-端带有MLAQGS序列的重组Gln-BirA结构示意图。
[0029] 图2为微生物谷氨酰胺转氨酶催化的氨基化磁性微球表面位点专一性共价连接固 定的重组Gln-BirA示意图。
[0030] 图3为固定化BirA酶循环使用及性对酶活性。
【具体实施方式】
[0031] 实施例1、重组MLAQGS-His-BirA基因原核表达载体的构建
[0032] 根据GenBank中登录的Escherichia coli K-12MG1655(N〇:EG10123)的BirA基因 序列，设计如下引物：
[0033] Primer 1，如SEQ ID No:l所示：
[0034] 5'-GAATTCGATGCTAGCGCAGGGATCACACCATCACCATCACCATATGAAGGATAACA-3';
[0035] Primer 2,如SEQ ID No:2所示：
[0036] 57-CCGGGATCCTTATTTTTCTGCACTACGCAGGG-3 7
[0037] 其中，Primer 1含有EcoR頂每切位点、MLAQGS序列、6 X His序列，Primer 2含有 BamH頂每切位点。
[0038] 以E.coli DH5a基因组为模板，Primer 1及Primer 2为引物PCR方式扩增BirA基 因，所获得的基因片段按照分子生物学方法克隆至PUC18质粒EcoR I/BamH I酶切位点，获 得pMLAQGS-His-BirA表达质粒载体。
[0039] 实施例2、重组BirA-His-MLAQGS基因原核表达载体的构建
[0040] 根据GenBank中登录的Escherichia coli K-12MG1655(N〇:EG10123)的BirA基因 序列，设计如下引物：
[0041] Primer 3,如SEQ ID No:3所示：
[0042] 57-GAATTCGATGAAGGATAACA-37 ；
[0043] Primer 4,如SEQ ID No:4所不：
[0044] y-COGGGATCCCTGGTGCTGGTGCTGGTGTGATCCCTGOGCTAGCATTTATTTTTCTGCACTAOGCAGGG-3,
[0045] 其中，Primer 3含有EcoR頂每切位点，Primer 4含有6 XHis序列、MLAQGS序列及 BamH頂每切位点。
[0046] 以E.coli DH5a基因组为模板，Primer 3及Primer 4为引物PCR方式扩增BirA基 因，所获得的基因片段按照分子生物学方法克隆至PUC18质粒EcoR I/BamH I酶切位点，获 得pBirA-His-MLAQGS表达质粒载体。
[0047] 实施例3、重组MLAQGS-His-BirA及BirA-His-MLAQGS的基因工程技术制备与纯化
[0048] pMLAQGS-His-BirA质粒CaCl2法转化E.coli BL21(DE3)，构建pMLAQGS-His-BirA/ BL21工程菌。
[0049] pBirA-His-MLAQGS质粒CaCl2法转化E.coli BL21(DE3)，构建pBirA-His-MLAQGS/ BL21工程菌。
[0050] 上述两种工程菌过夜活化，按5%接种量转接于新鲜的LB培养基(氨苄青霉素浓度 100yg/mL)，37°C振荡培养12-16h，离心收集菌体。以含20mM咪唑、500mM NaCl的roS溶液 (20mM，pH 8.0)重悬菌体，超声破壁，lOOOOrpm离心分离菌体碎片，上清0.22μηι滤膜过滤后， 0.5mL/min流通HisTrap层析柱，以含20mM咪唑、500mM NaCl的PBS溶液冲洗层析柱至Α28〇值 不再变化。以含250mM咪唑、500mM NaCl的PBS洗脱，收集洗脱液，Millipore超滤离心管 (10kD)5000rpm离心脱盐，并以roS溶液（20mM，pH 8.0)洗涤、浓缩至合适体积，经12 % SDS-PAGE分析，目的蛋白相对分子量为36.7kD，与理论值相符。凝胶灰度扫描结果显示纯化的 MLAQGS-Hi s-BirA重组蛋白及BirA-Hi s-MLAQGS重组蛋白的纯度均为96 %以上。将在N-端含 有MLAQGS序列的MLAQGS-Hi s-BirA蛋白命名为重组Gln-BirA酶，在C-端含有MLAQGS序列的 BirA-His-MLAQGS蛋白命名为重组BirA-Gln酶。
[0051 ] 实施例4、重组Gln-BirA酶及重组BirA-Gln酶在氨基化磁性微球表面的定向固定 [0052]利用微生物谷氨酰胺转氨酶的催化作用，在BirA重组蛋白的MLAQGS标签肽序列的 谷氨酰胺(Q)与氨基化修饰磁性微球表面的-NH2形成共价键，从而将BirA酶共价、定向连接 固定在磁性微球表面。优化的反应体系如下：
[0053] lmL反应体系中，含lmg氨基化磁性微球(直径0.5~1 .Ομπι)，0.5mg重组BirA酶(重 组Gln-BirA酶或重组BirA-Gln酶），10U MTG，反应缓冲体系为20mM的PBS(pH8.0)，24°C震荡 反应6h。经磁分离收集反应后的微球，用含质量分数为0.01 % Tween-20的PBS溶液洗涤3次， 每次5min〇
[0054] 经BCA法蛋白含量测定分析，每mg磁性微球表面可偶联0.06mg重组Gln-BirA酶或 重组BirA-Gln酶，为1.6pmol酶/cm2微球，蛋白偶联量高于文献报道0.66pmol碱性磷酸酶/ cm2微球[K · Mor iyama，K，Sung，M.Goto，N. Kamiya，Immobi lization of alkaline phosphatase on magnetic particles by site-specific and covalent cross-linking catalyzed by microbial transglutaminase,J.Biosci.Bioeng.111(2011):650-653]〇 [0055]将本实施例中的氨基化磁性微球载体替换为氨基化琼脂糖微球、氨基化聚苯乙烯 微球、氨基甲壳素微球，经分离收集反应后的微球，采用BCA法蛋白含量测定分析，其酶的固 定量低于1.6pmol酶/cm 2微球。
[0056] 实施例5、重组Gln-BirA酶或重组BirA-Gln酶的相对酶活力分析
[0057]以含有15个氨基酸的可生物素化标签（Avitag标签）的ZZ-Avitag重组蛋白 (18.3kD)为底物，分析Gln-BirA酶酶催化底物蛋白的生物素化能力;4'-羟基偶氮苯-2-羧 酉爱（HABA)法[Hirsch JD，Haugland RP,Conjugation of antibodies to biotin,Methods Mol .Biol · 295(2005)135-154.]测定标记在ZZ-Avitag蛋白的生物素数目。
[0058] 反应体系：总体积50yL，含10yg重组Gln-BirA酶或重组BirA-Gln酶，38μΜ ZZ- Avitag重组蛋白，及50mM N，N-二羟乙基甘氨酸(pH8.3)，10mM ATP，10mM乙酸镁，50mM D-生 物素。上述反应液于30 °C条件下，催化反应30min。经HABA法测定连接在ZZ-Avi tag蛋白的生 物素数目，测得重组Gln-BirA酶的相对酶活力为4600U/mg酶蛋白，重组BirA-Gln酶的相对 酶活力为3900U/mg酶蛋白。结果表明在BirA酶N-端重组引入MLAQGS-His序列所得重组Gln-BirA酶的酶活力显著高于His-MLAQGS序列所得重组BirA-Gln酶的酶活力。
[0059]酶活力单位定义：在30°C条件下，30min内将含有38μΜ多肽底物反应液中的lpmol 多肽底物生物素化所需酶量定义为1个酶单位(U)。
[0000] 实施例6、定向固定化重组Gln-BirA酶及重组BirA-Gln酶的相对酶活力分析
[0061 ]以ZZ-Avitag重组蛋白为底物，分析定向固定在磁性微球表面的MLAQGS-His-BirA 或BirA-His-MLAQGS重组酶催化底物蛋白的生物素化能力；4 ' -羟基偶氮苯-2-羧酸(HABA) 法测定标记在ZZ-Avitag蛋白的生物素数目。
[0062] 反应体系：总体积50yL，含100yg磁性微球（偶联10yg重组酶），38μΜ ZZ-Avitag重 组蛋白，及50mM N，N-二羟乙基甘氨酸(pH8.3)，10mM ATP，10mM乙酸镁，50mM D-生物素。上 述反应液于30 °C条件下，催化反应30min。经磁分离磁性微球，HABA法测定连接在ZZ-Avi tag 蛋白的生物素数目。
[0063] 结果显示，测得固定化重组Gln-BirA酶的相对酶活力为4630U/mg酶蛋白，相对酶 活力为固定前的94 · 5 % ;固定化重组BirA-Gln酶的相对酶活力为3130U/mg酶蛋白，相对酶 活力为固定前的80.3%。表明固定化后的重组Gln-BirA酶较好的保持了酶的催化活性，可 见，相比于C端带MLAQGS序列及多聚组氨酸序列，N端带MLAQGS序列及多聚组氨酸序列表达 后对生物素连接酶的三维结构影响较小。
[0064]按上述50yL反应体系及条件，同一批偶联重组Gln-BirA酶的磁性微球，循环催化 38μΜ ZZ-Avitag蛋白10次，HABA法测定ZZ-Avitag蛋白的生物素化效果。每次反应完毕，经 磁分离，磁性微球用含0.01 %TWeen-20的PBS溶液洗涤3次，每次5min，供下一次使用。结果 显示多次使用，固定的BirA酶仍保持了较高的酶活性，第10次使用的相对酶活力保持了第 一次使用的酶活力的92 · 6 ±6 · 1 %。
[0065]将本实施例中的固定化重组Gln-BirA酶中的氨基化磁性微球载体替换为氨基化 琼脂糖微球、氨基化聚苯乙烯微球、氨基甲壳素微球，测得固定化重组Gln-BirA酶的相对酶 活力，其相对酶活力与本发明以氨基化磁性微球载体的固定化酶的相比较低，故本发明优 选以氨基化磁性微球为载体。
【主权项】
1. 一种生物素连接酶的位点特异性的共价定向固定方法，其特征是，包括以下步骤:首 先，利用基因工程技术表达出N端带甲硫氨酸-亮氨酸-丙氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸-丝氨酸序 列及多聚组氨酸序列的生物素连接酶重组蛋白；然后，利用谷氨酰胺转胺酶的催化作用，将 所述生物素连接酶重组蛋白中的谷氨酰胺的-NH 2与氨基化修饰磁性微球表面的-NH2形成共 价连接，从而实现将生物素连接酶以共价结合方式定向固定在磁性微球载体表面。2. 如权利要求1所述的方法，其特征是:所述多聚组氨酸序列为6聚组氨酸序列。3. 如权利要求1所述的方法，其特征是:所述利用基因工程技术表达出N端带至少含有 谷氨酰胺序列的生物素连接酶重组蛋白的步骤如下： 首先利用基因工程技术构建N端带甲硫氨酸-亮氨酸-丙氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸-丝氨 酸序列及6XHis序列的生物素连接酶重组蛋白的原核表达载体，然后采用大肠杆菌表达所 述生物素连接酶重组蛋白。4. 如权利要求3所述的方法，其特征是:所述利用基因工程技术表达出N端带至少含有 谷氨酰胺序列的生物素连接酶重组蛋白的具体步骤如下:首先利用基因工程技术构建表达 质粒载体pMLAQGS-His-BirA，然后采用E.coli BL21(DE3)表达所述生物素连接酶重组蛋 白。5. 如权利要求3或4所述的方法，其特征是：将所述大肠杆菌表达所述生物素连接酶重 组蛋白后，再采用固定化金属螯合亲和层析法Ni亲和层析纯化，得到纯化后的Gln-BirA重 组蛋白。6. 如权利要求1所述的方法，其特征是：生物素连接酶共价、定向连接固定在磁性微球 表面的具体方法为:利用微生物谷氨酰胺转氨酶的催化作用，在生物素连接酶重组蛋白N端 甲硫氨酸-亮氨酸-丙氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸-丝氨酸序列的谷氨酰胺的γ -羧酰胺基与氨 基化修饰磁性微球表面的-ΝΗ2形成共价键，从而将BirA酶共价、定向连接固定在磁性微球 表面。7. 如权利要求6所述的方法，其特征是：生物素连接酶共价、定向连接固定在磁性微球 表面的具体操作步骤为:将氨基化的磁性微球、生物素连接酶重组蛋白和谷氨酰胺转胺酶 混合反应，反应之后经磁分离收集反应后的微球，即得到共价连接生物素连接酶的磁性微 球。8. 如权利要求7所述的方法，其特征是:所述反应温度为20~30°C，反应时间为5~7h; 优选的，混合反应体系为：ImL反应体系中，含Img氨基化磁性微球，0.5mg重组BirA酶，IOU MTG，反应缓冲体系为20mM的I 3BSWC震荡反应6h，经磁分离收集反应后的微球，用含质量 分数为〇. 01 % Tween-20的PBS溶液洗涤数次；即可得到共价连接生物素连接酶的磁性微球。9. 权利要求1~8中任一项方法制备得到的固定化生物素连接酶。10. 权利要求9所述的固定化生物素连接酶在作为蛋白质标记试剂中的应用。
【文档编号】C12N11/10GK105950605SQ201610496726
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年6月29日
【发明人】唐金宝, 于常梅, 鲍如梦, 杨洪鸣
【申请人】潍坊医学院