一种结核感染细胞免疫检测抗原组合物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种结核感染特异T细胞免疫检测抗原及其应用。具体地说就是一种 结核分枝杆菌抗原及其表位肽组合物，用于结核感染细胞免疫检测，属于结核病检测领域。
【背景技术】
[0002] 结核病是由结核分枝杆菌感染引起的人畜共患的慢性传染病。根据世界卫生组织 的统计，目前全球有超过1/3的人口感染了结核分枝杆菌，每年有200万人因结核病死亡。 我国是全球22个结核病流行严重的国家之一、同时也是全球27个耐多药结核病流行严重 的国家之一。我国第五次结核病流行病学抽样调查报告显示，中国结核病年新发病人数约 为130万，占全球发病人数的14. 3%，位居全球第二位；15岁及以上人群肺结核的患病率为 459/10万。结核分枝杆菌除感染人外，还感染50多种哺乳动物和20多种禽类；易感性因 动物种类和个体不同而异，家畜中牛是最敏感动物。结核病的流行不仅影响养殖业的发展， 更重要的是由于交叉感染，而使人类的健康受到严重威胁。因此，结核病已经成为一个严重 的社会经济问题，对我国公民健康、社会安定和经济发展带来严重的危害。
[0003] 结核病的早期诊断对结核病的控制至关重要，而结核病防治的最大挑战之一就是 缺乏早期、快速、敏感和特异的诊断工具。目前所采用的结核感染的诊断方法仍然存在着较 大的局限性。经典的结核菌素试验（TST)用于结核病诊断虽然已达一个世纪，但其受卡介 苗接种和大多数非结核分枝杆菌感染的干扰，特异性和敏感性均不理想；细菌学培养作为 诊断的金标准用于结核病也存在着培养周期过长、阳性率较低、且依赖于标本采集质量等 问题；而影像学、血清学等方法，因为较高的假阴性或假阳性，用于结核病诊断的参考价值 受限。现有结核病检测试剂灵敏度、特异度均有待提高。
[0004] 抗结核病的保护性免疫机制目前仍不完全清楚，细胞免疫尤其是循环及感染部 位的T淋巴细胞应答被认为起着重要作用。因此能否有效地激发机体的T细胞，尤其是 CD4+T细胞免疫反应是机体成功对抗结核感染的关键。被病原菌致敏的T淋巴细胞，再次 受到同种抗原刺激后会释放y干扰素，高水平的y干扰素反应可以提示该病原菌的感 染。近年来，随着免疫学和基因组学的发展，出现了以T细胞为基础的体外 Y干扰素反 应测定法（IGRA)，可用于结核病辅助诊断和结核感染筛查。目前已经有以结核分枝杆菌 基因组RD1区编码的结核特异性抗原ESAT-6和CFP-10为刺激物的商品化IGRA试剂，如 QuantiFERON-TB Gold test和T-SPOT. TBtest，用于检测外周血中结核特异性释放y干扰 素的T淋巴细胞，呈现较高的灵敏性和特异性。
[0005] 抗原表位是多肽抗原的一部分，是抗原性的核心基础；抗原通过抗原表位与相应 的淋巴细胞表面受体结合从而致敏淋巴细胞、引起免疫应答，即免疫反应的特异性是针对 抗原表位，而不是针对整个抗原，抗原表位在抗原诱导免疫应答的过程中起着决定性作用。
[0006] 基于T细胞分泌Y干扰素的体外检测技术，主要以完整抗原作为相应的刺激源， 抗原成分组成较为复杂、灵敏度和特异性有待提高，且相应试剂由于国外公司的专利保护， 使得我国在引进相关产品应用时成本较高，不适合目前情况下在我国大范围应用。本发明 是在国家传染病重大专项资助下，对结核菌蛋白抗原及其表位充分分析、验证和比较研宄 的基础上产生，拥有完全的自主知识产权，基于本发明的检测试剂可广泛用于结核病的辅 助诊断、流行病学监测与感染筛查等相关领域。
【发明内容】
[0007] 本发明在现有的T细胞y干扰素释放试验技术的基础上，应用RD1区基因 Rv3873、Rv3874、Rv3875所编码的Rv3873抗原、CFP-10抗原、ESAT-6抗原和/或其各自所 包含的抗原表位肽，形成一个抗原组合物，并结合ELISA方法对结核病例和健康志愿者体 内结核特异性T细胞进行检测，从而评价该抗原组合物用于结核检测的灵敏度和特异性。
[0008] RV3873基因作为分枝杆菌核心基因组中的基因在分枝杆菌属中高度保守，其表 达产物具有较高的T细胞免疫原性；Rv3874、Rv3875基因的表达产物CFP-10和ESAT-6属 于ESAT-6蛋白家族，均具有较强的免疫原性，是重要的结核分枝杆菌免疫保护性抗原；且 Rv3873、CFP-10、ESAT-6抗原均存在于大多数分枝杆菌尤其是致病性结核分枝杆菌中，而卡 介苗（BCG)及绝大多数环境分枝杆菌均缺失此类抗原。本发明在现有检测试剂常用抗原 ESAT-6和CFP-10的基础上，发现Rv3873抗原亦可用于结核感染特异性检测，且使用相应的 抗原表位肽替代完整的多肽抗原作为检测标志物，提供了一种包括3种抗原衍生的表位肽 库组合物，并与这3种抗原分别组成的单抗原衍生表位肽库或至少2种抗原组成的衍生表 位肽库在结核病例及健康志愿者中的反应情况进行比较。
[0009] 本发明的第一方面提供了一种用于结核感染细胞免疫检测抗原组合物，由以下至 少1组抗原，优选至少2组抗原，最优选全部3组抗原组成：
[0010] (1)结核分枝杆菌CFP-10抗原和/或其包含的一种或多种抗原表位肽；
[0011] (2)结核分枝杆菌ESAT-6抗原和/或其包含的一种或多种抗原表位肽；
[0012] (3)结核分枝杆菌RV3873抗原和/或其包含的一种或多种抗原表位肽。
[0013] 所述结核分枝杆菌CFP-10抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0014] 所述结核分枝杆菌ESAT-6抗原的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。
[0015] 所述结核分枝杆菌Rv3873抗原的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。
[0016] 所述结核分枝杆菌CFP-10抗原包含的抗原表位肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:4 ~59。
[0017] 所述结核分枝杆菌ESAT-6抗原包含的抗原表位肽的氨基酸序列选自SEQID N0:60 ~122〇
[0018] 所述结核分枝杆菌Rv3873抗原包含的抗原表位肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO: 123 ~180。
[0019] 在一个特定的实施方案中，上述抗原组合物由以下至少1组抗原，优选至少2组抗 原，最优选全部3组抗原组成：
[0020] (1)结核分枝杆菌CFP-10抗原和其包含的全部抗原表位肽；
[0021] (2)结核分枝杆菌ESAT-6抗原和其包含的全部抗原表位肽；
[0022] (3)结核分枝杆菌Rv3873抗原和其包含的全部抗原表位肽。
[0023] 在另一个特定的实施方案中，上述抗原组合物由以下至少1组抗原，优选至少2组 抗原，最优选全部3组抗原组成：
[0024] (1)结核分枝杆菌CFP-10抗原包含的全部抗原表位肽；
[0025] (2)结核分枝杆菌ESAT-6抗原包含的全部抗原表位肽；
[0026] (3)结核分枝杆菌Rv3873抗原包含的全部抗原表位肽。
[0027] 抗原组合物中的表位肽可以是上述表位肽的氨基酸序列经过取代、缺失或添加1 个氨基酸或几个氨基酸且具有相同抗原性的衍生表位肽或其类似物。
[0028] 在最优选的实施方案中，所述抗原组合物由氨基酸序列为SEQ ID NO. 4~180的 表位肽组成。
[0029] 本发明还提供了编码所述抗原组合物的DNA分子，以及含有该DNA分子的重组表 达载体、表达盒、转基因细胞系和重组菌。
[0030] 本发明的第二方面提供了所述抗原组合物在制备用于体外检测结核感染引起的 特异性T细胞免疫反应的检测试剂中的应用，其特征在于人或动物的淋巴细胞经过所述抗 原组合物的刺激后，检测结核特异性T细胞分泌的细胞因子。
[0031] 在特定的实施方案中，所述结核特异性T细胞分泌的细胞因子选自y干扰素 (IFN-Y)、白细胞介素2(IL_2)和肿瘤坏死因子a (TNF-a)，优选IFN-Y;所述结核特异 性T细胞分泌的细胞因子的检测方法选自酶联免疫斑点试验（ELISP0T)、酶联免疫吸附试 验（ELISA)、免疫层析试验、细胞因子内染色和T细胞增殖试验，优选ELISA;所述淋巴细胞 来源于外周血、脑脊液、胸水或腹水，优选外周血。
[0032] 本发明还提供了所述抗原组合物在制备结核检测试剂中的应用，并提供了一种结 核检测试剂盒，其基本组成如下：
[0033] 本