专利名称：增强细胞生存力和生物产物产量的方法
技术领域：
本发明涉及哺乳动物细胞培养过程，更特别地涉及通过改善细胞培养基的过程参数，包括PH值、重量克分子渗透压浓度和溶解二氧化碳水平的控制来增强细胞生长、细胞密度、细胞生存力、产物浓度和产物产量的方法。背景
蛋白质治疗剂和其他生物制品例如单克隆抗体的商业性生产当前一般在生物反应器中进行，所述生物反应器适合于培养遗传优化的哺乳动物、昆虫或其他细胞类型的悬浮液。 哺乳动物细胞培养生物反应器一般具有数百到数千升工作体积。最常见的全规模制造厂具有工作体积从约1，000升直到25，000升的工作体积的生物反应器。临床试验的药物候选物在具有五(5)到几百升工作体积的实验室规模生物反应器中生产。优化以实现最少的时间量中可能的最高生物产物产量和生物反应器规模扩大的相关的挑战集中于控制公认的关键过程参数，例如PH值、溶解氧(DO)、温度、营养物组成和副产物分布、搅动分布、气体喷射方法、营养物进料和产物收获分布。其他过程参数例如溶解的二氧化碳(dC02)和重量克分子渗透压浓度(S卩，每千克溶液溶解的颗粒的浓度)的重要性近来才被记录在文献中。事实上，许多商业的生物反应器甚至不具有安装的装置来就地测量溶解的二氧化碳水平和/或重量克分子渗透压浓度，不用说控制和优化这些参数的装置。取决于商业性运行的规模——从数百直到25，000升的生物反应器体积，过程的规模扩大、优化和控制构成了不同的挑战。在高于约1，000升的商业规模下，如果可能的话，使用当前最好的可获得的技术和方法，溶解的二氧化碳水平和重量克分子渗透压浓度的同时和单独控制变得困难。在生物反应器中开始制造规模的哺乳动物细胞培养过程之前，一般制备种子培养物接种物。这涉及在孵化器中的一系列烧瓶和/或递增体积的较小生物反应器中培养生产细胞，直到可获得足够的细胞用于接种到生产生物反应器中。所述过程涉及将细胞群体从一个培养容器转移到更大的培养容器中。一般地，细胞群体的20%稀释物被用于每次转移或传代培养。在孵化器中，具有培养基的烧瓶被夹持在转台上来漩涡培养物和促进培养基与孵化器中的空气之间的气体转移。一般地，用于哺乳动物细胞培养过程的孵化器设置在 37°C、5% 二氧化碳(CO2)和高于约80%的湿度水平。类似的温度和(X)2水平用于在生物反应器中生长的种子培养物。当种子培养物达到足够的体积和细胞密度时，它被接种到生产生物反应器中。在种子培养物接种到生物反应器培养基中之后，在细胞培养过程期间，参数例如 PH值、温度和溶解氧水平被控制到指定的水平。pH值一般通过在过程期间必要时添加碱性或酸性溶液来控制。通常使用的碱性溶液包括碳酸氢钠、碳酸钠和氢氧化钠溶液。二氧化碳 (CO2)的溶解通常用于实现更为酸性的pH值。虽然可以获得其他酸用于控制pH值，溶解的 CO2和碳酸氢钠组合形成了细胞培养物的最稳定的和有利的缓冲系统。哺乳动物细胞培养过程的培养基或溶液的优选的温度是约37°C。培养基或溶液中期望的溶解氧水平一般利用安装在生物反应器底部的喷射器通过空气喷射来实现，以及利用破裂大的空气/氧气泡的叶轮搅动培养基或溶液来增强氧气从喷射的气泡向细胞培养基的转移。用覆盖气体吹扫生物反应器顶部空间提供了有限程度的表面气体交换。不利地，空气喷射和培养基或溶液的搅动可能引起泡沫和对哺乳动物细胞的剪切损伤，其不利地影响细胞生存力。在培养基的表面上泡沫的积累也导致进一步限制表面气体交换和降低生物反应器的可用的工作体积。商业规模的哺乳动物细胞培养过程可以以三种不同的运行方式进行用于悬浮的细胞培养物的批量模式和进料-分批模式，以及用于固定化细胞的灌流模式。大部分商业规模的哺乳动物细胞培养过程以进料-分批模式运行。在进料-分批模式中，其他的培养基和营养物在细胞培养过程期间的不同时间添加到生物反应器，来在初始的生物反应器建立之后补充碳源和其他营养物。在任何生物反应器用于哺乳动物细胞培养之前，一般它必需被消毒和装备各种探测器，以及用于补充气体供应和导入其他进料的连接物。温度探测器、PH值检测器、溶解氧探测器和溶解CO2探测器或传感器被用于实时监测细胞培养基或溶液的温度、pH值、溶解氧和溶解CO2水平。此外，细胞培养基或溶液样品可以在选定的间隔时间从生物反应器中抽出来测定细胞密度和细胞生存力，以及分析其他特征，例如，代谢物和重量克分子渗透压浓度。根据这样的分析结果，其他进料或其他添加剂可以添加到细胞培养基或溶液，以延长细胞生存力和提高生物制品的产量。当细胞生存力达到指定的下阈值时，细胞培养过程可以停止或关闭。指定的下阈值常常根据下游回收和收获的生物制品的纯化的结果经验性地确定。在培养过程期间，哺乳动物细胞展现了三个阶段，S卩，迟缓期、指数生长期、以及稳定或生产期。迟缓期在接种之后立即出现，一般是哺乳动物细胞对新环境的生理适应的阶段。在迟缓期之后，哺乳动物细胞被认为处于指数生长期。在指数生长期中，哺乳动物细胞扩增，细胞密度随时间指数地提高。在指数生长期的某些时点期间，许多细胞实际上开始生产期望的蛋白质、抗体或生物产物。细胞密度是指培养物中细胞的总数，通常以活细胞和非活细胞的密度表示。当哺乳动物细胞达到稳定或生产期时，活细胞活跃地产生用于下游收获的生物产物。在这个阶段，总细胞密度可能一般保持恒定，但是细胞生存力(即，活细胞的百分比)倾向于随着时间快速地降低。已知哺乳动物细胞对于细胞培养基或溶液中溶解的二氧化碳的数量敏感。在指数生长期期间暴露于过量的二氧化碳水平的哺乳动物细胞培养物可能展现单克隆抗体或其他期望的生物产物的降低的产生。在接种之前，弱碱性培养基的PH值必需用调节到最佳值的二氧化碳降低。这个过程常常导致在许多哺乳动物细胞培养过程的迟缓期的开始时溶解的二氧化碳的升高的水平。在哺乳动物细胞培养生物反应器中溶解的二氧化碳来自化学和生物学来源。二氧化碳的化学来源是在细胞培养基或溶液内发生的平衡化学反应，所述细胞培养基或溶液包括含有碳酸氢钠和/或碳酸钠的选定数量的缓冲溶液。另外，二氧化碳可以直接喷射到弱碱性培养基或溶液中来将肉汤的PH值水平降低到指定水平，通常约7. 0，产生更多的溶解的二氧化碳。二氧化碳的生物学来源是生物反应器内哺乳动物细胞的呼吸作用的产物。二氧化碳的这种生物学来源随着细胞密度提高，一般在大约生物反应器内细胞密度最大的同时达到其最大值。然而，随着产生更多的二氧化碳，细胞培养基的PH值倾向于酸性，从而需要另外的碳酸氢盐来将细胞培养基或溶液的PH值保持在期望的范围之内。
为了补偿降低PH值的提高的溶解二氧化碳的作用，人们可以添加碳酸氢钠以将溶液的PH值维持在指定范围内。补偿提高的二氧化碳的效应的这些方法对哺乳动物细胞培养过程具有其他消极后果。首先，溶解二氧化碳水平的任何提高促进了细胞培养基或溶液重量克分子渗透压浓度的提高。类似地，调节溶液的PH值以补偿二氧化碳所需的碳酸氢钠的添加也提高重量克分子渗透压浓度。(重量克分子渗透压浓度代表了每千克溶液溶解的颗粒的数量，通常通过冰点下降报告为mOsm/kg.) 添加碳酸氢钠也将提高容许进入溶液的溶解二氧化碳的平衡饱和水平，使得二氧化碳更难以在曝气过程中除去。本领域已知的是，溶解二氧化碳的提高的水平或提高的重量克分子渗透压浓度对细胞密度或产量具有有害的或消极的影响。然而，二氧化碳水平和重量克分子渗透压浓度的组合的或协同的效应没有充分地了解。二氧化碳在水中在7的pH值下解离成碳酸氢盐离子。仅仅部份二氧化碳保持为非解离状态的游离C02。由于大多数哺乳动物细胞培养在6. 5到7. 5的范围内的PH值水平下进行，从细胞培养物中除去溶解的二氧化碳因而变得困难。离解的碳酸氢盐离子不容易除去，一般必需在可以从溶液中脱除它们之前重新结合成游离二氧化碳。碳酸氢钠的任何添加来平衡PH值也将提高溶液中平衡溶解二氧化碳浓度或饱和水平，使得更加难以物理上除去二氧化碳。从哺乳动物细胞培养溶液除去或脱除溶解二氧化碳的常规方法是通过用空气或空气/氧气/氮气的气体混合物在搅拌罐中喷射细胞培养物溶液。然而，在搅拌罐中气体喷射引起对细胞培养过程的不良作用。特别地，在旋转的搅拌器的尖端的气体-气泡破裂是高剪切速率的来源，其损伤哺乳动物细胞膜，常常足以导致细胞死亡。即使当损伤是亚致死性时，在修复受损的膜期间细胞生产力受到损害。并且，将空气或氮气喷射到生物反应器中产生气泡，其上升到生物反应器内溶液的表面，在此气体被释放到顶部空间中。在细胞培养溶液的顶部表面处的气泡破裂常常比由搅拌器引起的损伤更大地损害哺乳动物细胞。限制搅拌器速度和限制气体喷射速率当前被看作是避免这样的损伤和提高细胞生存力的最佳方式。然而，这些手段都降低了可被除去的二氧化碳的数量，不能除去的过量部分还抑制细胞生长和生存力。在大的商业规模的生物反应器中这些缺点是要克服的特别的挑战，在所述生物反应器中剪切速率随着叶轮的直径实质上地提高。并且，大规模生物反应器中更大的静液压头倾向于提高二氧化碳的溶解度，意味着需要除去更多以将溶解的ω2水平维持在最佳范围内。发明概述
本发明特征在于一种提高哺乳动物细胞培养过程中的产物产量的方法，包括步骤通过经由生物反应器中细胞培养基的顶部表面处的表面气体交换除去(remove)溶解的二氧化碳，在整个哺乳动物细胞培养过程的生长期和生产期中将细胞培养基中的溶解二氧化碳维持在小于约10%的溶解二氧化碳浓度的水平下，其中细胞培养基中的重量克分子渗透压浓度在哺乳动物细胞培养过程期间被维持在特定细胞的最佳范围内，细胞培养基的PH值在哺乳动物细胞培养过程期间被维持在特定细胞的最佳范围内。本发明还可以特征在于一种提高进料-分批哺乳动物细胞培养过程中的蛋白质产物产量的方法，包括步骤(i)在具有细胞培养基的生物反应器中接种哺乳动物细胞培养物，所述细胞培养基具有与溶解二氧化碳平衡的指定水平的碳酸氢盐和初始水平的重量克分子渗透压浓度；(ii)在哺乳动物细胞培养过程的生长期期间向细胞培养基周期性地添加营养物；(iii)在哺乳动物细胞培养过程的生长期或生产期期间向细胞培养基周期性地添加酸或碱来将PH水平维持在所述哺乳动物细胞的指定范围内，而不添加二氧化碳气体；(iv)在哺乳动物细胞培养过程的生长期或生产期期间调整生物反应器中细胞培养基的顶部表面上方顶部空间中含氧扫掠气的体积流量，来促进细胞培养基的顶部表面处的表面气体交换；和(ν)在生长期或生产期期间调整置于生物反应器中细胞培养基的顶部表面下方的上流式叶轮的转速。细胞培养基中溶解二氧化碳通过经由表面气体交换脱除 (strip) 二氧化碳在整个哺乳动物细胞培养过程的生长期或生产期维持在低于约10%的溶解二氧化碳浓度的稳定水平。细胞培养基中的重量克分子渗透压浓度在哺乳动物细胞培养过程期间维持在特定细胞的最佳范围内，进料-分批哺乳动物细胞培养过程的产物产量被提尚。做为选择本发明可以特征在于一种提高进料-分批哺乳动物细胞培养过程中产物产量的方法，包括步骤(i )用细胞培养基接种细胞培养物，所述细胞培养基具有与溶解二氧化碳平衡的指定水平的碳酸氢盐；(ii)通过除去溶解二氧化碳在整个进料-分批哺乳动物细胞培养过程的生长期或生产期将细胞培养基中溶解二氧化碳的浓度维持在低于约 10% ；和(iii)从进料-分批哺乳动物细胞培养过程的生长期的起始到生产期的结尾将细胞培养基中重量克分子渗透压浓度的提高限制在小于400 mOsmol/kg，其中所述细胞培养基的PH值在哺乳动物细胞培养过程期间被维持在特定细胞的最佳范围内。本发明还可以特征在于一种控制进料-分批哺乳动物细胞培养过程中细胞培养基的PH值水平的方法，包括步骤(i )在接种期期间向细胞培养基提供二氧化碳和碳酸氢钠缓冲剂来建立细胞培养基中碳酸氢盐与溶解二氧化碳的指定平衡水平和重量克分子渗透压浓度的初始水平；(ii)在进料-分批哺乳动物细胞培养过程的生长期和生产期期间从细胞培养基脱除溶解二氧化碳；(iii)在生长期期间和任选地在生产期期间向细胞培养基添加营养物；(iv)在生长期和生产期期间向细胞培养基添加酸或碱来将PH值水平维持在指定范围内，而不添加二氧化碳气体用于PH值调整。作为这种过程的结果，细胞培养基中的重量克分子渗透压浓度水平被维持在指定范围内，从生长期的起始到生产期的结尾重量克分子渗透压浓度水平的提高小于400 mOsmol/kg，在生长期和生产期期间细胞培养基中溶解二氧化碳的浓度维持在10%或更低。做为选择本发明可以特征在于一种在进料-分批哺乳动物细胞培养过程的生产期期间延长细胞生存力和提高蛋白质产物产量的方法，包括步骤(i)在进料-分批哺乳动物细胞培养过程的生产期期间用水稀释细胞培养基，来降低细胞培养基中废物的毒性影响；(ii)在进料-分批哺乳动物细胞培养过程的生产期期间向细胞培养基添加补充的营养物来补偿水的稀释效应；(iii)在进料-分批哺乳动物细胞培养过程的生产期期间将细胞培养基中溶解二氧化碳的浓度维持在10%或更低，并将细胞培养基中重量克分子渗透压浓度水平和PH值水平维持在哺乳动物细胞的最佳范围内，其中由于在进料-分批哺乳动物细胞培养过程的生产期期间哺乳动物细胞的延长的细胞生存力蛋白质产物产量被提高。可以表征本发明的另一种方式是一种改善产自进料-分批哺乳动物细胞培养过程的蛋白质产物的纯度的方法，包括步骤(i)在具有细胞培养基的生物反应器中接种哺乳动物细胞培养物，所述细胞培养基具有与溶解二氧化碳平衡的指定水平的碳酸氢盐和初始水平的重量克分子渗透压浓度；(ii)向细胞培养基添加营养物从而提高细胞培养基的重量克分子渗透压浓度水平来加速来自哺乳动物细胞的蛋白质生产；(iii)向细胞培养基添加酸或碱来将PH值水平维持在哺乳动物细胞的指定范围内；(iv)在整个进料-分批哺乳动物细胞培养过程中从细胞培养基脱除溶解二氧化碳，其中细胞培养基中溶解二氧化碳的浓度维持在10%或更低，其中自重量克分子渗透压浓度的起始水平的重量克分子渗透压浓度水平的提高被限制在小于约400 mOsmol/kg ；和(ν)在进料-分批哺乳动物细胞培养过程的生长期或早期生产期期间从生物反应器收获蛋白质产物。最后，本发明可以特征在于一种控制进料-分批哺乳动物细胞培养过程中细胞培养基的重量克分子渗透压浓度水平的方法，包括步骤(i)在接种期期间向细胞培养基提供二氧化碳和碳酸氢钠缓冲剂来建立细胞培养基中碳酸氢盐与溶解二氧化碳的指定平衡水平和重量克分子渗透压浓度的初始水平；(ii)在生长期期间向细胞培养基添加营养物， 从而提高细胞培养基的重量克分子渗透压浓度水平；(iii)在生长期期间向细胞培养基添加酸或碱来将PH值水平维持在指定的范围内；(iv)在进料-分批哺乳动物细胞培养过程的生长期期间从细胞培养基脱除溶解二氧化碳，其中在生长期期间细胞培养基中的溶解二氧化碳的浓度被维持在10%或更低，其中在生长期的部分期间细胞培养基中重量克分子渗透压浓度水平降低，从生长期的起始到生长期的结尾重量克分子渗透压浓度水平的总体提高小于约 400 mOsmol/kg。附图的简要描述
根据连同以下的图画中呈现的、以下的本发明的更详细的说明，本发明的上述和其他方面、特征和优点将变得更加明显，其中
附
图1是描绘在具有中度水平重量克分子渗透压浓度的过程中哺乳动物细胞系的三个不同运行的溶解二氧化碳百分比，其中三个运行包括具有高峰值溶解二氧化碳水平的一个、具有中度峰值溶解二氧化碳水平的另一个和具有低峰值溶解二氧化碳水平的第三个；
附图2A是描绘附图1的具有中度重量克分子渗透压浓度的过程中哺乳动物细胞系的三个不同运行中、作为按天数的时间的函数的哺乳动物细胞培养过程中活细胞密度的图形；
附图2B是描绘附图1的具有中度重量克分子渗透压浓度的过程中哺乳动物细胞系的三个不同运行中、作为按天数的时间的函数的按照百分比的细胞生存力的图形；
附图2C是描绘附图1的具有中度重量克分子渗透压浓度的过程中哺乳动物细胞系的三个不同运行中、作为按天数的时间的函数的哺乳动物细胞培养过程中总细胞密度的图形；
附图3A是描绘附图1的具有中度重量克分子渗透压浓度的过程中哺乳动物细胞系的三个不同运行中、作为按天数的时间的函数的哺乳动物细胞培养过程中生物产物浓度的图形；
附图3B是描绘利用当前的动态气体控制(Dynamic Gas Control，DGC)过程，如附图1、 2和3A中描述的典型的低溶解二氧化碳哺乳动物细胞培养过程的重量克分子渗透压浓度分布的图形。附图3C是描绘附图1、2和3A中描述的基线哺乳动物细胞培养过程的重量克分子渗透压浓度分布的图形。
附图4是描绘具有一般恒定的或稳定的重量克分子渗透压浓度的过程中哺乳动物细胞系的两个不同运行的、作为按照天数的时间的函数的哺乳动物细胞培养过程中溶解二氧化碳的百分比的图形，其中第一个运行包括低的峰值溶解二氧化碳水平，第二个运行包括中度的总体峰值溶解二氧化碳水平。附图5是描绘附图4的具有中度重量克分子渗透压浓度和一般恒定或稳定的溶解二氧化碳水平的过程中哺乳动物细胞系的两个不同运行中、作为按天数的时间的函数的哺乳动物细胞培养过程中活细胞密度的图形；
附图6是描绘附图4的具有中度重量克分子渗透压浓度和一般恒定或稳定的溶解二氧化碳水平的过程中哺乳动物细胞系的两个不同运行中、作为按天数的时间的函数的哺乳动物细胞培养过程中生物产物滴度或浓度的图形；
附图7是描绘哺乳动物细胞培养过程的生长和生产期期间溶解二氧化碳分布的图形； 附图8是描绘其中维持溶解二氧化碳的不同的、但一般恒定的水平的哺乳动物细胞系另外两个不同运行中，作为按照天数的时间的函数的哺乳动物细胞培养过程中活细胞密度的图形；
附图9是描绘附图8的具有不同但一般恒定的溶解二氧化碳水平的过程中哺乳动物细胞系的两个不同运行的，作为按照天数的时间的函数的哺乳动物细胞培养过程中重量克分子渗透压浓度的图形；
附图10是描绘附图8的具有不同的但一般恒定的溶解二氧化碳水平的过程中哺乳动物细胞系的两个不同运行中、作为按天数的时间的函数的哺乳动物细胞培养过程中活细胞百分比的图形；
附图11是描绘附图8的具有不同的但一般恒定的溶解二氧化碳水平的过程中哺乳动物细胞系的两种个不同运行中、作为按天数的时间的函数的哺乳动物细胞培养过程中生物产物产量或滴度的图形；
附图12是描绘与标准运行相比较的、利用当前的动态气体控制(DGC)过程的两个不同运行的，作为按照天数的时间的函数的哺乳动物细胞培养过程中溶解二氧化碳的图形；
附图13是描绘与标准运行相比较的、利用当前的动态气体控制(DGC)过程的两个不同运行的，作为按照天数的时间的函数的哺乳动物细胞培养过程中细胞生存力的图形；
附图14是描绘与标准运行相比较的、利用当前的动态气体控制(DGC)过程的两个不同运行的，作为按照天数的时间的函数的哺乳动物细胞培养过程中活细胞密度的图形；
附图15是描绘与标准运行相比较的、利用当前的动态气体控制(DGC)过程的两个不同运行的，作为按照天数的时间的函数的哺乳动物细胞培养过程中生物产物产量或滴度的图形；
附图16是描绘具有变化的重量克分子渗透压浓度水平的细胞培养过程中IgG滴度对比峰值(10)2的趋势的图表；
附图17是描绘具有低水平溶解二氧化碳的DGC型细胞培养过程中IgG滴度对比最大重量克分子渗透压浓度的趋势的图表；
附图18是提供了在重量克分子渗透压浓度和溶解二氧化碳的不同组合的各种细胞培养过程运行期间采集的数据的表格；
附图19A是描绘了利用当前的动态气体控制(DGC)过程在第一次样品运行期间，对配置在生物反应器中的上流式叶轮的转速的调整，以及在生物反应器中细胞培养基的顶部表面上方的顶部空间中含氧的扫掠气的体积流量的调整的图形；和
附图19B是描绘了利用当前的动态气体控制(DGC)过程在第二次样品运行期间，对配置在生物反应器中的上流式叶轮的转速的调整，以及在生物反应器中细胞培养基的顶部表面上方的顶部空间中含氧的扫掠气的体积流量的调整的另一个图形。详细说明
二氧北石炭、DH龍好灘碰龄胃
大部分商业规模的哺乳动物细胞培养生产转入进料-分批过程，控制以维持相对恒定的重量克分子渗透压浓度、PH值和溶解二氧化碳水平是几乎不可能的。在进料-分批过程中添加营养物和细胞强化剂将总是倾向于提高细胞培养物重量克分子渗透压浓度，而PH 值和溶解二氧化碳水平在整个过程中不断变化。例如，在指数生长期期间产生的二氧化碳可超出了大多数当前的生物反应器的二氧化碳脱除能力，引起溶解二氧化碳水平的持续提高。溶解二氧化碳水平的这种继续提高常常需要添加碱来中和溶解二氧化碳对PH值的影响，因为控制细胞培养基的PH值被看作是管理任何哺乳动物细胞培养过程的最关键参数之一。提高溶解二氧化碳和添加碱都进一步提高了细胞培养基或溶液的重量克分子渗透压浓度。简而言之，细胞培养基或溶液中的 PH值、重量克分子渗透压浓度和溶解二氧化碳水平都是紧密地相互联系的。许多本领域技术人员相信最低水平的溶解二氧化碳和重量克分子渗透压浓度将提供哺乳动物细胞培养过程的最佳运行条件。然而，近期的研究和在此公开的某些经验数据另外地表明，溶解二氧化碳的最佳水平和最佳重量克分子渗透压浓度仍然需要对每种独立的哺乳动物细胞系和细胞培养过程来确定。当二氧化碳溶于哺乳动物细胞培养基中时，它形成HC03_，一种生长的细胞的关键离子。随着溶解二氧化碳建立与HC03_离子的平衡，PH值被降低。对HC03_的需求与它的缓冲作用无关，但是由于二氧化碳、HCO3-和pH值是密切联系的，难以限定溶解的二氧化碳的最佳水平和对细胞生长的直接影响。当在开放的容器中孵育细胞时，一般使用95%空气和 5%二氧化碳的气体混合物。最初根据在肺的肺泡腔中存在的二氧化碳来选择二氧化碳的浓度。这种二氧化碳浓度是用于肺成纤维细胞的研究的，但是现在变为哺乳动物细胞培养过程中的典型的二氧化碳浓度。气相二氧化碳张力将作为温度的函数直接地调节溶解二氧化碳的浓度。这种调节随后产生H2CO3,其根据以下反应解离
H1O + CO2 O H1CO3 OH+ + HCOf............ (ι)
HCO3-具有十分低的解离常数，仅产生低浓度的氢离子，获得仅中度降低的溶液pH值。 提高大气的二氧化碳的净结果是通过向右移动上述(1)中显示的平衡的系列来降低PH值。 为了维持固定的PH值，碱，例如碳酸氢钠被用于中和提高的二氧化碳张力的作用
NaHCQ3 ONa+ + HCO..................⑵
提高的HCO3-浓度抵抗了更高的溶解二氧化碳水平的作用，将上述(1)中的平衡向左侧推动，直到平衡可以在碳酸氢盐系统的PH 7. 4处建立。
总之，在开放容器中的细胞培养物需要在二氧化碳的大气中孵育，其浓度与培养基中的碳酸氢钠平衡。在密封的烧瓶中生长到中高浓度(IX IO5个细胞/mL)的细胞可能不需要二氧化碳添加到气相，条件是碳酸氢盐浓度被保持很低广4 mM)特别是如果细胞是高酸生产者的话。然而，在更低的细胞浓度下(例如，在克隆或接种期间)，以及对于某些原代培养物，必需向密封烧瓶的气相添加二氧化碳。当需要出口来容许二氧化碳的平衡化或它的逃逸时(如对于高酸生产者)，必需使覆盖物保持松弛，或使用二氧化碳可透过的覆盖物。 孵化器的大部分用95%空气和5% 二氧化碳的混合物吹扫。在良好控制的生物反应器中，将至少在开始时需要二氧化碳来将培养基pH值调节到适当的值。将需要其他的二氧化碳来中和孵化器中小的容器中生长的接种物，因为这些倾向于具有比生物反应器设置点更高的PH值。使用二氧化碳的这种起始PH值调整将提高起始批次的重量克分子渗透压浓度。随着在分批过程中培养的细胞达到指数生长期，它们变为最大代谢活性的，每个细胞产生它最大的二氧化碳输出。当细胞密度低时，大部分二氧化碳可以通过用空气喷射发酵液或用覆盖气或空气扫掠生物反应器的顶部空间来除去。然而，进入分批循环几天后， 二氧化碳产生将超过典型的生物反应器的正常二氧化碳清除能力。细胞产生的过量的二氧化碳将提高溶解二氧化碳水平并降低溶液PH值。为了维持优选的pH值，需要添加额外的碱，产生过多的溶解二氧化碳和不期望的高重量克分子渗透压浓度。由于二氧化碳产生和脱除速率之间的不平衡的次优条件随着扩大到更大的生物反应器而变得更为严重。首先，随着常规的生物反应器大小增加，表面积比体积比降低。对于相同的覆盖气比反应器体积，在液体表面处二氧化碳脱除的有效性被大大降低。优选的二氧化碳脱除系统和方法的实例在美国临时专利申请系列号61/086665中公开。哺乳动物细胞培养中的pH倌优化
哺乳动物细胞培养过程中的PH值设置点可以显著地影响细胞培养性能。已知细胞培养基PH值影响许多哺乳动物细胞类型的细胞内酶活性。降低的pH值降低了比葡萄糖消耗和乳酸生成率，降低了葡萄糖耗尽的风险或乳酸的毒性水平。在典型的哺乳动物细胞培养中较低的PH值设置点是约7. 0 ；已知低于约6. 8的pH值抑制细胞生长。还已知中间或中度PH值影响哺乳动物细胞的比生长速率和比生产率，其最终影响总体培养物生产力。过低或过高的PH值可能杀死细胞。约7. 0到7. 4的pH值范围通常用于哺乳动物细胞培养过程。常常在过程期间发生的PH值的大幅变动，例如，当重新补足培养基时，对细胞具有不良作用。控制哺乳动物细胞培养过程中的PH值现今是特别重要的，因为常规地达到高细胞密度(>1 X IO6个细胞/mL)。 没有适当的PH值控制，当细胞这样浓缩时，细胞培养发酵液可能快速地变为酸性。不同类型的哺乳动物细胞可能具有不同的生长最佳pH值。一般地，人类成纤维细胞在比被建立的细胞(pH 7. 0-7. 4)更高的pH值(7. 6-7. 8)下生长，在7. 2-7. 4的pH值下培养原代细胞是常见的。在低培养密度下人类包皮成纤维细胞(例如，FS-4)生长的最佳 PH值，比人类肺成纤维细胞(例如，MRC-5)的生长最佳pH值更为碱性。当在约IO5个细胞 /mL或更小的密度下培养生长期期间的这些细胞时，对于FS-4，pH值应当是约7. 7到7. 8， 对MRC-5细胞约7. 5到7. 6。对于CHO细胞，通常有益的是在附着期间在约7. 0的pH值下培养细胞。在几个小时之后，CHO细胞培养过程中的pH值可以提高到稍微更高的值。
将细胞培养发酵液维持在约7. O或更高的pH值代表了对控制溶解ニ氧化碳水平 的努カ的另ー个挑战。因为ニ氧化碳可以与水反应，它可以以四种形式的任ー存在于液相 中ra2、H2C03、HC03-_ CO32-。上文式(1)中的平衡关系表明，在约5.0或以下的pH值下，几乎所有的溶解ニ氧 化碳是じ仏的形式。在约7.0到9.0之间的pH值下，碳酸氧盐是碳的主要形式。最后，在 约ll.O或更高的pH值下，几乎所有的是碳酸盐。由于大多数哺乳动物细胞培养物的pH值 ー般被控制在约pH 7.0到pH 7.4之间，与其中pH值可以更低得多的微生物发酵过程相比 时，ニ氧化碳除去ー般是更困难的。为了从pH约7. O和7. 4之间的细胞培养发酵液除去溶解ニ氧化碳，限制步骤可 以是化学的或物理的。由于仅溶解的ニ氧化碳分子被转运跨越气-液界面，碳酸氧盐必需 重新缔合以形成ニ氧化碳分子。将上文的式(1)分成它的两个部分，注意的是，以下作为式 (3)和(4)列出的逆反应ー般是快速的，而由式(5)代表的反应的第ー部分是慢得多的。
权利要求
1.一种提高哺乳动物细胞培养过程中的产物产量的方法，包括步骤通过经由生物反应器中细胞培养基的顶部表面处的表面气体交换除去溶解的二氧化碳，在整个哺乳动物细胞培养过程的生长期和生产期中将细胞培养基中的溶解二氧化碳维持在小于约10%的溶解二氧化碳浓度的水平下，其中细胞培养基中的重量克分子渗透压浓度在哺乳动物细胞培养过程期间被维持在特定细胞的最佳范围内，细胞培养基的PH值在哺乳动物细胞培养过程期间被维持在特定细胞的最佳范围内。
2.一种提高进料-分批哺乳动物细胞培养过程中的产物产量的方法，包括步骤在具有细胞培养基的生物反应器中接种哺乳动物细胞培养物，所述细胞培养基具有与溶解二氧化碳平衡的指定水平的碳酸氢盐和初始水平的重量克分子渗透压浓度；在哺乳动物细胞培养过程的生长期期间向细胞培养基周期性地添加营养物；在哺乳动物细胞培养过程的生长期或生产期期间向细胞培养基周期性地添加酸或碱来将pH水平维持在所述哺乳动物细胞的指定范围内，而不添加二氧化碳气体；在哺乳动物细胞培养过程的生长期或生产期期间调整生物反应器中细胞培养基的顶部表面上方顶部空间中含氧扫掠气的体积流量，来促进细胞培养基的顶部表面处的表面气体交换；和在生长期或生产期期间调整置于生物反应器中细胞培养基的顶部表面下方的上流式叶轮的转速；其中细胞培养基中溶解二氧化碳通过经由表面气体交换脱除二氧化碳在整个哺乳动物细胞培养过程的生长期或生产期维持在低于约10%的溶解二氧化碳浓度的稳定水平；其中细胞培养基中的重量克分子渗透压浓度在哺乳动物细胞培养过程期间维持在特定细胞的最佳范围内；和其中所述进料-分批哺乳动物细胞培养过程的产物产量被提高。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述溶解二氧化碳的浓度在哺乳动物细胞培养过程的生长期和生产期期间稳定在约3%到10%之间。
4.根据权利要求1或2的方法，其中重量克分子渗透压浓度的最佳范围在进料-分批哺乳动物细胞培养过程的生长期和生产期期间是约300 mOsmo/kg和700 mOsmo/kg之间。
5.根据权利要求1的方法，其中细胞培养基包括在接种期期间的二氧化碳和碳酸氢钠缓冲剂，细胞培养基的PH值在生长期或生产期通过向细胞培养基添加酸或碱来维持，其中避免额外的二氧化碳气体的添加用于PH值调整。
6.根据权利要求1或2的方法，其中哺乳动物细胞培养过程是进料-分批过程，细胞培养基中的重量克分子渗透压浓度在哺乳动物细胞培养过程的生长期期间随着营养物的添加而提高，细胞培养基中的重量克分子渗透压浓度在此后不久降低。
7.根据权利要求1或2的方法，其中细胞培养基的溶解氧的浓度通过生物反应器中细胞培养基的顶部表面处的表面气体交换维持在特定细胞的最佳范围内。
8.根据权利要求7的方法，其中细胞培养基中的溶解二氧化碳的浓度和溶解氧的浓度通过在生长期和生产期期间调整生物反应器中细胞培养基的顶部表面上方顶部空间中含氧的扫掠气的体积流量来维持在最佳范围内。
9.根据权利要求7的方法，其中细胞培养基中的溶解二氧化碳的浓度和溶解氧的浓度通过在生长期和生产期期间调整生物反应器中细胞培养基的顶部表面下方配置的上流式叶轮的转速来维持在最佳范围内。
10.根据权利要求1或2的方法，其中所述哺乳动物细胞培养过程是进料-分批过程， 从生长期的开始到生产期的结尾所述细胞培养基中重量克分子渗透压浓度的提高小于约 300 m0smol/kgo
11.根据权利要求1或2的方法，其中所述细胞培养基的顶部表面基本上没有泡沫。
12.根据权利要求1或2的方法，其中所述细胞培养基中的重量克分子渗透压浓度随着营养物的添加而提高，所述细胞培养基中的重量克分子渗透压浓度在此后不久降低。
13.—种控制进料-分批哺乳动物细胞培养过程中细胞培养基的PH值水平的方法，包括步骤在接种期期间向细胞培养基提供二氧化碳和碳酸氢钠缓冲剂来建立细胞培养基中碳酸氢盐与溶解二氧化碳的指定平衡水平和重量克分子渗透压浓度的初始水平；在进料-分批哺乳动物细胞培养过程的生长期和生产期期间从细胞培养基脱除溶解二氧化碳；在生长期期间和任选地在生产期期间向细胞培养基添加营养物； 在生长期和生产期期间向细胞培养基添加酸或碱来将PH值水平维持在指定范围内， 而不添加二氧化碳气体用于PH值调整；其中细胞培养基中的重量克分子渗透压浓度水平维持在指定范围内，从生长期的开始到生产期的结尾重量克分子渗透压浓度水平的提高小于400 mOsmol/kg ；和其中所述细胞培养基中的溶解二氧化碳的浓度在生长期和生产期期间维持在10%或更低。
14.一种在进料-分批哺乳动物细胞培养过程的生产期期间延长细胞生存力和提高蛋白质产物产量的方法，包括步骤在进料-分批哺乳动物细胞培养过程的生产期期间用水稀释细胞培养基，来降低细胞培养基中废物的毒性影响；在进料-分批哺乳动物细胞培养过程的生产期期间向细胞培养基添加补充的营养物来补偿水的稀释效应；在进料-分批哺乳动物细胞培养过程的生产期期间将细胞培养基中溶解二氧化碳的浓度维持在10%或更低，并将细胞培养基中重量克分子渗透压浓度水平和pH值水平维持在哺乳动物细胞的最佳范围内，其中由于在进料-分批哺乳动物细胞培养过程的生产期期间哺乳动物细胞的延长的细胞生存力蛋白质产物产量被提高。
15.一种改善产自进料-分批哺乳动物细胞培养过程的蛋白质产物的纯度的方法，包括步骤在具有细胞培养基的生物反应器中接种哺乳动物细胞培养物，所述细胞培养基具有与溶解二氧化碳平衡的指定水平的碳酸氢盐和初始水平的重量克分子渗透压浓度；向细胞培养基添加营养物从而提高细胞培养基的重量克分子渗透压浓度水平来加速来自哺乳动物细胞的蛋白质生产；向细胞培养基添加酸或碱来将PH值水平维持在哺乳动物细胞的指定范围内；在整个进料-分批哺乳动物细胞培养过程中从细胞培养基脱除溶解二氧化碳，其中细胞培养基中溶解二氧化碳的浓度维持在10%或更低；其中自重量克分子渗透压浓度的起始水平的重量克分子渗透压浓度水平的提高被限制在小于400 mOsmol/kg ；和在进料-分批哺乳动物细胞培养过程的生长期或早期生产期期间从生物反应器收获蛋白质产物。
16. 一种控制进料-分批哺乳动物细胞培养过程中细胞培养基的重量克分子渗透压浓度水平的方法，包括步骤在接种期期间向细胞培养基提供二氧化碳和碳酸氢钠缓冲剂来建立细胞培养基中碳酸氢盐与溶解二氧化碳的指定平衡水平和重量克分子渗透压浓度的初始水平；在生长期期间向细胞培养基添加营养物，从而提高细胞培养基的重量克分子渗透压浓度水平；在生长期期间向细胞培养基添加酸或碱来将PH值水平维持在指定的范围内； 在进料-分批哺乳动物细胞培养过程的生长期期间从细胞培养基脱除溶解二氧化碳， 其中在生长期期间细胞培养基中的溶解二氧化碳的浓度被维持在10%或更低；其中在生长期的部分期间细胞培养基中重量克分子渗透压浓度水平降低，从生长期的起始到生长期的结尾重量克分子渗透压浓度水平的总体提高小于约300 mOsmol/kg。
全文摘要
提供了控制哺乳动物细胞培养过程中溶解二氧化碳的水平和限制重量克分子渗透压浓度的方法来增强细胞生长、生存力和密度，以及提高生物产物浓度和产量。溶解二氧化碳水平和pH值的这种控制以及产生的限制哺乳动物细胞培养过程中重量克分子渗透压浓度的能力通过在哺乳动物细胞培养过程期间采用可选择的pH值控制策略和CO2脱除技术来实现。这样的pH值控制技术和二氧化碳脱除没有泡沫地、对哺乳动物细胞没有或很小损害地发生。
文档编号C12Q3/00GK102191275SQ201110031048
公开日2011年9月21日 申请日期2011年1月28日 优先权日2010年2月9日
发明者T. Y. 程 A., 古普塔 A., 赫尼克 B., 格林特 N., 周 Y. 申请人:普莱克斯技术有限公司