一种耐受有毒产物的细胞固定化方法及其固定化细胞生产1,5-戊二胺工艺的制作方法
【专利摘要】本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种耐受有毒产物的细胞固定化方法及该固定化细胞转化生产1,5?戊二胺的连续化生产工艺。本申请对聚乙烯醇与海藻酸钠配比及相应的成胶方法进行了研发优化，制备的固定化细胞具有可耐受高浓度1,5?戊二胺对菌体细胞的损伤、有较好的膨胀性能、可耐受转化过程中大量二氧化碳气体的释放对结构的影响、机械强度高、使用寿命长等优点；并且分批使用6次以后活力保持在98%以上，连续使用12h后活力保持在70%以上。本发明所提供的连续化生产工艺所需设备少，便于操作，生产规模放大容易，自动化程度高。生产过程不添加任何中和剂；产品澄清，分离纯化容易。
【专利说明】
一种耐受有毒产物的细胞固定化方法及其固定化细胞生产1, 5-戊二胺工艺
技术领域
[0001] 本发明涉及微生物技术领域，特别涉及耐受有毒产物的细胞固定化方法及其固定 化细胞生产1，5-戊二胺工艺。
【背景技术】
[0002] 1，5_戊二胺（简称戊二胺），即尸胺，是生物体内广泛存在的具有生物活性的含氮 碱，为蛋白质腐败时赖氨酸在脱羧酶作用下发生脱羧反应时生成的产物。在农业生产中，1， 5_戊二胺可以作为植物生长调节剂，调节植物衰老过程，刺激植物生长，促进果实发育;此 外，1，5_戊二胺还可以提高植物的耐冷性;在医药上，1，5_戊二胺是临床上用于治疗铁中毒 药物去铁胺B的前体;而1，5-戊二胺目前最有价值的应用是作为尼龙单体与丁二酸、己二 酸、癸二酸等聚合合成PA5.4、PA5.6、PA5.10等生物尼龙。
[0003] 近年来，由于生物尼龙的深入开发及应用，1，5-戊二胺的需求量不断增加。目前1， 5_戊二胺的获取方法主要有提取法、化学法、发酵法及全细胞催化法。提取法来源有限，过 程复杂，无法工业化生产;化学法以腈类为原料，产量高，适合大规模工业生产，但其反应过 程剧烈，污染较大，不符合绿色发展的要求;发酵法原料来源广泛且可再生，成本低，污染也 较小，但其调控过程比较复杂，产量也较低。全细胞催化法是指利用完整的生物细胞作为催 化剂进行化学转化，其本质是利用细胞内的酶进行催化，是介于发酵法和提取酶催化法之 间的一种生物催化技术。相比发酵法，全细胞催化克服了发酵法生产周期长、代谢产物复 杂、底物转化率低、产物分离提取困难及能耗高等缺点。相比纯酶催化反应，全细胞中各酶 系维持原有状态和特定位置，酶稳定性更好，半衰期更长，适应性更强，更易实现能量和辅 酶的原位再生;细胞内完整的多酶体系可以实现酶的级联反应，催化效率高。
[0004] 但由于高浓度的产物1，5-戊二胺对菌体细胞有明显的损伤，造成菌体随转化的进 行而逐渐破碎。一方面，破碎的菌体细胞1，5_戊二胺生产效率显著下降，严重制约了 1，5_戊 二胺的产量；另一方面，菌体细胞无法重复使用，因而需重复培养以获取大量的菌体细胞， 从而造成生产成本的增加。此外，每批次的菌体活力也会有差异，导致每批次产出的1，5_戊 二胺含量差异，从而影响后续分离纯化操作。因而，开发一种可长时间维持菌体活力的方法 具有重要的意义。
[0005] 固定化细胞技术是一种常用的保护细胞的方法，在保持细胞活力具有一定的作 用。此外，固定化的细胞可以反复使用，降低了生产成本。在细胞固定化方法中，包埋法因其 操作简便、易于放大和通用性等原因应用最广。适用于包埋法的载体种类较多，如海藻酸 钠、聚乙烯醇、卡拉胶、琼脂糖等，其中应用最为广泛的是聚乙烯醇和海藻酸钠，由于单独使 用聚乙烯醇制备的凝胶球容易粘连，因而通常将二者按一定比例混合使用。但二者的配比 和相应的成胶方法对固定化细胞的活性和固定化小球的机械强度影响较大，特别是在类似 L-赖氨酸转化生成1，5_戊二胺的脱羧反应过程中，大量的二氧化碳释放对固定化小球的机 械强度影响更为显著，现有方法无法满足工业化生产的需求。
【发明内容】
[0006] 本发明目的在于克服1，5-戊二胺生产过程中由于高浓度产物1，5-戊二胺的细胞 毒性造成的菌体裂解和生产能力下降。
[0007] 本发明首先提供了一种细胞的固定化方法，该方法不仅可以有效的保护细胞以耐 受高浓度的有毒产物，还可以耐受转化过程中释放气体对固定化球体机械强度的影响。
[0008] 本发明采用的技术方案是：
[0009] 本发明提供一种耐受有毒产物的细胞固定化方法，包括如下步骤：
[0010] (1)冷水加入聚乙烯醇后加热至98 °C溶化后，加入海藻酸钠，灭菌锅加热溶化，搅 拌冷却至40-50°C，加入含有细胞保护剂的菌悬液，充分搅拌均匀；
[0011] (2)用注射器或蠕动栗将步骤(1)所述混合液滴加到交联剂溶液中，形成直径0.3- 0.5cm的小球，室温静置6-12h后，-45~-80 °C冷冻8-16h;冷冻结束后，室温缓慢融化，用生 理盐水洗涤2次，冰箱保存，用于转化。
[0012] 优选的，所述的细胞保护剂为甘油，甜菜碱，二甲基亚砜(DMS0)，聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)，甘露醇中的任一种;优选PVP或甜菜碱。
[0013] 优选的，按质量比计，海藻酸钠:聚乙烯醇：菌体细胞(湿重）：细胞保护剂为0.5~ 6.5:2 ~10:1 ~5:1 ~10
[0014] 优选的，所述的菌体为3%(按质量百分比）。
[0015] 优选的，所述的交联剂为(按质量百分比）0.5~6.5%的氯化钙溶液。
[0016] 本发明还提供了一种由上述权利要求1-4任一方法获得的固定化细胞。
[0017] 本发明也提供了一种所述的固定化细胞连续生产1，5_戊二胺的工艺，其特征在 于，包括如下步骤：
[0018] (1)将所述的固定化细胞装入柱式反应器中，填充细胞的径高比为1:5~1:10。
[0019] ⑵以4~10g(L-纏it)/g(麵踵)/h的流速将L_$负氨酸溶液栗入至I」步骤（1)的固定化细 胞柱反应器中。其中，柱反应器可以多组串联或并联组合使用。
[0020] 本发明的有益效果主要体现在：
[0021 ] (1)本发明所提供的固定化方法具有材料成本低，操作简单，重现性好等特点。
[0022] (2)制备的固定化细胞具有如下显著优点：①可耐受高浓度1，5_戊二胺对菌体细 胞的损伤。②有较好的膨胀性能，可耐受转化过程中大量二氧化碳气体的释放对结构的影 响。③机械强度高，可耐受发酵罐在500rpm下连续搅拌12h不破碎，可耐压0.2~0.4MPa。④ 使用寿命长。分批使用6次以后活力保持在98%以上，连续使用12h后活力保持在70%以上。
[0023] (3)本发明所提供的连续化生产工艺所需设备少，便于操作，生产规模放大容易， 自动化程度高。生产过程不添加任何中和剂;产品澄清，分离纯化容易。
[0024] 因此本发明也可以广泛应用于反应过程中因毒性产物而产生破坏菌体活力的生 物转化生产，也可应用于其他反应过程中有气体产生的固定化细胞的制备。
【附图说明】
[0025]图1为聚乙烯醇(PVA)成胶方法对菌体活力的影响。
[0026]图2为菌体量与固定化菌体活力的关系。
[0027] 图3为响应面法(C⑶设计)试验结果验证。
[0028] 图4为细胞保护剂添加试验。
[0029]图5为固定化细胞重复使用试验。
[0030] 图6为固定化细胞柱反应器连续生产1，5_戊二胺。
【具体实施方式】
[0031] 以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用 于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按 照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟 练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于 本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0032] 实施例1
[0033] 使用不同浓度的PVA与2%海藻酸钠的混合物作为固定材料，分别使用硼酸交联法 和冷冻法制备固定化细胞。具体操作方法为:冷水加入聚乙烯醇后加热至98°C溶化后，加入 海藻酸钠，灭菌锅加热溶化，搅拌冷却至40-50°C，加入菌悬液至终浓度为10g?sn)/L，充分 搅拌均匀。用注射器或蠕动栗将上述混合液滴加到交联剂溶液中得到直径〇. 3~0.5cm的小 球。硼酸交联法交联剂使用含3% (质量百分比）氯化钙的饱和硼酸溶液;冷冻法交联剂为 3% (质量百分比）的氯化钙溶液。对于硼酸交联法制得的小球，室温静置8h后，用生理盐水 洗涤2次，冰箱保存，用于转化。对于冷冻法制得的小球，先室温静置8h后，-80°C冷冻8h。冷 冻结束后，室温缓慢融化，用生理盐水洗涤2次，冰箱保存，用于转化。
[0034] 使用上述固定化细胞以L-赖氨酸盐酸盐为底物进行转化试验。转化体系包括:菌 体细胞〇. lg(湿菌重），L-赖氨酸量150g/l。转化条件为37°C，200rpm，转化1小时后检测1，5_ 戊二胺含量。对照组使用相同质量的游离细胞代替固定化细胞，其余条件相同。固定化细胞 的相对活力以固定化细胞的1，5-戊二胺产量比游离细胞的1，5-戊二胺产量计算得到。 [0035]结果如图1所示。分别采用-80°C冷冻法制备的固定化细胞相对活力较硼酸法有显 著的提高，其中，2%海藻酸钠-2%PVA固定的细胞相对活力达到91%。说明硼酸是影响菌体 活力的主要原因。此外，固定化细胞相对活力与PVA含量呈负相关趋势。
[0036] 此外，试验对比了冷冻法成胶和常温成胶（即仅使用3%CaCl2溶液成胶，室温静置 8h)的差异，如图1所示，常温成胶相对活力均保持在60%左右，不同PVA含量间无显著差异， 但较冷冻法下降了 10%-30%。
[0037]将固定化细胞装入7.5L发酵罐在500rpm下搅拌12h后，结果表明，三种固定化方法 所制备的固定化小球均保留完整。
[0038] 实施例2
[0039] 采用实施例1中冷冻法制备固定化细胞，其中海藻酸钠质量分数2.0%，聚乙烯醇 质量分数2.0 %，菌体量与凝胶溶液的质量体积比（g/1 OOmL) 1~5，测定固定化小球的相对 活力，转化条件中除菌体量外，其余条件同实施例1。结果如图2所示，转化液中1，5_戊二胺 的浓度随载菌量的增加而增大，但单位质量菌体1，5_戊二胺产率在载菌量大于3%后没有 显著提升，并且当3%的载菌量时，固定化细胞的单位质量菌体1，5-戊二胺产率4.41 ± 0.09g/g(?廳)/h，与对照(4.89±0.468/^(?廳)/11)相比无显著差异，说明3%的载菌量即可 饱和固定化小球。
[0040] 实施例3
[0041] 采用实施例1中冷冻法制备固定化细胞，通过响应面法分析法中的中心组合设计 (CCD)试验对固定化载体海藻酸钠（SA)、聚乙烯醇(PVA)的质量分数，成型剂氯化钙溶液 (CaC12)的质量分数，|丐化时间和冷冻时间等因素进行优化。各因素水平如表1所示，共32组 试验，转化反应条件同实施例1。试验结果如表2所示。试验结果经建模分析得到回归方程：
[0042] LoglO(响度活力）=+ 1 · 38_1 · 81*SA+2 · 2lE-〇〇3*PVA-〇 · 26*CaCl2+0 · 〇39*钙化时 间-0 · 028* 冷冻时间+0 · 074*SA*PVA+0 · 32*SA*CaCh+0 · 053*SA* 冷冻时间+0 · 27*SA2-0 · 014* PVA2-0 · 036*CaCl22_l · 64E-003*钙化时间2-1 · 94E-003*冷冻时间2-0 · 01*SA2*PVA-0 · 046* SA2*CaCl2_7 · 73E-003*SA2* 冷冻时间
[0043] 模型达极显著水平卬=14.44，？〈0.0001)，模型相关系数1?2 = 0.939^(1」1?2 = 0.874,说明模型可用于真实值的模拟。根据模型预测最佳的固定化条件为：海藻酸钠 3.62%，聚乙烯醇4.71 %，氯化钙溶液4.21 %，钙化11.84小时，-80冷冻15.96小时。依据模 拟预测条件进行细胞固定化后进行转化试验，转化反应条件同实施例1。结果如图3所示，细 胞经固定化后相对活力保持在97%以上。
[0049] 实施例4
[0050] 采用实施例1中冷冻法制备固定化细胞，其中海藻酸钠质量分数2.0%，聚乙烯醇 质量分数2.0 %，菌体量3 % (湿菌重）。分别添加终浓度为10 %甘油，10 %甜菜碱，7 %DMS0， 5%PVP，1 %甘露醇等细胞保护剂。不添加保护剂组为对照组。转化体系包括:菌体细胞0. lg (湿菌重），L-赖氨酸量50g/l。转化条件为37°C，200rpm，转化2小时，其间补加5M盐酸维持pH 稳定。转化过程中定期检测转化液中L-赖氨酸含量，当赖氨酸消耗至10g/l时，补加底物至 50g/l 〇
[0051] 结果如图4(a)所示，添加了细胞保护剂的固定化细胞在连续转化2h后菌体活力均 保持在90%以上，其中甜菜碱（10%)和PVP(5%)的效果最显著;此外，如图4(b)所示，1,5-戊二胺的浓度随转化的进行显著提升，其中使用添加甜菜碱和PVP的固定化细胞均转化得 至ljl，5-戊二胺101±2g/L，显著高于对照组77±2g/L。
[0052] 实施例5
[0053]采用实施例1中冷冻法制备固定化细胞，其中海藻酸钠质量分数4%，聚乙烯醇质 量分数5%，5%PVP，菌体量3% (湿菌重）。转化体系包括:菌体细胞0. lg(湿菌重），L-赖氨酸 量50g/l。转化条件为37°C，200rpm，其间补加5M盐酸维持pH稳定。转化过程中定期检测转化 液中L-赖氨酸含量，当赖氨酸消耗至10g/l时，补加底物至50g/l。转化2小时后分离固定化 细胞，添加新鲜50g/l L-赖氨酸溶液进行转化，重复使用固定化细胞转化6次。试验结果如 图5所示，固定化细胞在分批转化6次后，单位菌体1，5_戊二胺产率在批次间没有显著的差 异(？ = 0.471，€( = 0.05)，相对活力保持在98%以上。
[0054] 实施例6
[0055] 采用实施例1中冷冻法制备固定化细胞，其中海藻酸钠质量分数4%，聚乙烯醇质 量分数5 %，5 %PVP，菌体量3 % (湿菌重）。将上述固定化细胞装入柱式反应器中，填充细胞 的径高比为1:6。以4g(L-赖氨酸)/g(细胞湿重)/h的流速将300g/L L-赖氨酸溶液栗入到固 定化细胞柱反应器中，当溶液填满柱反应器后，将流速逐渐增至l〇g(L-赖氨酸)/g(细胞湿 重)/h。每隔lh取样检测1，5_戊二胺含量。结果如图6所示，菌体比转化速率在前四个小时内 逐渐上升，这是由于固定化小球随转化的进行逐步膨胀，从而传质效率逐步提高，转化4h后 达到最大值，此时单位菌体的转化速率达到6.19±0.01g 1,5-戊二胺/g(?廳|)/h，而后菌体 活力有下降的趋势，但12h后仍保持最高活力的70%以上，转化液中1，5_戊二胺的含量可维 持在100g/L以上。试验结果表明，利用本发明提供的方法制备的固定化细胞具有长时间连 续转化生产1，5-戊二胺的能力，且由于该工艺易于放大，通过增加固定化细胞量和原料液 L-赖氨酸的浓度即可获得更高浓度的1，5-戊二胺转化液以及更高的L-赖氨酸的转化率。
[0056]本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明各 个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的 内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所 述改进也落入所附权利要求书的范围之内。
【主权项】
1. 一种耐受有毒产物的细胞固定化方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 冷水加入聚乙烯醇后加热至98°C溶化后，加入海藻酸钠，灭菌锅加热溶化，搅拌冷 却至40-50°C，加入含有细胞保护剂的菌悬液，充分搅拌均匀； (2) 用注射器或蠕动栗将步骤（1)所述混合液滴加到交联剂溶液中，形成直径0.3-0.5 cm的小球，室温静置6-12 h后，-45~-80°C冷冻8-16 h;冷冻结束后，室温缓慢融化，用生 理盐水洗涤2次，冰箱保存，用于转化。2. 根据权利要求1所述的细胞固定化方法，其特征在于，所述的细胞保护剂为甘油，甜 菜碱，二甲基亚砜(DMSO)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，甘露醇中的任一种;优选PVP或甜菜碱。3. 根据权利要求1所述的细胞固定化方法，其特征在于，海藻酸钠:聚乙烯醇:菌体细胞 (湿重）:细胞保护剂为0.5~6.5:2~10:1~5:1~10。4. 根据权利要求1所述的细胞固定化方法，其特征在于，所述的菌体为3%(按质量百分 比）。5. 根据权利要求1所述的细胞固定化方法，其特征在于，所述的交联剂为（按质量百分 比）0.5~6.5%的氯化钙溶液。6. 上述权利要求1-5任一方法获得的固定化细胞。7. -种权利要求6所述的固定化细胞连续生产1，5-戊二胺的工艺，其特征在于，包括如 下步骤： (1) 将所述的固定化细胞装入柱式反应器中，填充细胞的径高比为1:5~1:10。 (2) 以4~10 ga-編酸)/g(細?鍾)/h的流速将L-赖氨酸溶液栗入到步骤（1)的固定化细胞柱 反应器中。
【文档编号】C12N11/10GK105950601SQ201610368936
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月27日
【发明人】陈可泉, 马伟超, 沈金山, 曹逊, 何育美, 欧阳平凯
【申请人】南京工业大学