专利名称：一种仙台病毒抗原肽及其在仙台病毒感染检测中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种仙台病毒抗原肽及其在仙台病毒感染检测中的应用。
背景技术：
仙台病毒(Sandaivirus)属于副粘病毒科副粘病毒亚科、呼吸道病毒属病毒,为单股负链RNA病毒，是一种实验啮齿类常见和高发的感染性副流感病毒，是引起啮齿类动物呼吸系统疾病的主要病原，小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠等啮齿类实验动物均易感。仙台病毒多数情况下无明显临床表现，但会对实验动物的免疫系统产生影响，在合并其他细菌性病原体的感染后造成致死性的影响，是啮齿类实验动物必须排查的病原体，其传染性强，容易扩散，在多数情况下呈隐性感染，可影响幼鼠发育成长和降低成年鼠的繁殖率，改变体内细胞免疫反应，且很难从鼠群中清除。1953年在日本仙台的一次新生儿肺炎流行中首次分离出，又名Hemagglutinating virus of Japan(HVJ),即Fushimi株。由于许多特性与流感不同，以后又陆续分离到其他毒株，故命名为副流感病毒。仙台病毒几乎可凝集所有种类的红血球，而且有溶血性。其表面具有血凝素和溶血素，溶血素有溶细胞作用，能溶解某些动物的红细胞，与病毒的感染性有关，血凝素则能凝集某些哺乳类和禽类的红细胞。仙台病毒感染可侵犯呼吸道的表层组织，在上皮细胞中增殖，所致的免疫反应不牢固易再次感染，成人中通常引起轻型呼吸道感染，而5岁以下儿童发病率高、病情重，表现为急性阻塞性喉-支气管-气管炎和肺炎。由于仙台病毒不仅感染动物，而且还会导致儿童患严重的呼吸道疾病，所以开发一种能够及时的、准确的检测仙台病毒感染的产品，对动物和人类的健康具有重要意义。
目前的检测多采用血清学的方法包括ELISA、IFA以及血凝抑制实验等。这些血清学的检测方法比较经典，在实际应用中却存在一些问题，而最为主要的是血清学检测使用的抗原质量的稳定性和适用性。在血清学检测中最为关键的因素是抗原的质量。抗原的特异性和代表性，抗原的免疫原性和抗原性，这些因素均会影响到最终对血清学检测结果的判定。近年来随着多肽展示技术的应用，已经针对许多病原体的特异抗原表位进行了相关分析，也找到了一些有用的多肽表位，有些在微生物检测中也得到了应用。使用的线性表位多肽库，虽然不能包含天然空间构象表位，但是仍有许多线性表位具有良好的抗原性，多个抗原表位的组合可以很好的满足血清学检测的需要。在目前的国家标准推荐的检测方法中使用病毒全颗粒作为抗原物质来检测实验动物血清中可能存在的抗体。但是由于病毒全颗粒在实验室的扩增培养以及分离纯化等过程中存在着许多的变量，包括病原体本身的变异、每次生产病毒可能掺入的非特异性抗原成分等，这些因素均会影响到抗原的稳定性。虽然病毒全颗粒保证了全部抗原位点的存在，但是抗原暴露的不同方式也会影响到抗原表位的展示最后影响检测工作的结果。而且病毒全颗粒抗原会和其他病原体的产生交叉抗原最终影响检测的准确性。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种仙台病毒抗原肽及其在仙台病毒感染检测中的应用，本发明提供的仙台病毒抗原肽提高了多肽组合的特异性和针对性，因此可提高实验动物微生物检测的准确性。本发明提供了一种仙台病毒抗原肽，具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。本发明还提供了一种仙台病毒抗原肽，具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的氨基酸序列。优选地，本发明提供的仙台病毒抗原肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的同源性大于85%。本发明提供的抗原肽是仙台病毒的优势抗原表位，且分子量较小，因此降低了与其他分子发生交叉反应的可能，提高了多肽组合的特异性和针对性，从而提高了对仙台病毒感染检测的准确率。本发明提供了一种编码SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的DNA分子，具有如SEQ IDN0:2所示的核苷酸序列。本发明还提供了一种仙台病毒疫苗，包括本发明提供的仙台病毒抗原肽及药学上可接受的辅料。本发明提供的仙台病毒疫苗中抗原肽为具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的氨基酸序列。优选地，本发明提供给的仙台病毒疫苗的剂型为口服制剂或注射剂。
由于本发明提供的抗原肽是仙台病毒的优势抗原表位，所以在制备疫苗时，可减少仙台病毒对动物的危害。本发明提供的仙台病毒抗原肽在仙台病毒感染检测中的应用。本发明提供的仙台病毒疫苗中抗原肽为具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的氨基酸序列。用抗原的优势表位检测动物体是否感染该抗原的原理是:当动物体感染抗原后，动物体就会产生针对该抗原的抗体，该抗体分布在动物的血清中，通过检测血清中该抗体的存在与否，就能得知动物体是否感染抗原。动物体产生的抗体一般是针对抗原的优势表位，即所产生的抗体能特异性的与抗原的优势表位相结合。所以通过抗原优势表位检测血清中是否存在与其结合的抗体，就能得知动物体是否感染该病毒。本发明提供了一种非诊断目的的检测仙台病毒感染的方法，包括以下步骤:步骤1:将本发明提供的抗原肽包被到酶标板上，经第一洗涤后封闭，获得封闭后的酶标板；步骤2:取待测样品加入封闭后的酶标板中，经孵育、第二洗涤、标记二抗、第三洗涤后显色，获得受检溶液；步骤3:取受检溶液，用酶标仪检测OD45tl值，采用Cut off值法判断检测结果；Cut off值法判断的标准为:受检溶液的OD45tl值彡I +3SD为阳性，
受检溶液的OD45tl值彡i +2SD为阴性，J +3SD >受检溶液的OD45tl的值> ~x +2SD为可疑，重新测受检溶液的OD45tl值，受检溶液的OD45tl值小于 +3SD则判为阴性；其中，i为所有阴性对照样品的OD450平均值，SD为所有阴性样品OD450的标准差；阴性对照样品与待测样品的检测方法一致；其中，本发明提供的仙台病毒疫苗中抗原肽为具有如SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列或具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的氨基酸序列。i值和SD值对某一物种而言为固定值，可在检测后保存，再次检测时可不对阴性对照进行检测。作为优选，包 被具体为:将100 μ L含有10 μ g/mL抗原肽的包被缓冲液加入酶标板上，4°C条件下放置过夜。优选地，包被缓冲液的pH为9.6。更优选地，包被缓冲液的溶剂为蒸馏水。更优选的，包被缓冲液中Na2CO3的质量-体积浓度为1.59g/L，NaHCO3的质量体积浓度为2.93g/L。作为优选，第一洗涤采用洗涤缓冲液。优选地，洗涤缓冲液洗涤缓冲液pH值为7.4。更优选地，洗涤缓冲液的溶剂为蒸馏水。更优选地，洗涤缓冲液中各组分的含量为:
KH2PO40.2 g/L
Na:HPC):.!2H:02.9 g.L
NaCl8.0 g/L
KCl0.2 g/L
Tween-200.00025 %作为优选，封闭具体为:在酶标板上加入样品稀释液，37°C条件下放置不少于I小时。优选地，样品稀释液为牛血清白蛋白与洗涤缓冲液的混合物。更优选地，样品稀释液中，牛血清蛋白的含量为lg/L。作为优选，待测样品为动物血清与样品稀释液的混合物。优选地，待测样品中动物血清与样品稀释液的体积比为1:2。作为优选,待测样品的添加量为，每孔50 μ L。作为优选，孵育具体为:在室温条件下，放置I小时。作为优选，第二洗涤采用洗涤缓冲液。作为优选，二抗采用辣根过氧化物酶标记。优选地，采用样品稀释液稀释二抗，制备稀释后的二抗。
更优选地，二抗与样品稀释液的体积比为1:10000。最优选地，标记二抗具体为:取100 μ L稀释后的二抗加入酶标板，37°C条件下放置I小时。作为优选，第三洗涤采用洗涤缓冲液。作为优选地，显色具体为:在酶标板上加入底物缓冲液，放置5min后，加入终止液。优选地，底物缓冲液的pH值为5.0。更优选地，底物缓冲液的溶剂的为水，其中各组分的含量为:Na2HPO4 0.1028mol/L柠檬酸0.0486mol/L更优选地，终止液采用浓度为2mol/L的H2SO4水溶液。本发明提供了一种仙台病毒感染检测试剂盒，包括包被有本发明提供的抗原肽的平板、洗涤缓冲液、样品稀释液、终止液和底物缓冲液。其中，本发明提供的仙台病毒疫苗中抗原肽为具有如SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列或具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的氨基酸序列。
优选的，包被有本发明提供的包被有本发明提供的抗原肽的平板的基质为:玻片、酶标板、多肽芯片或蛋白芯片。更优选地，包被有本发明提供的抗原肽的平板的基质为:多肽芯片。优选地，洗涤缓冲液洗涤缓冲液pH值为7.4。更优选地，洗涤缓冲液的溶剂为蒸馏水。优选地，洗涤缓冲液中各组分的含量为:
KH2PO40.2 g/L
Na2HPO4.12H:02.9 g/L
NaCl8.0 g/L
KCl0.2 g/L
7weeiv200.00025 %优选地，样品稀释液为牛血清白蛋白与洗涤缓冲液的混合物。更优选地，样品稀释液中，牛血清蛋白的含量为lg/L。优选地，终止液为浓度为2mol/L的H2SO4水溶液。优选地，底物缓冲液的pH值为5.0。更优选地，底物缓冲液的溶剂的为水。更优选地，底物缓冲液中各组分的含量为:Na2HPO4 0.1028mol/L柠檬酸0.0486mol/L作为优选，本发明提供的仙台病毒感染检测试剂盒的使用方法为:步骤1:取样品稀释液稀释待测样品后加入包被有本发明提供的抗原肽的平板中，经孵育、第四洗涤、标记二抗、第五洗涤后显色，获得受检溶液；步骤2:取受检溶液，用酶标仪检测OD45tl值，采用Cut off值法判断检测结果；Cut off值法判断的标准为:受检溶液的OD45tl值≥；+3SD为阳性，受检溶液的OD45tl值≤ +2SD为阴性，i +3SD >受检溶液的OD45tl的值> J +2SD为可疑，重新测受检溶液的OD45tl值，受检溶液的OD45tl值小于i +3SD则判为阴性；其中， 为所有阴性对照样品的OD45tl平均值，SD为所有阴性样品OD450的标准差，阴性对照样品与待测样品的检测方法一致。i值和SD值对某一物种而言为固定值，可在检测后保存，再次检测时可不对阴性对照进行检测。优选地，待测样品中动物血清与样品稀释液的体积比为1:2。作为优选,待测样品的添加量为，每孔50 μ L。作为优选，孵育具体为:在室温条件下，放置I小时。作为优选，第二洗涤采用洗涤缓冲液。作为优选，二抗采用辣根过氧化物酶标记。优选地，采用样品稀释液稀释二抗，制备稀释后的二抗。更优选地，二抗与样品稀释液的体积比为1:10000。最优选地，标记二抗具体为:取100 μ L稀释后的二抗加入酶标板，37°C条件下放置I小时。作为优选，第三洗涤采用洗涤缓冲液。作为优选地，显色具体为:在酶标板上加入底物缓冲液，放置5min后，加入终止液。本发明提供了一种仙台病毒抗原肽，具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或在具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的氨基酸序列。并提供了其在仙台病毒感染检测中的应用。本发明采用蛋白杂交技术，筛选出仙台病毒的优势抗原，该优势抗原为仙台病毒的NP (nucleocapsid protein)蛋白，仙台病毒的NP蛋白有524个氨基酸残基。本发明根据优势抗原NP蛋白的氨基酸序列，采用overlapping方式设计抗原多肽阵列并合成了抗原多肽阵列芯片，筛选出了仙台病毒特异性强而分子量小的线性表位。由于本发明提供的仙台病毒抗原肽分子量较小，降低了与其他分子发生交叉反应的可能性，因此提高了多肽组合的特异性和针对性，从而提高了实验动物微生物检测的准确性。本发明还提供了一种仙台病毒疫苗，包括本发明提供的仙台病毒抗原肽及药学上可接受的辅料，由于本发明提供的抗原肽是仙台病毒的优势抗原，所以在制备疫苗时，可减少仙台病毒对动物的危害。通过对抗原肽与梯度稀释的阴性及阳性血清的结合反应进行研究，结果表明:本发明提供的抗原肽与阳性血清具有良好的量效关系，且本发明提供的抗原肽与阳性血清中仙台病毒的抗体可产生特异性的结合。
图1示仙台病毒抗原与大鼠仙台病毒阴性对照和阳性对照抗血清杂交电泳图，其中，泳道N示仙台病毒抗原与大鼠仙台病毒阴性对照血清杂交电泳，泳道P示仙台病毒抗原与大鼠仙台病毒阳性对照血清杂交电泳，箭头a示条带分子量为70kDa，箭头b示条带分子量为57kDa ；图2示仙台病毒NP蛋白多肽阵列模式图；图3示抗原多肽阵列与大鼠血清结合实验图，图3(a)示大鼠仙台病毒阴性对照血清与仙台病毒NP蛋白多肽阵列反应后所得图像(源自成像仪分析软件生成图像)，图3 (b)示大鼠仙台病毒阳性血清与仙台病毒NP蛋白多肽阵列反应后所得图像，其中，I号框示抗原表位212，2号框抗原表位229 232、3号框不抗原表位241 243，4号框不抗原表位258 259 ；图4天然抗原及筛选出的优势抗原肽分别与阴性血清和阳性血清的结合实验图，其中，纵坐标为OD45tl值，■示抗原与阳性血清结合的实验结果，□示抗原与阴性血清结合的实验结果，柱A示筛选出的优势抗原肽A分别与阴性血清和阳性血清结合的实验结果，柱B示筛选出的优势抗原肽B分别与阴性血清和阳性血清结合的实验结果，柱C示筛选出的优势抗原肽C分别与阴性血清和阳性血清结合的实验结果，柱D示筛选出的优势抗原肽D分别与阴性血清和阳性血清结合的实验结果，柱Sev示天然抗原分别与阴性血清和阳性血清结合的实验结果；图5示抗原肽C与梯度稀释的阳性血清和阴性对照血清的结合实验图，其中，横坐标为稀释比例，纵坐标为OD45tl值，曲线I示抗原肽C与梯度稀释的阳性血清结合的实验结果，曲线2示抗原肽C与梯度稀释的阴性血清结合的实验结果。
具体实施例方式本发明提供了提供一种仙台病毒抗原肽及其在仙台病毒感染检测中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参`数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明提供了一种仙台病毒抗原肽，具有如SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列。本发明还提供了一种仙台病毒抗原肽，具有如SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的氨基酸序列。本发明提供的仙台病毒抗原肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的同源性大于85%。本发明提供的抗原肽是仙台病毒的优势抗原，且分子量较小，因此降低了与其他分子发生交叉反应的可能，提高了多肽组合的特异性和针对性，从而提高了对仙台病毒感染检测的准确率。本发明提供的抗原肽的筛选方法为:首先，采用蛋白杂交技术，筛选出仙台病毒的优势抗原；然后，根据优势抗原的氨基酸序列，采用overlapping方式设计抗原多肽阵列并合成了抗原多肽阵列芯片，筛选出了仙台病毒线性表位。本发明的筛选出的仙台病毒优势抗原是仙台病毒的NP (nucleocapsid protein)蛋白。设计抗原多肽阵列时以14 18个氨基酸残基为多肽长度，以2个氨基酸位移来设计抗原多肽阵列。抗原肽阵列的合成采用自动单点多肽合成仪。筛选出的优势抗原肽表位位于NP蛋白的C端。本发明提供的抗原肽是仙台病毒的优势抗原表位，且分子量较小，因此降低了与其他分子发生交叉反应的可能，提高了多肽组合的特异性和针对性，从而提高了对仙台病毒感染检测的准确率。抗原肽的制备可采用生物学的方法或化学合成。本发明提供了一种编码SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的DNA分子，具有如SEQ IDN0:2所示的核苷酸序列。本发明还提供了一种仙台病毒疫苗，包括本发明提供的仙台病毒抗原肽及药学上可接受的辅料。本发明提供的仙台病毒疫苗中抗原肽为具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的氨基酸序列。为方便使用， 本发明提供给的仙台病毒疫苗的剂型为口服制剂或注射剂。由于本发明提供的抗原肽是仙台病毒的优势抗原表位，所以在制备疫苗时，可减少仙台病毒对动物的危害。本发明提供的仙台病毒抗原肽在仙台病毒感染检测中的应用。本发明提供的仙台病毒疫苗中抗原肽为具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的氨基酸序列。用抗原的优势表位检测动物体是否感染该抗原的原理是:当动物体感染抗原后，动物体就会产生针对该抗原的抗体，该抗体分布在动物的血清中，通过检测血清中该抗体的存在与否，就能得知动物体是否感染抗原。动物体产生的抗体一般是针对抗原的优势表位，即所产生的抗体能特异性的与抗原的优势表位相结合。所以通过抗原优势表位检测血清中是否存在与其结合的抗体，就能得知动物体是否感染该病毒。本发明提供了一种非诊断目的的检测仙台病毒感染的方法，包括以下步骤:首先，将本发明提供的抗原肽包被到酶标板上，经第一洗涤后封闭，获得封闭后的酶标板；然后，取待测样品加入封闭后的酶标板中，经孵育、第二洗涤、标记二抗、第三洗涤后显色，获得受检溶液；然后，取受检溶液，用酶标仪检测OD45tl值，采用Cut off值法判断检测结果；Cut off值法判断的标准为:受检溶液的OD45tl值彡；+3SD为阳性，受检溶液的OD45tl值Si +2SD为阴性，^ +3SD彡受检溶液的OD450的值彡 +2SD为可疑，重新测受检溶液的OD45tl值，受检溶液的OD45tl值小于i +3SD则判为阴性；其中， 为所有阴性对照样品的OD45tl平均值，SD为所有阴性样品OD45tl的标准差；阴性对照样品与待测样品的检测方法一致；其中，本发明提供的仙台病毒疫苗中抗原肽为具有如SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列或具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的氨基酸序列。 值和SD值对某一物种而言为固定值，可在检测后保存，再次检测时可不对阴性对照进行检测。本发明提供的非诊断目的的检测仙台病毒感染的方法中，包被具体为:将100 μ L含有10 μ g/mL抗原肽的包被缓冲液加入酶标板上，4°C条件下放置过夜。包被采用的包被缓冲液的pH为9.6。包被缓冲液的溶剂为蒸馏水。包被缓冲液中Na2CO3的质量-体积浓度为1.59 g/L, NaHCO3的质量体积浓度为
2.93g/L。 本发明提供的非诊断目的的检测仙台病毒感染的方法中，第一洗涤采用洗涤缓冲液。洗涤缓冲液洗涤缓冲液pH值为7.4。洗涤缓冲液的溶剂为蒸馏水。洗涤缓冲液中各组分的含量为:
KH2PO40.2 g/L
Na:HP0.:.!2H:02.9 u L
NaCl8.0 g/L
KCl0.2 g/L
Tween-200.00025 %本发明提供的非诊断目的的检测仙台病毒感染的方法中，封闭具体为:在酶标板上加入样品稀释液，37°C条件下放置不少于I小时。样品稀释液为牛血清白蛋白与洗涤缓冲液的混合物。样品稀释液中，牛血清蛋白的含量为lg/L。本发明提供的非诊断目的的检测仙台病毒感染的方法中，待测样品为动物血清与样品稀释液的混合物。待测样品中动物血清与样品稀释液的体积比为1:2。待测样品的添加量为每孔50 μ L0本发明提供的非诊断目的的检测仙台病毒感染的方法中，孵育具体为:在室温条件下，放置I小时。本发明提供的非诊断目的的检测仙台病毒感染的方法中，第二洗涤采用洗涤缓冲液。本发明提供的非诊断目的的检测仙台病毒感染的方法中，二抗采用辣根过氧化物酶标记。
采用样品稀释液稀释二抗，制备稀释后的二抗。
二抗与样品稀释液的体积比为1:10000。标记二抗具体为:取100 μ L稀释后的二抗加入酶标板，37°C条件下放置I小时。本发明提供的非诊断目的的检测仙台病毒感染的方法中，第三洗涤采用洗涤缓冲液。本发明提供的非诊断目的的检测仙台病毒感染的方法中，显色具体为:在酶标板上加入底物缓冲液，放置5min后，加入终止液。底物缓冲液的pH值为5.0。底物缓冲液的溶剂的为水，其中各组分的含量为:Na2HPO4 0.1028mol/L柠檬酸0.0486mol/L终止液采用浓度为2mol/L的H2SO4水溶液。本发明提供了一种仙台病毒感染检测试剂盒，包括包被有本发明提供的抗原肽的平板、洗涤缓冲液、样品稀释液、终止液和底物缓冲液。其中，本发明提供的仙台病毒疫苗中抗原肽为具有如SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列或具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的氨基酸序列。包被有本发明提供的包被有本发明提供的抗原肽的平板的基质为:玻片、酶标板、多肽芯片或蛋白芯片。 包被有本发明提供的抗原肽的平板的基质为:多肽芯片。洗涤缓冲液洗涤缓冲液pH值为7.4。洗涤缓冲液的溶剂为蒸馏水。洗涤缓冲液中各组分的含量为:
KH2PO40.2 g/L
Na:HPC):.!2H:02.9 g.L
NaCl8.0 g/L
KCl0.2 g/L
Tween-200.00025 %样品稀释液为牛血清白蛋白与洗涤缓冲液的混合物。样品稀释液中，牛血清蛋白的含量为lg/L。终止液为浓度为2mol/L的H2SO4水溶液。底物缓冲液的pH值为5.0。底物缓冲液的溶剂的为水。底物缓冲液中各组分的含量为:Na2HPO4 0.1028mol/L柠檬酸0.0486mol/L本发明提供的仙台病毒感染检测试剂盒的使用方法为:首先，取样品稀释液稀释待测样品后加入包被有本发明提供的抗原肽的平板中，经孵育、第四洗涤、标记二抗、第五洗涤后显色，获得受检溶液；然后，取受检溶液，用酶标仪检测OD45tl值，采用Cut off值法判断检测结果；Cut off值法判断的标准为:受检溶液的OD45tl值彡I +3SD为阳性，受检溶液的OD45tl值+2SD为阴性，； +3SD彡受检溶液的OD45tl的值彡 +2SD为可疑，重新测受检溶液的OD450值，受检溶液的OD45tl值小于；+3SD则判为阴性；其中， 为所有阴性对照样品的OD45tl平均值，SD为所有阴性样品OD45tl的标准差；阴性对照样品与待测样品的检测方法一致。i值和SD值对某一物种而言为固定值，可在检测后保存，再次检测时可不对阴性对照进行检测。
本发明提供的仙台病毒感染检测试剂盒的使用方法中，待测样品中动物血清与样品稀释液的体积比为1:2。待测样品的添加量为，每孔50 μ L。孵育具体为:在室温条件下，放置I小时。第二洗涤采用洗涤缓冲液。二抗采用辣根过氧化物酶标记。采用样品稀释液稀释二抗，制备稀释后的二抗。二抗与样品稀释液的体积比为1:10000。标记二抗具体为:取100 μ L稀释后的二抗加入酶标板，37°C条件下放置I小时。第三洗涤采用洗涤缓冲液。显色具体为:在酶标板上加入底物缓冲液，放置5min后，加入终止液。本发明提供了一种仙台病毒抗原肽，具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或在具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的氨基酸序列。并提供了其在仙台病毒感染检测中的应用。本发明采用蛋白杂交技术，筛选出仙台病毒的优势抗原，该优势抗原为仙台病毒的NP (nucleocapsid protein)蛋白，仙台病毒的NP蛋白有524个氨基酸残基。本发明根据优势抗原NP蛋白的氨基酸序列，采用overlapping方式设计抗原多肽阵列并合成了抗原多肽阵列芯片，筛选出了仙台病毒特异性强而分子量小的线性表位。由于本发明提供的仙台病毒抗原肽分子量较小，降低了与其他分子发生交叉反应的可能性，因此提高了多肽组合的特异性和针对性，从而提高了实验动物微生物检测的准确性。本发明还提供了一种仙台病毒疫苗，包括本发明提供的仙台病毒抗原肽及药学上可接受的辅料，由于本发明提供的抗原肽是仙台病毒的优势抗原，所以在制备疫苗时，可减少仙台病毒对动物的危害。通过对抗原肽与梯度稀释的阴性及阳性血清的结合反应进行研究，结果表明:本发明提供的抗原肽与阳性血清具有良好的量效关系，且本发明提供的抗原肽与阳性血清中仙台病毒的抗体可产生特异性的结合。本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可由市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明:实施例1仙台病毒的优势抗原蛋白的确定
首先，配制SDS-PAGE电泳所用溶液:1.0mol/L Tris (ρΗ6.8)溶液:取 12g Tris 溶于 80mL 蒸馏水，调 pH 值至 6.8，用蒸馏水定容至IOOmL ；1.5mol/L Tris (pH8.8)溶液:取 18g Tris 溶于 80mL 蒸懼水,调 pH 值至 8.8,用蒸馏水定容至IOOmL ；10%SDS溶液:取IOg SDS溶于80mL蒸馏水，调节pH值至7.2，用蒸馏水定容至IOOmL ；10%过硫酸铵溶液:取Ig过硫酸胺溶于IOmL蒸懼水；5XTris-甘氨酸电泳缓冲液:Trisl5.lg，甘氨酸94g，完全溶于800mL蒸馏水后加入SDS5g，定容至1L，使用前稀释至I X ；30%丙烯酰氨贮存液:取Ig亚甲基双丙烯酰胺溶于80mL水，加热溶解。然后加入29g丙烯酰胺搅拌溶解，用蒸馏水定容至IOOmL ；5X 上样缓冲液:取 lmol/L Tris-Cl (ρΗ6.8)溶液 1.25mL，0.5g SDS，25mg 溴酚蓝，2.5mL甘油，加入去离子水溶解定容至5mL，使用前加250 μ L β -巯基乙醇或2.5mLlmol/L DTT ； 确定仙台病毒的优势抗原蛋白的方法为:取仙台病毒抗原80 μ L与20 μ L的上样缓冲液混匀，于沸水中煮5min IOmin后上样于聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE电泳，样品在基层胶时采用60V电压，到分离胶时采用120V电压。待上样缓冲液跑出后，根据Marker将目的条带附近的胶切下。按照由黑到白(转印夹)由胶到膜(硝酸纤维素膜)的顺序放置好样品，60V电压下转印3h。将硝酸纤维素膜用5%的脱脂奶粉室温封闭lh。分别取正常大鼠血清和感染仙台病毒的大鼠血清用5%的脱脂奶粉以1:500稀释，于4°C孵育过夜。第二天将膜用TBS-T溶液洗三次，每次lOmin。取二抗(羊抗鼠)IgG_HRP，用5%的脱脂奶粉以1:2000稀释，室温与膜孵育lh。用TBS-T溶液洗膜三次，每次lOmin。加增强发光液在暗室显影。正常大鼠血清和感染仙台病毒的大鼠血清与仙台病毒抗原杂交结果如图1所示。箭头a指示条带分子量为70kDa,箭头b指示条带分子量为57kDa。表明只有与感染仙台病毒的大鼠血清孵育的电泳泳道才有杂交显影条带，而且箭头b所指示分子量为57kDa的条带含量最高。由于仙台病毒NP (nucleocapsid protein)蛋白的分子量约为57kDa,而且研究表明在仙台病毒感染过程中，动物体产生针对NP蛋白的抗体的滴度非常高，所以箭头b所指示的条带为仙台病毒NP蛋白。上述实验结果显示仙台病毒的优势抗原为仙台病毒NP蛋白。实施例2仙台病毒优势抗原多肽表位的筛选根据NP蛋白的524个氨基酸的蛋白序列，用多肽阵列技术制作了 2张多肽阵列。阵列芯片以overlapping方式设计，以14个氨基酸多肽长度，2个氨基酸位移来计算，每张多肽阵列上排列264条多肽，两张阵列芯片共528条多肽。配置所需溶液:浓度为0.25mol/L的Fmoc-氨基酸溶液；封闭液I为含有2%(v/v)乙酸酐的二甲基甲酰胺溶液；封闭液II为2%(v/v)的乙酸酐及2%(v/v)的N，N- 二异丙基乙胺的二甲基甲酰胺溶液；Fmoc-移除液为含有20%(v/v)哌啶的二甲基甲酰胺溶液。首先，合成多肽阵列:把活化的PEG-纤维素膜放置在Autos potter上，根据程序自动添加0.1 μ L的Fmoc-氨基酸溶液到活化的PEG-纤维素膜上的特定位置与膜进行反应，反应20分钟，再重复一遍该点膜过程；把PEG-纤维素膜先浸入封闭液I中反应5分钟在浸入封闭液II中反应20分钟,进行侧链封闭，然后用DMF清洗4次。然后,把PEG-纤维素膜加入Fmoc-移除液中反应5min，重复I次，以移除氨基端的Fmoc保护基团；去保护基团后，用DMF清洗3次，每次30秒钟，而后再用乙醇干燥；重复以上步骤，直至各个多肽全部合成。全部合成后，先用TFA cocktail去除侧链保护基团，再用CH2Cl2清洗4次，而后用乙醇干燥。产物于_20°C保存，用于下一步免疫反应实验。根据实验设计，多肽自动合成仪合成多肽阵列，多肽阵列模式图如图2所示，每张多肽阵列横向为11个多肽点，纵向为24个多肽点，图中对多肽芯片上每个多肽点进行了位置编号标注，每个编号对应相应的多肽序列。以下所有多肽阵列实验结果分析中的阳性表位数字与上述标注数字及多肽序列编号一一对应。将两张多肽阵列芯片与两种实验大鼠血清，阴性对照组大鼠血清I份，阳性组大鼠血清I份，分别进行了免疫反应检测，包括以下步骤:封闭:用含有质量分数为4%脱脂牛奶和质量分数为5%蔗糖的TBS-T缓冲液，室温反应4小时；一抗孵育:取大鼠血清按体积比为1:500稀释；与多肽阵列反应，4°C下过夜；洗膜:用TBS-T缓冲液漂洗3次，每次10分钟；二抗孵育:二抗(羊抗鼠)IgG-HRP，用封闭液按1:2000的体积比稀释，室温下封闭2小时；洗膜:用TBS-T缓冲液漂洗3次，每次10分钟；显色JnAECL发光试剂，数字成像。
多肽阵列与大鼠血清结合结果如图3所示，其中，图3 (a)为对照血清与阵列反应后所得图像(源自成像仪分析软件生成图像)，图3 (b)为阳性血清与阵列反应后所得图像。从多肽阵列检测图的整体对比来看，血清中阳性反应点主要集中于芯片的后1/3部位，表明仙台病毒NP蛋白的主要抗原表位主要集中在该蛋白的C端。同时可以观察到具有明显差别的主要四个抗原表位区域，分别用1、2、3和4号框框出。通过对上述两图中显色点的比较，阴性对照血清中针对229 232 (2号框)、241 243 (3号框)以及258 259 (4号框)抗原表位几乎没有反应，而阳性血清对上述表位反应较强烈，且为连续多个多肽点显色，表明上述表位能够激发较强的免疫反应，可能是主要的抗原表位。I号框的多肽表位阳性血清反应强度明显高于阴性血清，但其未形成连续的差异显色位点，判断其可能为抗原表位，还需进一步验证。针对其他表位的抗体反应，在两组中不存在明显的差异。针对出现的非特异性显色点，可能是由于多肽对抗体识别位点的暴露，以及血清中抗体的交叉反应造成。由于阴性对照血清中针对229 232 (2号框)抗原表位几乎没有反应，而阳性血清对上述表位反应较强烈，且为连续多个多肽点显色，表明上述表位能够激发较强的免疫反应，所以本发明选取2号框中的4条多肽做进一步的研究。实施例3仙台病毒抗原多肽的制备及功能鉴定采用化学合成的方法制备本发明实施例2筛选出的4条多肽，分别命名为抗原A、抗原B、抗原C、抗原D，并以lmg/mL浓度包被至ELISA反应板中，分别与仙台病毒阳性血清和仙台病毒阴性血清做反应，结果如图4所示。结果表明与天然抗原SeV (仙台病毒)相比，4条肽免疫原性弱。但抗原C仍表现出较好的免疫原性。抗原C的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。选择抗原C包被ELISA平板，并将阴性及阳性血清按以下稀释度稀释:1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280、1:2560、1:5120,1:10240、1:20480,并将稀释的血清与抗原肽
C做结合实验，实验结果结果如图5所示，结果显示本发明所筛选的抗原肽C与倍比稀释的免疫血清显示了较好的量效关系。实施例4仙台病毒感染的检测方法准确度检测采用本发明实施例提供的具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的抗原肽C通过ELISA方法对10只感染仙台病毒的大鼠进行检测，另取5只没有感染仙台病毒的大鼠作为阴性对照，测试本发明提供的仙台病毒感染检测方法的准确度。首先，配制ELISA实验中常规试剂:包被缓冲液:取1.59克Na2CO3和2.93克NaHCO·3溶解于蒸馏水，调节pH值为9.6，加蒸馏水至IOOOmL ；洗涤缓冲液:取0.2 克 ΚΗ2Ρ04、2.9 克 Na2HPO4.12Η20、8.0 克 NaCl、0.2 克 KC1、0.05%的Tween-20水溶液0.5mL,溶解与水，调节pH值为7.4，用蒸馏水定容至IOOOmL ；样品稀释液:取0.1克牛血清白蛋白(BSA)溶解于IOOmL配制好的洗涤缓冲液；终止液:取蒸馏水178.3mL,逐滴加入21.7mL浓硫酸(体积分数为98%)；底物缓冲液:取浓度为28.4克/L的Na2HP0425.7mL、浓度为19.2克/L的柠檬酸24.3mL，蒸馏水50mL混合均匀调节pH值至5.0 ；检测仙台病毒抗体的ELISA实验步骤，如下:将本发明实施例提供的具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的抗原肽C包被到ELISA板上，每孔100 μ L，抗原肽C的浓度为10 μ g/mL, 4°C过夜。洗涤液清洗酶标板3次，37°C下用样品稀释液封闭酶标板Ih以上。准备待测样品，抽取待测大鼠的静脉血，离心收集血清。用样品稀释液按1:2的比例稀释血清，取稀释后的血清加入酶标板中，每孔50μ L，室温孵育lh。每个样品包被2个孔。洗涤液清洗酶标板3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，二抗按1: 10000的比例稀释，分别加入孔中，每孔100 μ L，37°C孵育lh，再用洗涤液清洗3次。加辣根过氧化物酶底物缓冲液100 μ L，显色5min后，加入终止液100 μ L，终止显色。用酶标仪检测OD45tl的值，采用Cut off值法判断检测结果；Cut off值法判断的标准为:受检溶液的OD45tl值≥i +3SD为阳性，受检溶液的OD45tl值< X +2SD为阴性，X +3SD >受检溶液的OD45tl的值≥；+2SD为可疑，重新测受检溶液的OD45tl值，受检溶液的OD45tl值小于I+3SD则判为阴性；其中，i为所有阴性对照样品的OD45tl平均值，SD为所有阴性样品OD45tl的标准差；阴性对照样品与待测样品的检测方法一致。采用本发明提供的方法对大鼠感染仙台病毒情况进行鉴定，结果如表I所示:表I本实施例对大鼠感染仙台病毒鉴定结果
权利要求
1.一种仙台病毒抗原肽，其特征在于，具有如SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列。
2.一种仙台病毒抗原肽，其特征在于，在具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的氨基酸序列。
3.一种编码SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的DNA分子，其特征在于，具有如SEQ IDN0:2所示的核苷酸序列。
4.一种仙台病毒疫苗，其特征在于，包括如权利要求1 2任一项所述的抗原肽及药学上可接受的辅料。
5.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗的剂型为口服制剂或注射剂。
6.如权利要求1 2任一项所述的抗原肽在仙台病毒感染检测中的应用。
7.一种非诊断目的的检测仙台病毒感染的方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤1:将如权利要求1 2任一项所述的抗原肽包被到酶标板上，经第一洗涤后封闭，获得封闭后的酶标板； 步骤2:取待测样品加入所述封闭后的酶标板中，经孵育、第二洗涤、标记二抗、第三洗涤后显色，获得受检溶液； 步骤3:取所述受检溶液，用酶标仪检测OD450值，采用Cut off值法判断检测结果； 所述Cut off值法判断的标准为: 受检溶液的OD450值> ^ +3SD为阳性， 受检溶液的OD450值< ;+2SD为阴性， T +3SD >受检溶液的OD450的值> X +2SD为可疑，重新测受检溶液的OD45tl值，受检溶液的OD45tl值小于i +3SD则判为阴性； 其中了力阴性对照样品的OD450平均值，SD为阴性样品OD45tl的标准差。
8.一种仙台病毒感染检测试剂盒 ，其特征在于，包括包被有如权利要求1 2任一项所述抗原肽的平板、洗涤缓冲液、样品稀释液、终止液和底物缓冲液。
全文摘要
本发明提供了一种本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种仙台病毒抗原肽及其在仙台病毒感染检测中的应用。本发明提供的仙台病毒抗原肽，具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或在具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的氨基酸序列。由于本发明提供的仙台病毒抗原肽分子量较小，降低了与其他分子发生交叉反应的可能性，因此提高了多肽组合的特异性和针对性，从而提高了实验动物微生物检测的准确性。
文档编号A61K39/155GK103193865SQ20131009508
公开日2013年7月10日 申请日期2013年3月22日 优先权日2013年3月22日
发明者向志光, 杨志伟, 佟巍, 刘先菊, 李雨函, 魏强 申请人:中国医学科学院医学实验动物研究所, 北京华阜康生物科技股份有限公司