专利名称：蝴蝶兰成花相关基因<i>PRP39</i>的编码序列及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学、基因工程及植物生理学等领域，具体涉及一种在蝴蝶兰中表达的成花相关基因的克隆，包括此基因序列的分析，基因表达模式的分析，目的基因表达载体的构建，植物转化，转基因植株的获得以及相应的生理特性的鉴定。
背景技术：
蝴蝶兰作为一种具有较好经济价值和观赏价值的花卉深受国内外消费者的喜爱， 但其成花需要电力降温或高山催花，这就大大提高了其生产成本。因此，很多学者就尝试通过基因工程手段调控蝴蝶兰花期，以降低生产成本。韩颖颖等(2004、2005)在蝴蝶兰花瓣中得到了查尔酮合酶CDNA(^As)，并成功转化烟草证明其参与花的形态建成。^iang等 (2010) Phalaenopsis hybrida (cv. wedding promenade)中成功分离得到
LEAFY (FL0/LFY)的同源基因/^？汉/^，通过半定量RT-PCR得出/^^Z/T是蝴蝶兰成花的关键基因。转基因方面的研究也取得了一定的进展，Belarmino等(2000)首先成功报道了用农杆菌介导的方法开展蝴蝶兰转基因；Mishits等Q005)用未成熟的圆球茎与农杆菌(包含gus和潮霉素抗性基因)共培养，在筛选培养基上(含20mg/L的潮霉素)PLB再生获得蝴蝶兰抗潮霉素的抗性植株；Qin等(2010)用叶片诱导出的愈伤组织与含有抗冷基因ZTP的农杆菌共培养，得到了大量的抗冷蝴蝶兰转基因植株。但是，有关蝴蝶兰基因的研究还尚未见报道。本发明研究了一种从蝴蝶兰中克隆出来的与成花相关的基因，转入拟南芥后引起花期推迟。而在本发明公布之前尚未有公开或报道过本发明申请中提及的蝴蝶兰 PRP39基因的核苷酸序列及其在转基因植株中的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从蝴蝶兰中克隆出来的与成花相关的基因，以及利用该基因在调控植物花期上的应用。本发明一方面提供了一个新的蝴蝶兰基因该基因与蝴蝶兰的成花有关。 编码区全长^45bp，包含一个M72bp的开放阅读框，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。本发明的另一方面提供了上述基因编码的蛋白质分子，该蛋白质分子具有 SEQ ID NO. 2所示的氨基酸编码序列。本发明还提供了用于调取获得蝴蝶兰样品中PRP39基因的核苷酸弓I物序列，根据基因保守区设计了一系列的RACE引物和RT-PCR引物，具体引物序列如SEQ ID NO. 3所示。本发明还提供了一种利用转基因技术将蝴蝶兰基因的核苷酸编码序列SEQ IDN0. 1转入拟南芥以改变开花时间的方法，具体步骤如下
(1)将蝴蝶兰基因的开放阅读框连接入植物表达载体，形成含有蝴蝶兰PRP39基因的植物表达载体；
(2 )将步骤(1)中的表达载体转入农杆菌，用含有表达载体的农杆菌菌液浸泡拟南芥花序30s，黑暗培养过夜，第二天正常培养，约2周后收集转基因种子；
(3)通过对拟南芥种子抗生素筛选，PCR鉴定，获得再生转基因植株，开花时间比野生型拟南芥推迟。本发明还提供了一种用于检测样品中是否存在蝴蝶兰PRP39基因的核苷酸序列 SEQ ID NO. 1的方法，使用SEQ ID NO. 4的核苷酸序列对转基因拟南芥DNA进行PCR扩增， 然后电泳检测目的片段的有无。附图内容
图1为以蝴蝶兰的花梗为材料提取的总RNA，含有较多杂质。图2为用DNase I消化后的结果，RNA的纯度明显提高。图3为3’ RACE扩增结果，由于基因本身局部有很多A，扩增出多条条带，割取最上面的那条回收，约1500bp，连接转化，克隆测序可得到正确的序列。图4为5’ RACE扩增结果，长约1200bp。图5为基因最大的开放阅读框，长约2500bp。图6为转基因植株PRP39基因是否表达的检测结果。
具体实施例方式下面结合具体实施实例进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件， 如Sambrook. J.等主编的《分子克隆实验指南》中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1
蝴蝶兰PRP39基因的克隆
1.以蝴蝶兰itoritemoAsh ‘Tinny Tender’为实验材料，植物材料在光照培养箱内正常生长(L/D :16h/8h,25°C /19°C)。2.总 RNA 提取
(1)取蝴蝶兰的花梗IOOmg左右，液氮充分研磨。(2)将粉末移入装有Iml Trizol Reagent (购自hvitrogen公司)的离心管，涡旋混勻，室温静置5min。(3)加入0. 2ml氯仿，剧烈振荡lmin，然后继续用力振荡lOmin，4°C，12000rpm离心 IOmin0(4)取上清，加等体积饱和酚(pH4. 5)，混勻，室温静置5min，4°C，12000rpm离心 IOmin0(5)取上清，加等体积氯仿异戊醇(对1)，混勻，室温静置5min,4°C,12000rpm 离心IOmin0(6)取上清，加等体积异丙醇，混勻，_70°C静置20min，4°C，12000rpm离心lOmin。(7)弃上清，加约Iml 75%酒精，温和震荡离心管，悬浮沉淀，4°C，7500rpm离心 5min。
(8)弃上清，将沉淀风干，加入50 μ 1 DEPC H2O溶解总RNA，测浓度，电泳检测。3. DNA 消化
用DNase I (购自TaKaRa公司)去除总RNA中的基因组DNA，方法参照试剂说明书进行。4.反转录
采用MMLV反转录酶(购自Clontech公司)逆转录mRNA成cDNA第一链，方法按照实际说明书进行。5.基因克隆 (1)3，RACE
根据建立的cDNA文库中的已知片段设计上游特异性引物，以AP为引物反转录出的 cDNA为模板，依次使用3GSP1/AUAP和3GSP2/AUAP进行巢式PCR扩增，然后将扩增出的目的片段割胶回收，连接转化，克隆，测序。具体引物序列见SEQ ID NO. 3。(2) 5，RACE
根据已知片段设计反转录特异性引物和下游引物，使用5GSP1/AAP进行第一轮PCR扩增，使用5GSP2/AUAP进行第二轮扩增，然后将扩增出的目的片段割胶回收，连接转化，克隆，测序。具体引物序列见SEQ ID NO. 3。(3)序列拼接
根据得到的3’序列和5’序列，利用DNAMAN软件进行拼接，得到基因的序列全长。实施例2
蝴蝶兰基因表达载体的构建
1.根据所得的基因全长，利用DNAMar软件查找基因的开放阅读框，以最大的开放阅读框作为目的片段构建表达载体。2.根据查找到的开放阅读框设计特异性引物，利用高保真酶I^rimeSTAR HS DNA Polymerase (购自TaKaRa公司)进行扩增，然后将扩增出的目的片段割胶回收，连接入 PMD20-T载体，转化，挑取阳性克隆，送3个样测序，比对测序结果直至3个序列完全一致。3.提取目的基因质粒，选用Xba I和Kpn I双酶切pMD20_目的基因重组质粒， pCAMBIA-1301质粒也采用相同的内切酶双酶切，使用T4DNA连接酶(购自NEB公司)将目的基因与pCAMBIA-1301连接，得到表达载体pCAMBIA-1301-目的基因，将其转化至DH5 α，挑选单克隆，摇菌提取质粒，用相同的内切酶鉴定该重组质粒。4.将检测正确的重组质粒pCAMBIA-1301-目的基因电转化至农杆菌GV3101感受态细胞，挑选单克隆，摇菌提取质粒，将质粒重新转化至DH5 〃中，再重新提取质粒，酶切检测。挑选检测正确的菌液加甘油保存至70°C冰箱，以备转化拟南芥。实施例3 浸花法转化拟南芥
1.种植拟南芥。培养条件为温度，湿度60%-80%，光照强度7000-9000LX，光照16h， 黑暗8h。2.转化菌液的培养。将转化了表达载体的农杆菌菌种划线活化，28°C培养2天， 挑选单克隆振荡培养1-2天，离心收集菌体，倒掉上清，加入70-80mL的转化介质，悬浮农杆菌。
3.转化拟南芥。选取开花初期的拟南芥，将拟南芥所有的花序都浸入含有农杆菌的转化介质中30s，将植株放在黑暗中过夜，第二天转移至正常条件下继续培养约2周后种子成熟，收集转基因种子。实施例4
转基因种子的筛选、种植及检测
1.配制含有终浓度为50mg/L潮霉素的1/2MS固体培养基，将转基因种子均勻的洒在培养基上，培养皿加盖。同时，将野生型拟南芥种子撒播在另一个不含潮霉素培养皿中，作为对照。2.将两种培养皿用锡纸包好，4°C避光保存3天。3. 3天后拆掉撒有野生型拟南芥的培养皿锡纸，并将其放置在培养室正常培养，而撒有转基因种子的培养皿不拆掉锡纸，也放置在培养室培养，培养48小时后将锡纸去掉， 恢复正常培养。4.待拟南芥长出真叶后，用镊子小心的将其移植到基质中继续培养。5.野生型拟南芥和转基因拟南芥以相同的培养条件培养，观察野生型拟南芥和转基因拟南芥的生长及开花情况。6.待两组拟南芥开花后取适量叶片，提取组织DNA，进行PCR扩增检测目的基因是否正常表达。
权利要求
1.一种蝴蝶兰成花相关的基因，其特征在于为具有特定序列的DNA分子，长 2945bp，具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。
2.一种如权利要求1所述的基因编码的蛋白质分子，其特征在于具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸编码序列。
3.用于调取获得蝴蝶兰样品中基因的核苷酸引物序列，其特征在于如权利要求 1所述的基因保守区设计的一系列的RACE引物和RT-PCR引物，具体引物序列如SEQ ID NO. 3 所示。
4.一种如权利要求1所述的蝴蝶兰基因的核苷酸编码序列SEQ ID NO. 1转入拟南芥以改变开花时间的方法，其特征在于(1)将蝴蝶兰基因的开放阅读框连接入植物表达载体，形成含有蝴蝶兰基因的植物表达载体；(2)将(1)中的表达载体转入农杆菌，用含有表达载体的农杆菌菌液浸泡拟南芥花序， 收集转基因种子；(3)通过对拟南芥种子抗生素筛选，PCR鉴定，获得再生转基因植株，开花时间比野生型拟南芥推迟。
5.一种用于检测样品中是否存在如权利要求1所述的蝴蝶兰基因的核苷酸序列 SEQ ID NO. 1的方法，其特征在于使用SEQ ID NO. 4的核苷酸序列对转基因拟南芥DNA进行 PCR扩增，然后电泳检测目的片段的有无。
全文摘要
本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体为一种在蝴蝶兰中表达的花发育相关基因PRP39的编码序列及其在调控植物花期上的应用。本发明涉及包含上述基因的重组植物表达载体及应用此载体转化获得的转基因植物。应用本发明涉及基因在植物中转化表达，可对转基因植物的开花时间起到一定的推迟作用。
文档编号C12Q1/68GK102174528SQ201110030959
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月28日 优先权日2011年1月28日
发明者周明兵, 孙小明, 崔永一, 张迟, 秦巧平 申请人:浙江农林大学