专利名称：用于混合细胞溶胞产物的容器的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于混合细胞溶胞产物的容器。本发明也涉及使用所述容器来混合细胞溶胞产物以获得高纯度产品如获得用于多种用途的核酸或蛋白的方法。
细菌细胞的碱裂解法是一种用于从宿主细胞回收质粒DNA的成熟的试验室技术(Birnboim等的Methods Enzymol.100，243-255，1983)。本方法包括将去污剂(通常为十二烷基磺酸钠(SDS)和氢氧化钠)加入到细胞悬浮液，随后，短时间温育后，加入强中和溶液(通常为乙酸钾或冰乙酸)。这样得到含大的聚集体(也称为絮凝物)的溶液，该絮凝物包含变性的染色体DNA、蛋白、细胞壁和/或细胞膜物质。该絮凝物通过粗过滤或离心从溶液中排除，剩下含质粒DNA的溶液，该质粒DNA可以通过多种标准方法进一步提纯。
上述方法首先基于细胞壁和细胞膜的化学断裂，随后细胞成分在碱性溶液中增溶和变性。质粒DNA在中和时复性的能力和染色体DNA在此情况下无复性能力使质粒DNA得以分离。
碱裂解法和在裂解法的不同阶段产生的溶液的性能从前只是学术界对之感兴趣。然而，随着人类基因疗法的出现，现在需要利用从宿主如E.coli得到的质粒DNA来生产大量高纯度的质粒DNA。这种大规模生产的需要增加了对新技术的需求，以使得操作的规模和强度可以增加到所需的水平和标准。
染色体DNA发现于原核生物和真核生物中，且已知具有粘弹特性，该粘弹性以前用来确定DNA分子的大小(Chase等的Biophys.J.28，93-105，1979)。该粘弹性在利用碱裂解法从细菌分离质粒DNA时也曾被认识(Nienow，AIChE Annual Meeting，November 1998，FloridaUSA)。该方法的一个特征在于溶液在该方法的不同阶段的流变学特性的改变。对这些流变学特性的研究显示，最初的细胞悬浮液表现出牛顿流体特性。牛顿流体特性可以总结为三个标准(1)恒定的粘度，并且当液体在层流条件下流动时(2)剪切应力与剪切速度直接成正比，和(3)仅产生的应力是剪切应力(Barnes等Introduction to Rheology，1989和Ciccolini等Biotechnology and Bioengineering，60，768-770，1998)。人们发现细胞悬浮液具有非常接近恒定的粘度，具有非常类似于水的粘度值，即小于3mPa(Ciccolini等的Biotechnology and Bioengineering，60，768-770，1998)。溶液性能在加入碱性去污剂溶液时急剧变化，得到一种具有与剪切相关的、相对低的表观粘度的溶液。其中，当含有大约120克/升的湿细胞的溶液溶解时，在剪切速度为350s-1时具有最高表观粘度约为22mPas。尽管溶液的表观粘度较低，溶液具有高粘弹性并表现出大的韦森堡效应。韦森堡效应也称为“爬杆效应”并定义为一个轴或棒在粘弹性流体内旋转时产生的效应(Bames等的Introduction of Rheology，1989)。牛顿流体由于惯性而被压迫指向容器外侧，然而，弹性流体作为正应力的结果(粘弹性流体的一个特征)沿轴攀升，其行为如同围绕轴的一个环。溶胞产物溶液的粘弹性已使用在振荡模式下工作的电流计进行了表征。发现溶液的相角为58°，其中0°表示固体，90°表示非弹性流体。这显示出溶液的弹性。相对低的表观粘度且伴随粘弹性是非常不寻常的，因为大多粘弹性流体也表现为高表观粘度。在中和时，溶液的粘弹性下降，从而又变为低粘度，即接近于水的粘度，并无粘弹度的迹象。
溶胞和中和步骤虽然是质粒DNA的回收和提纯的关键步骤，但这些步骤具有生成额外的杂质如染色体DNA的小片段和不可逆变性的质粒DNA的潜在可能。
这些问题至少部分地同pH值和时间相关，特别是与在碱性去污剂溶液中温育质粒DNA的时间相关。过长时间地暴露在高浓度碱液中会导致变性的质粒DNA形成(Birnboim & doly，Nuc.Acid.Res.，7，1513，1979，以及国际专利申请WO97/29190)。变性质粒DNA不容易从复性的质粒DNA中提纯，所以它的存在导致功能性质粒产量的显著损失。因此充分有效的混合对于保证避免pH的局部过强或过弱和尽可能少地暴露于这些条件下是非常重要。
如果在所述方法的任何阶段混合太剧烈，染色体DNA链就会被物理断裂。染色体DNA会被分成这样大小的片段在中和时复性并进入回收和纯化步骤。这种片段化的染色体DNA将污染溶液并产生严重的纯化问题，因为它具有与质粒DNA类似的性能，不易通过色谱法等技术分离到负责临床产品的管理局所要求的水平。而且，如果在中和时混合剧烈，由于机械应力形成的絮凝物太小，不易通过离心或过滤排除。
当然，任何混合方法都必须能达到快速混合而不对质粒DNA产生负面的化学或机械损害，另外将机械损害限制于染色体DNA，并且理想情况下不对絮凝物质造成机械损害。从细胞培养物中分离蛋白出现类似的问题。
在该方法中发生了显著的体积变化。加入到细胞悬浮液中的碱性去污剂通常为初始悬浮液的等同或双倍量，中和溶液通常与初始悬浮液的体积相同。结果，初始悬浮液仅为混合后最终体积的25％。
任何混合都必须考虑这些体积变化，从而使有效的混合可以在较宽的体积范围内进行。除此之外，特别是在使用一个以上的涡轮的系统中，优选采取步骤，使用与空气/液体截面相交的涡轮来尽量减少留在溶液中的空气。这种空气存留有可能引起染色体DNA的机械损害和片段化。
在试验室规模，碱裂解法通过“轻柔混合”如将试管或烧瓶倒置来实现。这种技术显然受限于规模和操作者的影响。然而，一些公司使用达5升的体积进行该操作(Schleef M.的口头演讲Bio-Europe 1997，Cambridge，England，1997)。
如果要使质粒DNA或细胞衍生的其它目的产品以适于临床试验的纯净形式生成，那么在溶胞步骤中进行混合的可成规模的方法需要克服上述的具体问题。
使用静态混合器的方法在诸如国际申请WO97/23601中有所描述，但没有解决质粒质量、产率和纯度问题。
在溶胞方法中，在容器中混合溶液的方法的一般性描述由Marquet等给出(Bio Pharm，September，26-37，1995)，但没有提供解决上述问题的系统的描述或数据。
这里所用的术语“混合”和“搅拌”是指本发明的容器的内容物的混合。
本发明提供了一种用于混合细胞悬浮液和/或含有染色体DNA和所希望的产物的细胞溶胞产物的容器，其中容器包含(a)一个或多个低功率数的涡轮，其布置使得涡轮向容器的全部内容物提供均匀的分散能；(b)一根或多根供料管，使液体加入到围绕一个或多个涡轮的末端形成的彻底混合区域；和(c)一个或多个围绕容器内表面大体上等间隔放置的导流板，其中一个或多个导流板沿与每个涡轮的旋转轴大体平行的方向延伸。
向容器的全部内容物提供均匀的分散能实现了容器内容物的均匀混合。
所希望的产物可以是蛋白。本领域的技术人员已知蛋白可以由细胞培养物分离，适当的化学提取方法描述于Falconer等人的(Biotechnology and Bioengineering，53，453-458，1997)；Falconer等人的(Biotechnology and Bioengineering，57，381-386，1998)和Falconer等人的(Biotechnology and Bioengineering，62，455-460，1998)文章中。所希望的蛋白包括抗体、细胞因子激素、生长因子、神经递质、酶、凝结因子、载脂蛋白、受体、药物、致癌基因、肿瘤抗原、肿瘤抑制蛋白、结构蛋白、病毒抗原、寄生虫抗原和细菌抗原。这些蛋白的具体例子包括胰岛素原、生长激素、肌营养不良蛋白、雄激素受体、胰岛素样生长因子I、胰岛素样生长因子II、胰岛素样生长因子结合蛋白、表皮生长因子TGF-d、TGF-β、PDGF、血管生成因子(酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和angiogenin)、基质蛋白(IV型胶原、VII型胶原、层粘连蛋白)、苯丙氨酸羟化酶、酪氨酸羟化酶、致癌基因(ras、fos、myc、erb、src、sis、jun)、E6或E7转化序列、p53蛋白、Rb基因产物、细胞因子(如I1-1、IL-6、IL-8)或其受体、病毒衣壳蛋白和来自可用于引发免疫反应的病毒、细菌和寄生生物的蛋白，以及其它在体内作用显著的蛋白。
然而，优选所希望的产物为质粒DNA。
这里使用的“容器”是指任何能够容纳细胞悬浮液的容器。容器可以是适于混合的任何形状，优选圆筒形。该容器优选具有浅的圆形或碟形的底和凹形内壁。或者，容器优选具有平底。该容器优选气密性密封，且气密性密封的容器是本领域的技术人员公知的。
本发明的容器有至少一个可旋转的轴来旋转涡轮，并可以有多于一个可旋转的轴。在发酵和其它混合容器中使用两个或更多的轴是公知的，并且可以应用于本发明要求保护的容器。然而，优选容器有一个轴。
这里使用的术语“细胞悬浮液”是指包含细胞的介质。这里使用的术语“溶胞产物”是指细胞已被溶解在其中的介质。
细胞可以是任何能够在介质中生长或维持的细胞，包括原核细胞和真核细胞。该细胞优选为细菌细胞如E.coli，哺乳细胞如海拉(HeLa)细胞、CHO细胞和骨髓瘤细胞系，和昆虫细胞。最优选地，该细胞为原核细胞或低级真核细胞如酵母。该细胞可以存在于微载体珠上。适合的用于培养细胞的微载体珠是本领域的技术人员公知的。
这里使用的术语“染色体DNA”表示形成细胞染色体某部分或其片段的DNA。
这里使用的术语“质粒DNA”表示形成包含于细胞内的质粒的一部分的DNA，包括任何形式的质粒DNA，该质粒DNA包括载体如游离载体(即BPV)、聚合载体和病毒载体如腺病毒载体，以及逆转录病毒载体、粘粒、YACs、BACs和PACs。
这里使用的术语“涡轮”是指一种元件，其在液体中旋转时引起液体的混合。涡轮优选具有一个或多个用来混合液体的叶片。现有许多具有不同类型的叶片的不同类型的涡轮。适用于本发明的涡轮描述于)Ekato《混合技术手册—涡轮系统》(Ekato handbook of mixingtechnolog-Impeller Systems)(由Ruhr和Mischtechnik GmbH出版)。涡轮优选为轴向涡轮。轴向涡轮被定义为在流动中给予一个轴向分量的涡轮。轴向分量确保涡轮在流体中轴向吸入和喷射流体来抽吸流体，从而使流体的流动沿大体与涡轮的旋转轴平行的容器侧壁移动。涡轮可以是Ekato《混合技术手册—涡轮系统》(同上)中描述的螺旋带状涡轮。螺旋带状涡轮包含与具有一个或多个杆的容器的旋转轴相连的带状螺旋或叶片。该螺旋带状涡轮通过位移导致轴向流动，并且还产生切向流动。
本发明使用的涡轮是低功率数涡轮。术语“低功率数涡轮”是指具有低功率数(Po)的涡轮，该低功率数是根据下面的公式计算的涡轮/容器结构的性能Po=2πNMρN3D5]]>其中2πNM等于功率(W)Po是功率数并且无穷小N是涡轮速度(rps)M是转矩(Nm)ρ是即将混合的液体的密度(kgm-3)D是涡轮的长度(m)低功率数在这里定义为，在牛顿流体，特别是水中测量时小于2，更优选小于1，最优选小于0.5。
优选地，涡轮为在德国的Ekato制造的INTERMIG涡轮。INTERMIG涡轮是一种干涉多级逆流涡轮。INTERMIG涡轮具有在每个末端的向外的双叶片，双叶片在周向布置在交错位置。通过交错布置外叶片来增强INTERMIG涡轮的轴向效应。在图3示出一个INTERMIG涡轮。作为一种选择，优选涡轮为一种螺旋带状涡轮，这种涡轮在Ekato《混合技术手册—涡轮系统》(同上)中有定义。螺旋带状涡轮可以是连续的螺旋涡轮或者可以将其改造使得在添加液体后没有涡轮从中间截断空气/液体界面。其实现通过将螺旋带状涡轮分成多个部分并在涡轮的每个部分之间利用间隙分开轴上的各部分而进行，从而形成一个拆分螺旋涡轮。螺旋带状涡轮的每个部分可以看作一个独立的涡轮。一个适当改造的分级式螺旋带状涡轮表示在图4。本发明也提供包括螺旋涡轮的两个或多个部分的分级式螺旋带状涡轮，该螺旋涡轮位于轴上时在部分之间具有间隙，该间隙处不包含涡轮的叶片或叶片的一部分。
优选涡轮长度相对容器内径之比大于0.5，更优选大于0.6。
在容器中一个或多个涡轮的位置对实现有效混合也是重要的。优选将涡轮布置成使得在添加液体之后没有涡轮从中间截断空气/液体界面，从而确保降低空气/液体界面的湍流，同时也降低了向细胞悬浮液中导入空气气泡的风险。
依赖于使用的容器的大小，涡轮的数目不同。例如，对于具有1到5升容积的容器，优选使用至少两个涡轮，更优选使用至少三个涡轮。对于具有5到60升容积的容器，优选使用至少3到5个涡轮。对于具有60到1000升容积的容器，优选使用至少4到6个涡轮。可是，如果使用连续螺旋带状涡轮，由于螺旋带状涡轮使得整个容器内得到混合，那么整个容器仅仅使用一个连续螺旋带状涡轮是可能的。然而，连续螺旋带状涡轮可以任选地与一个或多个非螺旋带状轴向涡轮如Ekato《混合技术手册—涡轮系统》(同上)中定义的INTERMIG涡轮或螺旋桨涡轮结合使用。在本发明的容器中使用涡轮来实现彻底混合容器内容物并避免在容器内任何位置区室化。区室化是这样—种情形，其中一部分容器内容物没有和其余的容器内容物混合，即在没有和其余容器内容物混合的容器的内容物中形成分隔。许多容器的圆形底或碟形底是可出现区室化的区域。涡轮优选布置在靠近这种容器的底部以避免发生区室化。更优选，尤其在没有使用连续螺旋涡轮时，在每个加料区使用单独的涡轮。术语“加料区”是指当向容器中加入三种溶液即细胞悬浮液、溶胞缓冲液和中和缓冲液中的一种时，容器装满的区域。可以测试容器的涡轮装置来确定涡轮是否截流空气到液体中以及区室化是否在设定输入功率范围内发生。可以在透明流体中使用标准目测技术如观察示踪颗粒的移动，在不透明流体中使用脱色和X-射线摄影技术，来测试容器(参见Elson等的Chem.Eng.Sci.，41，2555-2562，1986；Cronin等的Food Bioprod.Proc.Trans.I.Chem.E.，PartC，72，35-40；Smith等的Chem.Eng.Sci.，39，1093，1975；和Kuboi等的Chem.Eng.Comm.，22，29，1983)。
术语“彻底混合区”是指每个涡轮周围的区域，在那里引起液体混合。该彻底混合区可由标准流动目测技术确定，包括在透明流体中观察示踪颗粒的移动，在不透明流体中使用脱色和X-射线摄影技术(参见Elson等的Chem.Eng.Sci.，41，2555-2562，1986；Cronin等的FoodBioprod.Proc.Trans.I.Chem.E.，Part C，72，35-40；Smith等的Chem.Eng.Sci.，39，1093，1975；和Kuboi等的Chem.Eng.Comm.，22，29，1983)。该彻底混合区优选为每个涡轮周围的区域，在那里产生最大的流量。该彻底混合区优选靠近涡轮的末端。
这里使用的术语“供料管”是指能够将流体输送到彻底混合区的元件。容器可以包含一根或多根将流体加入到彻底混合区的供料管。通常发现彻底混合区靠近一个或多个涡轮的末端。供料管可以是一根或一系列管，其位于容器内壁并且使得流体在容器中以与涡轮大致相同的水平输送。流体经过管被输送到容器中与涡轮大致相同的高度，从而认为流体被输送到靠近一个或多个涡轮的末端，进入彻底混合区。优选地，流体经过靠近一个或多个涡轮的末端的管输送。更优选地，对应每个涡轮有至少一个供料管和/或对应每个加料区有至少一个供料管。在较小的容器即小于10升的容器中，在一个或多个涡轮的高度有一个加料点就足够了。但是，在较大的容器即大于10升的容器中，优选在涡轮高度围绕容器内壁的多个点将流体引入容器。实现这一目的的一个办法是，流体经环状喷射管道引入，这样使得流体经大量的孔同时进入，这些孔位于靠近由涡轮旋转时涡轮的末端形成的弧。另一个办法是利用在每个涡轮的高度处的多孔来实现。形成供料管的管在容器内可移动，这样使得加入流体的高度可以在混合过程中调整。
更优选，形成的供料管可以将被加入的流体直接导向涡轮。
在另外的实施方案中，供料管是承载涡轮的轴内的导管，其经过一个或多个涡轮将液体输送到靠近一个或多个涡轮的末端。
优选地，供料管将流体全部输送到混合最剧烈的区域，该区域通常围绕一个或多个涡轮的末端形成。
优选地，供料管使得每种溶液在少于2分钟的时间内加入到容器中。
这里使用的术语“纵横比”是指容器内液体的高度和容器中液体的宽度的比率。如果容器没有均匀的高度和宽度，可以使用最大的宽度和最大的高度来计算纵横比。在本发明的具体实施方案中，容器具有0.5到2.5的纵横比。容器通过具有低的纵横比来进一步提高混合效率。在特别优选的实施方案中，容器的纵横比为1.0。
这里使用的术语“导流板”是指在容器中转换液体流向的元件。导流板有助于防止容器内的液体旋转、促进从上到下的次级流和防止中心涡流以及随后的空气截流的形成。随着额外的流体的依次加入，并且每种必须与整个容器的内容物有效地均匀化，从上到下的次级流的产生对在整个容器内充分混合很重要。最常用的导流板类型是具有约为容器内径的10％的宽度的板条，沿容器的长度以与一个或多个涡轮的旋转轴大致平行的方向延伸。导流板的边缘可以与容器的内壁齐平，或距离内壁有约0.1到5cm的间隙。然而，也可采用其它类型的导流板，如由Nagata《混合原理和应用》(Mixing Principles andApplications)John Wiley，New York，USA，1975描述的那些。所述容器具有一个或多个围绕容器的内表面大致等间隔的导流板，其中一个或多个导流板沿与涡轮的旋转轴大致平行的方向延伸。优选在容器中使用至少两个导流板，更优选使用至少四个导流板。优选地，导流板沿容器的整个长度延伸。导流板的宽度优选为容器内径的3到15％，更优选6到12％，更优选10％。每个导流板的边缘可以与容器的内壁齐平，或离开内壁布置。导流板的位置优选使得导流板和由涡轮旋转时涡轮末端形成的弧之间有小间隙。该小间隙在0.1到10cm之间，更优选在1到5cm之间。在特别优选的实施方案中，当容器具有约0.45米的内径和60升的体积时，优选有4个导流板，每个具有容器内径10％的宽度。
在混合容器中使用的导流板描述于Ekato《混合技术手册—涡轮系统》(同上)和Nagata《混合原理和应用》Wiley，New York，1975中。
这里使用的术语“基本片段化”是指染色体DNA被片段化到在纯化产品中片段化DNA的量超过所希望的产物的重量的4％。特别地，当所希望的产物为质粒DNA时，这里使用的术语“基本片段化”是指染色体DNA被片段化到在纯化产品中片段化DNA的量超过DNA的总含量的4％，这里，质粒DNA是根据国际申请WO97/29190的方法纯化的。当所希望的产物是蛋白时，根据Falconer等的(Biotechnologyand Bioengineering，53，453-458，1997)的方法纯化蛋白之后测量染色体DNA杂质的浓度。优选地，当所希望的产物是蛋白时，染色体DNA杂质的浓度小于纯化蛋白的重量的0.5％。
容器优选具有5到1000升的体积，更优选50到500升，最优选50到100升。适合的溶胞容器由英国Bolton的Yateson Engineering Ltd.制造。
本发明还提供一种在细胞悬浮液中溶解细胞时使用本发明的容器的方法，该细胞悬浮液包含染色体DNA和所希望的产物，其中一个或多个涡轮以这样的速度旋转，该速度的选择可获得有效的混合而不产生足以导致染色体DNA基本片段化或聚集物絮凝的机械应力。优选地，该所希望的产物为质粒DNA。
本发明的方法优选包括将细胞悬浮液加入到容器中，混合细胞悬浮液，将溶胞溶液加入到细胞悬浮液，混合细胞悬浮液直到细胞溶解完成，加入中和溶液，混合直到中和完成以及生成聚集物的絮凝物。在中和时，质粒DNA复性。然后，可以使用本领域的技术人员公知的标准方法如过滤袋和色谱法来进一步纯化质粒DNA。
在本发明的方法中，加入到容器的溶液优选使用供料管加入，该供料管浸没在包含于容器内的液体中。优选地，每种溶液在容器中的混合时间少于4分钟，优选少于2分钟。
细胞悬浮液可以是任何介质中的任何细胞悬浮液。优选细胞悬浮液具有70到300g湿重/升的细胞浓度。
细胞悬浮液优选被混合到生成和维持均匀溶液。优选在细胞悬浮液混合的同时加入溶胞溶液。溶胞溶液优选为氢氧化钠和SDS的混合物。优选地，根据在国际申请WO97/29290中描述的方法加入溶胞溶液。高pH和去污剂的结合导致细胞的溶胞和染色体DNA以及其它细胞成分的变性。优选地，溶胞溶液和细胞悬浮液混合，从而在尽可能短的时间内生成溶胞产物，尽量减少在溶胞缓冲液的高pH浓度下的暴露时间，从而减少不可逆变性质粒DNA的形成，但混合速度不足以高到引起对染色体DNA造成机械损害。
一旦溶胞完成，所得溶胞产物的粘弹特性剧烈升高，这可以用来测量溶胞的完成程度。粘弹特性的升高可以通过观察流体沿涡轮的轴攀升的韦森堡效应直接看到。也可以通过监测溶胞容器的搅拌器马达的转矩来间接的、但更客观的测量。转矩是指由涡轮轴的马达产生的旋转力矩。
在混合表现为低粘度牛顿流体的未溶胞的细胞悬浮液的同时，可观察到稳定的低水平转矩。在溶胞时，转矩迅速升高，直到溶胞完成，这时转矩稳定在最大值。
因此，本发明一方面提供了一种监测容器中细胞悬浮液的溶胞程度的方法，其中容器通过旋转一个或多个涡轮来混合其内容物，该方法包括测量应用于涡轮轴上的转矩，其中转矩对应于细胞溶胞的程度成正比升高直到溶胞完成，这时转矩稳定在最大值。一旦溶胞完成，所得溶胞产物的粘弹特性剧烈升高，这可以用来测量溶胞的完成程度。在溶胞时，转矩通常在稳定在恒定值之前升高5到15倍(即500-1500％)。优选地，大于初始转矩300％的升高预示溶胞，更优选大于500％，更优选大于1000％。
当溶胞完成时，或一小段预定时间(优选1到60分钟，更优选2到20分钟，最优选5到10分钟)的温育后，通过适当的输送供料管，开始加入中和缓冲液。中和缓冲液可以是任何强有机酸缓冲液，如冰乙酸。优选地，中和缓冲液是3M乙酸钾，10mM EDTA pH5.5。优选地，中和缓冲液在溶胞产物被混合时加入。有效的混合和中和可以直接看到，这时，由于溶胞产物的粘弹特性丧失，韦森堡效应消失。
此外，该效应可以通过监测搅拌器上转矩的变化来测定，在中和时，由于溶胞产物的流变学特性变回低粘度牛顿流体的流变学特性，转矩迅速下降。在本发明有关这方面的方法中，细胞溶胞产物的完全中和通常由转矩的下降指示，优选降至小于在反应的溶胞阶段中轴上最大转矩的50％，更优选降至小于所得最大值的30％，最优选降至小于最大值的25％，来指示中和。
完全中和非常重要，因为如果不能将流体变回小于3mPas的粘度和可忽略的粘弹特性，将导致在后续的纯化步骤中过滤特征差和总产量降低。
相应地，本发明的另一方面提供了一种在容器中从细胞悬浮液制备所希望的产物的方法，该方法包含下列步骤通过碱裂解法来溶解所述细胞以得到溶胞产物，中和该细胞溶胞产物和从细胞溶胞产物制备所希望的产物，其中所述容器的内容物通过旋转一个或多个涡轮来混合，并且其中溶胞和中和反应的进展通过测量施加于涡轮轴的转矩来监测。
作为技术人员，将会理解，可以使用或者直接或者间接地与容器内容物中的机械阻力相关的输入能量的测量来测量转矩。例如，粘弹特性的升高可以通过观察流体沿涡轮的轴攀升的韦森堡效应直接看到。也可以通过监测溶胞容器的搅拌器马达的转矩来间接的、但更客观的测量。在电机驱动涡轮中，可以通过测量升高的用以维持涡轮旋转恒定速度的电流来便利地测量转矩。在本发明这一方面的优选实施方案中，使用电流计来测量转矩，并由此监测反应的进展。
细胞中包含的质粒可以是任何上述的质粒或载体，但优选包含DNA的核酸载体。质粒可以是线性或环状结构，并适于在宿主细胞内游离或整合存在，这些如本领域的技术人员已知的大量文献描述的那些。
本发明还涉及使用本发明的容器从溶解的细胞培养物中得到的质粒。
本发明还涉及使用本发明的容器从溶解的细胞培养物中得到的蛋白。
现在，参照下列附图在所附实施例中说明本发明。
图1是表示根据本发明的5升的容器的示意图。
图2是表示根据本发明的60升的容器的示意图。
图3表示了用于本发明的容器中的InterMIG涡轮。
图4表示了用于本发明的容器中的分级式螺旋带状涡轮。
图5表示了使用INTERMIG涡轮或分离式螺旋带状涡轮混合细胞溶胞反应过程中的转矩测量曲线图。
材料和方法治疗性表达质粒载体pTX0161的构建pTX0161是高拷贝数(Co1E1复制起点)质粒载体，带有由巨细胞病毒的立即早期启动子驱动的Escherichia coli B硝基还原酶基因(ntr)。将这种载体传递到哺乳动物的肿瘤细胞使得特定细胞被药物前体CB1954杀死(Drabek等的Gene Therap，4，93-100，1997)，这是一种描述为基因定向的酶药物前体治疗法或GDEPT的增强癌症化学疗法的形式。
将ntr盒从pTX0160取出作为由Apal补平，XbaI限制酶消化的片段，随后插入pTX0003(一种由pUC19衍生的编码四环素抗性的载体)，从而构建pTX0161。生产菌株DH1 pTX0161的生成用10ng的pTX0161质粒DNA来转化钙感受态E.coli DH1细胞(Hanahan，Mol.Biol.，166，557-580，1983)。在好的制造实践(GoodManufacturing Practice)的条件下，选择单个的转化体来生成生产菌株的Master细胞库(MCB)。从指数生长培养物中收获的细胞低温储藏在20％的甘油中，并储藏在-80℃下构成MCB。DH1 pTX0161的发酵接种体的制备从MCB取出1ml小瓶的DH1 pTX0161，在37℃迅速解冻。将这小瓶内容物无菌地接种到在30ml普通瓶中添加了四环素(12μg/ml)的5ml的LB培养基(蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，Nacl 5g/l)中。这在37℃下的轨道振动器(200rpm)中培养。在指数生长中期，用4ml的该培养物来接种在500ml的锥形瓶中添加了四环素(12μg/ml)的46ml的Terrific液体培养液(Tartof and Hobbs，Focus，9，2-12，1987)。在再进行两个阶段的亚培养(在200ml和2000ml的含有四环素的发酵液中培养)之前按上文所述使之生长并在细胞密度达到2 OD600nm之后立即用于接种发酵罐。发酵营养复合批培养基包含最终浓度KH2PO4(3g/l)、Na2HPO4(6g/l)、NaCl(0.5g/l)、胨(2g/l)、(NH4)2SO4(10g/l)、聚丙二醇，分子量2025g(0.2％)、痕量元素溶液0.05％，[包括CoCl2·6H2O(2g/l)，CuCl2·2H2O(1.9g/l)，H3BO3(1.6g/l)，MnSO4·H2O(1.6g/l)，Na2MoO4·2H2O(2g/l)，ZnCl2·7H2O(2g/l)，Fe2(SO4)3·xH2O(1g/l)，CaCl2·2H2O(1g/l)以及柠檬酸(60g/l)])、CaCl2·2H2O(0.03g/l)、FeSO4.7H2O(0.04g/l)、柠檬酸(0.02g/l)以及酵母提取物(20g/l)，该培养基在发酵容器中制备，其体积达到46升。在原位消毒后，制备无菌添加剂，该添加剂包括甘油(2.8％)、MgSO4(0.5g/l)、维生素溶液(5ml/l[包括生物素0.6g/l、叶酸0.04g/l、盐酸吡哆醇1.4g/l、核黄素0.42g/l、泛酸5.4g/l以及烟酸6.1g/l])、以及四环素(12mg/l)。
然后，如上所述对发酵容器进行接种。在37℃、pH值6.8、溶解氧气为50％的饱和空气的条件下进行发酵。
从容器中定期取样，记录OD600nm以便计算具体的生长速率。在培养过程中将质粒DNA从样品中分离出来用于定性分析，将质粒DNA从发酵终点溶液中分离出来进行定量对比(Qiagen Maxi质粒纯化试剂盒，Qiagen Ltd.)。用干重测定值估计生物量。质粒拷贝数估计pTX0161，一个7796个碱基的质粒，其分子量为5.06×106道尔顿。已知本发酵培养液中1OD600nm单位等于2×108细胞/毫升(Kech andBrent，当代分子生物学中的科学实验报告，Ausubel等编，John WileySons Inc.New York，1.2.2，1995)，具体回收的质粒产量可以转换为回收的质粒拷贝数。发酵细胞采集在指数生长阶段后期在消毒的1000ml的离心瓶中利用离心分离方法，在4℃离心25分钟(5000g)来收集细胞。将澄清的上清液抛弃掉，细胞沉淀或者在-80℃冷冻或者在冷冻之前从罐子中取出并转移到袋内。手工溶胞操作用于和溶胞容器操作比较的手工溶胞操作是Qiagen Midi和Maxi所述的方法(Qiagen《质粒纯化手册》Plasmid Purification Handbook1997)。利用改进的碱性细胞溶解法收集初级质粒DNA制备5升细胞溶解液的细胞悬浮液总量180g(湿重)的细胞从于-80℃储藏的容器中取出，并在18℃解冻约20分钟。向每个离心瓶加入足以溶解细胞沉淀的细胞悬浮液缓冲液(pH8.0，50mM Tris 10mM EDTA)。收集重悬浮细胞，用Silverson高剪切混合器混合生成均匀悬浮液。然后用细胞悬浮缓冲液将体积调整到(按重量)1升，最终细胞浓度大约180g细胞湿重/升细胞悬浮缓冲液。制备60升细胞溶解液的细胞悬浮液总量1800g(湿重)的细胞从于-80℃储藏的容器中取出，并在18℃解冻约20分钟。从袋中取出细胞糊并加入9升细胞悬浮缓冲液(pH8.0，50mM Tris 10mM EDTA)。然后，使用Silverson高剪切混合器将细胞悬浮到缓冲液中，生成均匀悬浮液。然后用细胞悬浮缓冲液将体积调整到(按重量)15升，最终细胞浓度大约120g细胞湿重/升细胞悬浮缓冲液。袋过滤将容器内的内容物泵压通过100μm纺织尼龙过滤袋(PlastokHoldings Ltd)，然后采用深层过滤器(Millipore UK Ltd.Watford，England)进行5μm过滤。扩展床吸附色谱法用480ml的DEAE层流吸附剂(Pharmacia)装满层流50色谱柱(Pharmacia)。用0.1M NaOH以105cmhr-1的速率向上线性流动来扩展色谱床，停止，使之静置过夜，并在平衡缓冲液中(0.8M KAc，10mMEDTA pH5.5)中再扩展来制备装料柱。将含有质粒的滤液以相同的线性流动速率泵送到柱上。一旦装料完毕，用平衡缓冲液洗涤直到在线吸收探测仪(在254nm的光密度或OD254nm)降低到最大值的20％或更少。然后，用低盐缓冲液(25mM乙酸钾，10mM EDTA pH5.5)洗涤色谱柱，使流体反向流动。这使得色谱凝胶装载在柱中并减少后续步骤需要的缓冲液的量。继续冲洗直到达到最大OD254nm值的5％，然后用0.5M的盐冲洗缓冲液(25mM乙酸钾，10mM EDTA，0.5M NaCl pH5.5)从色谱柱洗脱残余的RNA片段。然后用洗脱缓冲液(0.75M NaCl，25mM KAc 10KM EDTA pH5.5)洗脱质粒DNA，并在+4到+8℃储存过夜。层流洗脱液的浓缩用0.1M NaOH清洁Pellicon XL超过滤装置(Millipore UK Ltd，Watford，England)，并用洗脱缓冲液冲洗。使用截断值为30千道尔顿分子量的薄膜通过超过滤将富含质粒的层流色谱洗脱液浓缩近25倍。轻轻倒出浓缩物，用缓冲液洗涤体系以将残余的质粒DNA洗下来，并与上述浓缩物合并。合并物的体积为～50ml，在4-10℃储存过夜。大小排阻色谱法为除去诸如被消化RNA片段等残余杂质，以及为了将质粒转换到合适配比的缓冲液中，将浓缩的层流洗脱液放置在利用大约112ml的Pharmacia S500HR介质装满的Pharmacia XK16柱上(床高度为56cm)。所用柱的管道系统事先利用0.1M的NaOH溶液清洁过，并利用0.3M NaCl平衡。全部浓缩物以1.2ml/min的速度装载到柱上。在整个走柱过程中监测柱洗脱液的OD254nm并收集2ml的级分。在第一个OD260nm峰的物质被认为是纯质粒DNA并被收集。收集的量大约为20-25ml。取出用于质量控制分析的样品，把剩余的大量质粒样品分成等份并冷冻在-80℃。DNA质量控制分析产品浓度假设在一个1cm长的通道池中0.0005％的质粒DNA溶液的消光系数是0.02单位，通过记录以分光光度计测定的在波长260nm下的光密度并将这个值转化为mg/ml来测定总核酸的浓度(溶液的强度)。按重量将高浓缩的样品稀释到使得记录的光密度落在发色团的线性响应范围内。宿主染色体DNA采用与大肠杆菌基因组中普通存在的元件互补的寡核苷酸引物，用PCR分析评估宿主染色体DNA杂质。用不同百分比(w/w)的DH1宿主染色体DNA，将通过双密度梯度超离心纯化(Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，Nolan等(编辑)，Cold SpringHabor Laboratory Press，New York，1989)的pTX0161标准物加倍强化。使同样量的pTX0161也进行该反应，并与其它样品在1％琼脂糖凝胶电泳中进行并列分析。在比较被宿主染色体DNA强化的标准物的强度与被测样品的强度的基础上得出最大的杂质浓度。内毒素杂质使用KQCL动力学生色测定(Biowhittaker UK Ltd)来评估内毒素杂质。产品被稀释到能克服干扰的程度。阳性产品对照包括证实没有通过样品或缓冲液组份发生的反应级联的抑制或增强。
实施例1容器(1)具有5升容积，165mm内径，并用容器(1)中的两个供料管(2，3)操作。容器(1)具有三个InterMig涡轮(4，5，6)，被布置于离容器(1)底部18mm、105mm和155mm的位置。第一供料管(2)布置于使得流体在与最低的涡轮(4)相同的高度输送。第一供料管(2)用于将细胞悬浮液和随后的溶胞缓冲液加入到容器(1)中。第二供料管(3)布置于使得流体在与第二个涡轮(5)相同的高度输送。第二供料管(3)用于加入中和缓冲液。
容器(1)还有四个围绕容器(1)垂直内壁等间隔放置的导流板(7)，其基本上与涡轮(4，5，6)的旋转轴平行。每个导流板(7)具有15mm的宽和大约315mm的长。导流板(7)距离容器(1)的内壁有5mm的间隙。导流板和由涡轮的旋转形成的弧之间的间隙为5mm。
供料管(2，3)由5或10ml的吸管构成，其中吸管底部的锥形部分被除去了并从与螺状抽吸管相连的顶部除去塞。供料管(2，3)具有大约4mm的内径。
容器(1)具有1.1(183/165)的纵横比。溶胞实验使用上述的Silverson高剪切实验室混合机(Silverson MachinesLtd.)将180g的冷冻细胞重悬浮到细胞悬浮缓冲液(50mM Tris碱，10mMEDTA pH8.0)中制成180g/l(湿重)含质粒pTX0161的大肠杆菌DH1细胞溶液。混合该溶液直到获得均匀的溶液。用细胞悬浮缓冲液将体积调到1升。然后将溶液转移到溶胞容器(1)中并在75rpm下混合。然后将100mg的RnaseA加入到溶液中，在搅拌下温育5分钟。
以1升/分钟的流速加入2升的溶胞缓冲液(0.155M NaOH/1％SDS)并记录溶胞开始的时间点。当所有的溶胞缓冲液加入(2分钟)后，搅拌速度升高到125rpm并维持直到所有的细胞溶解(溶胞开始后4分钟)。然后关闭涡轮。
在溶胞开始后9分钟30秒，开始以75rpm的速度搅拌容器的内容物。在溶胞开始后10分钟，以500ml/min的流速加入1升中和缓冲液(3M Kac，10mM EDTA pH5.5)。当顶部的涡轮(6)被完全覆盖时，涡轮的速度上升到100rpm并维持直到韦森堡效应消失(12分钟)。那时，认为溶胞已经完全，并关闭涡轮。
用围绕容器的5℃循环冷却水将容器内容物冷却40分钟使内容物的温度降至约10℃。然后将容器内容物经过上述的100μm过滤袋(Plastok Holdings Ltd.，Birkenhead，England)和5μm深层过滤器(Millipore Ltd.，Watford，England)过滤。然后将收集的滤液按上述的扩展床色谱法纯化。
应当注意，使用本发明的容器，可以在溶胞之前实现均匀细胞悬浮液的生成。
如上所述进行产量和杂质的测量。使用不同的质粒宿主菌株结合的质粒产量的结果
染色体DNA杂质
内毒素杂质
实施例2溶胞容器说明容器(8)具有60升容积，455mm内径，并用三个供料管(9，10，11)操作。容器具有盖(17)，该盖与容器主体形成气密性密封。容器具有五个涡轮(12，13，14，15，16)。第一个涡轮(12)是具有与其末端分叉的头(16)被去掉的InterMIG涡轮(参见图3)斜角相同的斜角的螺旋桨型涡轮。第一个涡轮(12)长190mm。其余的四个涡轮是如图3所示的InterMIG涡轮，长度为280mm。涡轮分别布置于离容器底部45mm、100mm、185mm、270mm和370mm的位置。因此前两个涡轮(12，13)在容器(8)底部15升高度内，用于搅拌细胞悬浮液。第三和第四个涡轮(14，15)位于容器(8)的15升到45升高度，和前两个涡轮(12，13)一起用于混合溶胞溶液和细胞。第五个涡轮(16)位于容器(8)的45升到60升高度，和前四个涡轮(12，13，14，15)一起用于混合中和溶液。
第一个供料管(9)在第一和第二个涡轮(12，13)的高度之间可移动。在此实施例中，该供料管布置于使得流体在与第一个涡轮(12)相同的高度输送。第二个供料管(10)在第一和第二个涡轮(12，13)的高度之间可移动。在此实施例中，该供料管开始布置于使得流体在与第二个涡轮(13)相同的高度输送。第三个供料管(11)在第二、第三、第四和第五个涡轮(13，14，15，16)的高度之间可移动。在此实施例中，该供料管开始布置在与第三个涡轮(14)相同的高度。供料管(9，10)通过螺状泵(Watson Marlow 600系列，装配有1.75cm ID硅管(Watson Marlow Ltd.，Falmouth，England))在手工控制下供料。
容器(8)还有四个围绕容器(8)垂直内壁等间隔布置的导流板(18)，其基本上与涡轮(12，13，14，15，16)的旋转轴平行。每个导流板(18)具有45mm的宽和大约330mm的长。导流板(18)距离容器(8)的内壁有10mm的间隙。
容器(8)具有0.97(440/455)的纵横比。溶胞实验在4℃将1200g的冷冻细胞重悬浮到细胞悬浮缓冲液(50mM Tris碱，10mMEDTA pH8)中制成15升含质粒pTX0161浓度为120g/l的大肠杆菌DH1细胞的细胞悬浮液。按上述使用Silverson高剪切混合机(Silverson Machines Ltd.)得到重悬液。混合该重悬液直到获得均匀的溶液，然后用细胞悬浮缓冲液将体积调到15升。通过上述发酵方案生成细胞并离心收集，使用前在-80℃储存。
将溶液悬浮液转移到溶胞容器(8)中并在8rpm下搅动。将重悬浮在15ml的细胞悬浮液中的1.5g的RNase(Sigma Chemicals)加入到细胞悬浮液中，在室温下温育5分钟。
将涡轮的速度升高到44rpm，将30升的溶胞缓冲液(0.155MNaOH，1.0％SDS)加入到溶液。开始，以7.4 l/min的流速通过第一和第二供料管(9，10)加料。当第三个涡轮(14)被液体完全浸没时，溶胞缓冲液还经过第三个供料管(11)以7.4 l/min的流速加入。将溶胞溶液在少于2分钟的时间内全部加入。然后将溶液再搅拌2分钟，之后停止涡轮，温育溶胞产物。
使先前在第三个涡轮(14)高度的第三供料管(11)的高度升高到第四个涡轮(15)的高度。
在开始加入溶胞缓冲液后10分钟，将涡轮转换为74rpm的速度，并同时以3.75 l/min的流速经所有的供料管(9，10，11)加入15升的中和缓冲液(3M乙酸钾，10mM EDTA pH5.5在4℃)。该加入在少于2分钟的时间内完成，之后，涡轮速度降低到26rpm，这些条件再维持3分钟，之后，涡轮速度降低到16rpm再进行6分钟。
然后，将容器内容物经过上述的100μm过滤袋(Plastok HoldingsLtd.，Birkenhead，England)和5μm深层过滤器(Millipore Ltd.，Watford，England)过滤。然后将收集的滤液按上述的扩展床色谱法纯化。
如上所述进行产量和杂质的测量。结果质粒产量 344μg/g湿重内毒素含量 13Eu/mg染色体DNA4％
在中和缓冲液加入时，显示马达转矩剧烈降低。然后达到稳定状态，再一次预示没有发生流变性的进一步变化并且中和反应完成。
所有本文提到的参考文献都引入作为参考。
当然可以理解，本发明纯以例子的方式进行了描述，可在本发明的精神范围内进行细节的改进，所述本发明的范围由在后面的权利要求书限定。
权利要求
1.用于混合细胞悬浮液和/或含有染色体DNA和所希望的产物的细胞溶胞产物的容器，其中该容器包含(a)一个或多个低功率数的涡轮，其布置使得涡轮向容器的全部内容物提供均匀的分散能；(b)一个或多个供料管，使液体加入到围绕一个或多个涡轮的末端形成的彻底混合区域；和(c)一个或多个围绕容器内表面大体上等间隔的导流板，其中一个或多个导流板沿与涡轮的旋转轴大体平行的方向延伸。
2.根据权利要求1所述的容器，其中所希望的产物是质粒DNA。
3.根据权利要求1所述的容器，其中所希望的产物是蛋白。
4.根据权利要求1到3中任何一项所述的容器，其中一个或多个涡轮是interMIG涡轮。
5.根据权利要求1到3中任何一项所述的容器，其中一个或多个涡轮是螺旋带状涡轮。
6.根据权利要求5所述的容器，其中一个或多个螺旋带状涡轮是分级式螺旋带状涡轮。
7.根据前述权利要求中任何一项所述的容器，其中供料管是位于容器内表面的一根管或一系列管，该供料管在与涡轮在容器中大致相同的高度输送流体。
8.根据权利要求7所述的容器，其中一根或多根供料管在容器内可移动，这样使得加入流体的高度可以在混合过程中调整。
9.根据权利要求1到3中任何一项所述的容器，其中供料管是承载涡轮的轴内的导管，其经过一个或多个涡轮将液体输送到靠近一个或多个涡轮的末端。
10.根据前述权利要求中任何一项所述的容器，其中纵横比是0.1到2.5。
11.根据前述权利要求中任何一项所述的容器，其中涡轮长度对容器内径的比率大于0.5。
12.根据前述权利要求中任何一项所述的容器，其中该容器具有4个导流板。
13.根据前述权利要求中任何一项所述的容器，其中导流板具有容器内径的6％到15％的宽度。
14.一种在细胞悬浮液中溶解细胞时使用根据前述权利要求中任何一项所述的容器的方法，所述细胞包含染色体DNA和所希望的产物，其中一个或多个涡轮以选定的速度旋转，该速度保证获得有效的混合而不产生足以导致染色体DNA基本片段化或聚集物絮凝的机械应力。
15.一种监测容器中细胞悬浮液的溶胞程度的方法，其中通过旋转一个或多个涡轮来混合容器的内容物，该方法包括测量应用于涡轮轴上的转矩，其中转矩按细胞溶胞的程度成正比增大直到溶胞完成，这时转矩稳定在最大值。
16.根据权利要求15所述的方法，其中细胞溶胞引起转矩比施加在涡轮轴上的初始转矩增大500％到1500％，来混合未溶解的细胞悬浮液。
17.根据权利要求15或16所述的方法，还包括在细胞溶胞完成后中和所述容器的内容物的步骤。
18.根据权利要求17所述的方法，其中细胞溶胞产物的中和程度可以通过测量施加于涡轮轴的转矩来监测。
19.根据权利要求18所述的方法，其中细胞溶胞产物的完全中和通过转矩减少到小于在反应的溶胞阶段中施加在轴上的最大转矩的50％来指示。
20.一种在容器中从细胞悬浮液制备所希望的产物的方法，包括下列步骤通过碱裂解法来溶解所述细胞以得到溶胞产物，中和该细胞溶胞产物和从细胞溶胞产物制备所希望的产物，其中所述容器的内容物通过旋转一个或多个涡轮来混合，并且其中使用根据 15-19中任何一项所述的方法来监测溶胞和中和反应的进展。
21.一种质粒，其是通过使用权利要求1到13中任何一项所述的容器，或使用根据权利要求14-20中任何一项所述的方法，从溶解的细胞培养物获得。
22.一种蛋白，其是通过使用权利要求1到13中任何一项所述的容器，或使用根据权利要求14-20中任何一项所述的方法，从溶解的细胞培养物获得。
23.一种拆分螺旋带状涡轮，包含螺旋涡轮的两个或多个部分，该螺旋涡轮位于轴上时在所述各部分之间存在间隙，该间隙处不包含涡轮的叶片或部分叶片。
全文摘要
本发明涉及用于混合细胞溶胞产物的容器。本发明还涉及使用该容器来混合细胞溶胞产物以获得高纯度产品如用于多种用途的核酸或蛋白的方法。本发明还涉及通过测量细胞悬浮液的粘度来监测细胞悬浮液中细胞溶胞的程度的方法。
文档编号B01F7/16GK1343136SQ00804899
公开日2002年4月3日 申请日期2000年3月10日 优先权日1999年3月11日
发明者阿尔文·威廉斯·宁奥, 安东尼·戈登·希契科克, 格兰恩·洛伊丝·赖利 申请人:科布尔药物有限公司