专利名称：一种基因芯片及其检测方法
技术领域：
本发明涉及检测技术领域，尤其涉及的是一种可以快速检测六种动物源性人兽共患病的基因芯片。
背景技术：
禽流感(Avianinfluenza, Al)、狂犬病(Rabies)、猪链球菌 2 型(Streptococcus
suis H , SS2)、炭疽(Anthrax)、沙门氏菌(Salmonella)、大肠杆菌 0157 (Escherichia
coli 0157)是近年来发生较为普遍、与人们生活息息相关的六种动物源性人兽共患病传染 病，一度给人们的健康和生活带来了很大的危害。其中江苏和四川分别于1998年、2005年发生了 SS2大规模流行的公共卫生事件，并造成人员伤亡，近年来在南方各省每年都有散发的病例；香港和台湾分别于1997年、2004年曾发生高致病性禽流感(HPAI)流行事件，造成数以百万的禽类遭捕杀且有人感染H5N1死亡的报道；狂犬病作为一种古老的疾病，自报道后每年都有散在病例发生，据报道我国是仅次于印度属于世界上第二大狂犬病发病国家；沙门氏菌和大肠杆菌主要通过污染饮水和食物的方式造成群体发病；炭疽芽孢杆菌是食草类动物的一种重要疾病，而人类则可以通过接触感染动物以及感染动物的肉类、毛革制品感染发病。
目前针对以上人兽共患病的传统诊断方法多为病原体的分离培养、生化鉴定、PCR技术、以及相关的血清学实验，以上诊断方法过程繁琐，需时较长且准确性不高，对于多血清型、多亚型的细菌和病毒更不能准确的判定出其类别，PCR技术准确性相对较高但是易出现假阳性以及一次只能鉴别少数几种病原。因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基因芯片及其检测方法，旨在解决现有的诊断病原的方法过程繁琐、需时长且准确性不高的问题。本发明的技术方案如下
一种基因芯片，其中，所述基因芯片的基质膜上固定有6种特异性探针；所述特异性探针分别为禽流感病毒探针、狂犬病病毒探针、猪链球菌2型探针、炭疽菌探针、沙门氏菌探针、大肠杆菌0157探针。所述的基因芯片，其中，所述禽流感病毒探针序列如SEQ NO. I所示；所述狂犬病病毒探针序列如SEQ NO. 2所示；猪链球菌2型探针序列如SEQ NO. 3所示；沙门氏菌探针序列包括3条，分别如SEQ NO. 4 6所示；炭疽芽胞杆菌探针如SEQ NO. 7所示；大肠杆菌0157探针序列包括3条,分别如SEQ NO. 8 10所示。所述的基因芯片，其中，所述特异性探针的5’端标记15-30 Poly T。所述的基因芯片，其中，所述基质膜为硅晶片、玻璃或高分子材料。
上述的基因芯片的制备方法，其中，包括以下步骤
51、在GenBank上分别选取禽流感病毒的Ml基因、狂犬病病毒的NS基因、猪链球菌2型的CPS基因、炭疽芽胞杆菌的CapB基因、沙门氏菌的invA基因和大肠杆菌0157的rfbE基因序列，利用生物信息学软件Primer Express 2. O设计特异性探针；
52、合成特异性探针；
53、使用DR.Fast Spot芯片点样仪系统将特异性探针按照预先设计的矩阵点样，室温干燥IOmin ;每份基因芯片均至少包含一个阳性对照和一个阴性对照；
54、用紫外交联仪照射基因芯片7 10分钟，照射能量为I.2J，以固定特异性探针，最后依次用Milli-Q水和95%乙醇洗涤，干燥。所述的基因芯片的制备方法，其中，所述S2步骤还包括在特异性探针的5’端标记15-30 Poly T，以使特异性探针很好固定在基质膜上。 所述的基因芯片的制备方法，其中，所述阳性对照为多聚PolyT，阴性对照为ddH20。使用上述基因芯片的检测方法，其中，包括以下步骤
51、检测病原特异性引物设计在GenBank上分别选取禽流感病毒的Ml基因、狂犬病病毒的NS基因、猪链球菌2型的CPS基因、炭疽芽胞杆菌的CapB基因、沙门氏菌的invA基因和大肠杆菌0157的rfbE基因序列，利用生物信息学软件Primer Express 2. O设计病原特异性引物；并在病原特异性引物对的上游引物标记生物素biotin ；
52、核酸提取使用DNA/RNA磁珠提取试剂盒提取待测样品的核酸，获取下一步核酸扩增用的模板；
53、进行PCR或RT-PCR扩增根据待测样品的个体和疾病类型，进行不同的检测项目，并选择扩增方法和试剂盒；
54、杂交取S3步骤的PCR或RT-PCR扩增的产物各10 20μ L与200 μ L的DR.杂交缓冲液充分混合，沸水变性6min，迅速转移至冰上IOmin ;将上述混合物转移至基因芯片室内，平铺均匀，避免在底部产生气泡，振动温箱中杂交45-60 min，杂交温度为47°C ;弃去杂交液，用DR.洗涤液洗涤三次；于杂交室中加O. 2 μ L Strep-AP和200 μ L封闭液的混合液，室温反应30min，弃去封闭液，以DR.洗涤液重复洗涤三次，吸除芯片上残留的水分；
55、显色每个基因芯片室加4μL他17^(1 和196 4 1^ DR.检测液的混合液，将芯片置于暗室中反应5-10min，弃去检测液，用水冲洗至杂交点清晰为止；
56、读取结果利用芯片反应仪扫描读取结果。所述的基因芯片的检测方法，其中，所述S3步骤中，猪链球菌2型、炭疽菌、大肠杆菌0157、沙门氏菌，使用TaKaRa PCR Amplification试剂盒，按照试剂盒上的步骤进行 PCR 扩增，反应条件为 94°C 3min,94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 40s, 72°C 10min，35 个循环；禽流感病毒、狂犬病毒，使用TaKaRa One Step RT-PCR试剂盒，按照试剂盒上的步骤进行 RT-PCR 扩增，反应条件分别为 50°C 30min,94°C 3min,94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 40s,72°C 10min，35 个循环。本发明的有益效果本发明基因芯片可以特异性检测禽流感病毒、狂犬病毒、猪链球菌2型、炭疽芽胞杆菌、沙门氏菌和大肠杆菌0157六种病原。通过应用于实践口岸检疫，本发明所建立的基因芯片方法可以快速、精确、特异性的检测上述六种动物源性人兽共患病，尤其对于大批量检疫的出入境检验检疫部门意义显得尤为突出。
图I是本发明实施例I中使用本发明基因芯片的检测结果图。图2是本发明实施例2中使用本发明基因芯片的检测结果图。图3是实施例2中使用电泳检测PCR产物的结果图。图4是本发明实施例3中使用本发明基因芯片的检测结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。基因芯片技术是九十年代建立的一种全新的分析检测技术，是随着人类基因组计划的开展而逐步发展起来的。该技术综合运用了分子生物学技术、集成电路制造技术、计算机技术、半导体技术、共聚焦激光扫描技术、荧光标记技术，使样品的检测具有敏感性高、特异性强、大规模集成化、自动化、操作简便、快速，高效率等优点。目前已广泛应用于基因表达谱分析、新基因发现、基因突变及多态性分析、疾病诊断和预测、药物筛选、基因测序等领域。本发明的目的是提供一种用于检测包括禽流感、狂犬病、猪链球菌2型、炭疽、沙门氏菌、大肠杆菌0157等六种动物源性人兽共患病的基因芯片及其制造方法和使用方法。本发明中所提供的基因芯片及检测方法经初步应用于口岸检疫，发现可以快速、精确、特异性的检测上述六种病原体。本发明中基因芯片分别选取禽流感病毒的Ml基因、狂犬病病毒的NS基因、猪链球菌2型的CPS基因、炭疽芽胞杆菌的CapB基因、沙门氏菌的invA基因和大肠杆菌0157的rfbE基因序列,利用生物信息学软件Primer Express 2. O设计特异性探针,探针序列如SEQ NO. Γ10 所示。禽流感病毒探针AIV P 序列为 27T-TCAAAGCCGAGATCGCGCA GAGA。狂犬病病毒探针RV P 序列为 25T-TCAGCAATCAGAGTGGGCA CAGTTG。猪链球菌2 型探针 SS2 P 序列为 26T-CAATGTTGCCGTCAACAATAT CATCAGA。沙门氏菌探针序列包括3条Sa Pl序列为15T-CTGTTTACCG GGCATACCAT ；Sa P2序列为 15 T-AATACCGGCCTTCAAATCGG ；Sa P3 序列为 15 T-TTCCCTTTCCAGTACGCTTC。炭疽芽胞杆菌探针An P 序列为 28T-TCGGTGAGCAACGCAGGGT AGTTAA。大肠杆菌0157探针序列包括3条015 Pl序列为15T-CAACCATTCC ACCTTCACCT ；0157 P2 序列为 15T-GTGACMCCATTCCACCTTC ；0157 P3序列为 15T-TGTACAGCTAATCCTTGGCC。本发明基因芯片的制备方法的具体步骤如下
SI、设计检测病原的特异性探针在GenBank上分别选取禽流感病毒的Ml基因、狂犬病病毒的NS基因、猪链球菌2型的CPS基因、炭疽芽胞杆菌的CapB基因、沙门氏菌的invA基因和大肠杆菌0157的rfbE基因序列，利用生物信息学软件Primer Express 2. O设计特异性探针；52、特异性探针合成由上海超世生物科技公司合成；
53、特异性探针处理在特异性探针的5’端标记15-30Poly T，以使特异性探针很好固定在基质I旲上；基质I旲的材料可以为娃晶片，玻璃或闻分子；
54、点样将所得特异性探针分别溶于2x探针稀释液中，混匀后，使用DR.Fast Spot芯片点样仪系统将特异性探针按照预先设计的矩阵点样，室温干燥IOmin ;每份基因芯片均至少包含一个阳性对照和一个阴性对照；其中，阳性对照为多聚PolyT，阴性对照为ddH20 ；
55、固定紫外交联仪固定(254nm，I.2J) 7 10分钟，依次用Milli-Q水(由Milli-Q超纯水系统处理得到的超纯水)和95%乙醇洗涤，干燥。
本发明基因芯片的检测方法的具体步骤如下
SI、PCR 扩增
(1)检测病原特异性引物设计在GenBank上分别选取禽流感病毒的Ml基因、狂犬病病毒的NS基因、猪链球菌2型的CPS基因、炭疽芽胞杆菌的CapB基因、沙门氏菌的invA基因和大肠杆菌0157的rfbE基因序列，利用生物信息学软件Primer Express 2. O设计特异性引物；其中每种病原对应引物对的上游引物标记生物素biotin ；
(2)核酸提取采取DNA/RNA磁珠提取试剂盒对采取的样品提取核酸，获取下一步核酸扩增用模板；
(3)PCR和RT-PCR扩增根据待测样品的个体和疾病类型，进行不同的检测项目，并选择扩增方法和试剂盒。猪链球菌2型、炭疽菌、大肠杆菌0157、沙门氏菌，使用TaKaRa PCRAmplification试剂盒,按照试剂盒上的步骤进行PCR扩增，反应条件为94°C 3min,94°C30s, 55°C 30s，72°C 40s, 72°C lOmin，35 个循环；禽流感病毒、狂犬病毒，使用 TaKaRa OneStep RT-PCR试剂盒，按照试剂盒上的步骤进行RT-PCR扩增，反应条件分别为50°C 30min,94°C 3min,94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 40s, 72°C 10min，35 个循环。S2、杂交待测样品核酸的PCR产物各10 20 μ L与200 μ L的DR.杂交缓冲液(DR.为台湾晶宇公司所开发的诊断性生物芯片一种产品系列简称)充分混合，沸水变性6min，迅速转移至冰上IOmin ;将上述混合物转移至芯片室内，平铺均匀，避免在底部产生气泡，振动温箱中杂交45-60 min，杂交温度为47°C;弃去杂交液，用DR.洗涤液洗涤三次；于杂交室中加0. 2 μ L Strep-AP和200 μ L封闭液的混合液，室温反应30min，弃去封闭液，以DR.洗涤液重复洗涤三次，吸除芯片上残留的水分；
53、显色每个芯片室加4μ L他17^(1 和196 4 1^ DR.检测液的混合液，将芯片置于暗室中反应5-10min，弃去检测液，用水冲洗至杂交点清晰为止；
54、读取结果利用芯片反应仪扫描读取结果。在以下实施例中，本发明基因芯片中的探针的点样矩阵如表I所示。其中，点A为阳性对照，点B为阴性对照。
权利要求
1.一种基因芯片，其特征在于，所述基因芯片的基质膜上固定有6种特异性探针；所述特异性探针分别为禽流感病毒探针、狂犬病病毒探针、猪链球菌2型探针、炭疽菌探针、沙门氏菌探针、大肠杆菌0157探针。
2.根据权利要求I所述的基因芯片，其特征在于，所述禽流感病毒探针序列如SEQNO. I所示；所述狂犬病病毒探针序列如SEQ NO. 2所示；猪链球菌2型探针序列如AEQ NO. 3所示；沙门氏菌探针序列包括3条,分别如SEQ NO. 4 6所示；炭疽芽胞杆菌探针如SEQ NO. 7所示；大肠杆菌0157探针序列包括3条,分别如SEQ NO. 8 10所示。
3.根据权利要求I所述的基因芯片，其特征在于，所述特异性探针的5’端标记15-30Poly T0
4.根据权利要求I所示的基因芯片，其特征在于，所述基质膜为硅晶片、玻璃或高分子。
5.一种如权利要求I所述的基因芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 S1、在GenBank上分别选取禽流感病毒的Ml基因、狂犬病病毒的NS基因、猪链球菌2型的CPS基因、炭疽芽胞杆菌的CapB基因、沙门氏菌的invA基因和大肠杆菌0157的rfbE基因序列，利用生物信息学软件Primer Express 2. O设计特异性探针； S2、合成特异性探针； S3、使用DR.Fast Spot芯片点样仪系统将特异性探针按照预先设计的矩阵点样，室温干燥IOmin ;每份基因芯片均至少包含一个阳性对照和一个阴性对照； S4、用紫外交联仪照射基因芯片7 10分钟，照射能量为I.2J，以固定特异性探针，最后依次用Milli-Q水和95%乙醇洗涤，干燥。
6.根据权利要求5所述的基因芯片的制备方法，其特征在于，所述S2步骤还包括在特异性探针的5’端标记15-30 Poly T，以使特异性探针很好固定在基质膜上。
7.根据权利要求5所述的基因芯片的制备方法，其特征在于，所述阳性对照为多聚PolyT,阴性对照为ddH20。
8.一种使用如权利要求I所述的基因芯片的检测方法，其特征在于，包括以下步骤 S1、检测病原特异性引物设计在GenBank上分别选取禽流感病毒的Ml基因、狂犬病病毒的NS基因、猪链球菌2型的CPS基因、炭疽芽胞杆菌的CapB基因、沙门氏菌的invA基因和大肠杆菌0157的rfbE基因序列，利用生物信息学软件Primer Express 2. O设计病原特异性引物；并在病原特异性引物对的上游引物标记生物素biotin ； S2、核酸提取使用DNA/RNA磁珠提取试剂盒提取待测样品的核酸，获取下一步核酸扩增用的模板； S3、进行PCR或RT-PCR扩增根据待测样品的个体和疾病类型，进行不同的检测项目，并选择扩增方法和试剂盒； S4、杂交取S3步骤的PCR或RT-PCR扩增的产物各10 20μ L与200 μ L的DR.杂交缓冲液充分混合，沸水变性6min，迅速转移至冰上IOmin ;将上述混合物转移至基因芯片室内，平铺均匀，避免在底部产生气泡，振动温箱中杂交45-60 min，杂交温度为47°C ;弃去杂交液，用DR.洗涤液洗涤三次；于杂交室中加O. 2 μ L Strep-AP和200 μ L封闭液的混合液，室温反应30min，弃去封闭液，以DR.洗涤液重复洗涤三次，吸除芯片上残留的水分； S5、显色每个基因芯片室加4μ L他17^(1 和196 4 1^ DR.检测液的混合液，将芯片置于暗室中反应5-10min，弃去检测液，用水冲洗至杂交点清晰为止； S6、读取结果利用芯片反应仪扫描读取结果。
9.根据权利要求8所述的基因芯片的检测方法，其特征在于，所述S3步骤中，猪链球菌2型、炭疽菌、大肠杆菌0157、沙门氏菌，使用TaKaRa PCR Amplification试剂盒，按照试剂盒上的步骤进行PCR扩增，反应条件为94°C 3min，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 40s, 72°ClOmin，35个循环；禽流感病毒、狂犬病毒，使用TaKaRa One Step RT-PCR试剂盒，按照试剂盒上的步骤进行RT-PCR扩增，反应条件分别为50°C 30min,94°C 3min，94°C 30s, 55°C30s, 72°C 40s, 72°C 10min，35 个循环。
全文摘要
本发明公开了一种基因芯片及其检测方法，本发明利用分子生物学技术建立了一种可以快速检测六种动物源性人兽共患病的基因芯片方法，它是在芯片固相载体基质膜上固定特异性的探针，这些探针可以特异性检测禽流感病毒、狂犬病毒、猪链球菌2型、炭疽芽胞杆菌、沙门氏菌和大肠杆菌O157六种病原。通过应用于实践口岸检疫，本发明所建立的基因芯片方法可以快速、精确、特异性的检测上述六种动物源性人兽共患病，尤其对于大批量检疫的出入境检验检疫部门意义显得尤为突出。
文档编号C12Q1/68GK102703577SQ201110030868
公开日2012年10月3日 申请日期2011年1月28日 优先权日2011年1月28日
发明者徐海聂, 王振全, 罗宝正, 薄清如 申请人:珠海出入境检验检疫局检验检疫技术中心