专利名称：GFE-1与rmhTNFα的融合蛋白及其制备方法
技术领域：
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种肺小血管内皮特异性结合多肽GFE-1与重组改构人肿瘤坏死因子rmhTNFa的融合蛋白及其制备方法，以及该融合蛋白的表达、纯化及鉴定、体外活性检测及体内分布测定，以及对人肿瘤坏死因子的基因克隆、基因突变或重组改构、表达、鉴定等方面，还涉及利用所述融合蛋白制备抗肿瘤药物的方面。
背景技术：
1、肿瘤坏死因子相关研究肿瘤坏死因子a (TNFa )是一种由活化的单核细胞/巨噬细胞产生的具有多功能的炎症因子，一种多功能的细胞因子。肿瘤坏死因子α参与机体的免疫和代谢调节，对某些癌细胞具有增殖抑制和细胞毒作用，是迄今为止人们所知道的抗肿瘤活性最强的细胞因子。1.1肿瘤坏死因子α的生物学活性TNFa是一种具有多种功能的炎症因子，在体内外发挥抗瘤、抗炎、免疫调节等多种作用，以下主要介绍它抗肿瘤相关的生物学活性。TNFa体内外均能杀伤某些肿瘤细胞或抑制其增殖作用。TNFa可通过诱导某些癌细胞凋亡来抑制肿瘤。TNFa具有细胞毒活性，多种肿瘤细胞对其敏感。TNFa在体内外均能杀伤某些肿瘤细胞或抑制增殖作用。肿瘤细胞株对TNFa敏感性有很大的差异，某些因素可增加细胞对TNFa杀伤的敏感性，如IFN、高温、转录或翻译的抑制剂，有丝分裂的抑制剂，拓扑异构酶II抑制剂，蛋白激酶抑制剂以及LiCl等。用放线菌素D、丝裂霉素C、放线菌酮等处理肿瘤细胞 (如小鼠成纤维细胞L929)可明显增强TNFa杀伤肿瘤细胞活性，此系统现在已经作为监测TNFa生物学活性的方法。在体内，TNFa还可以通过对机体免疫功能的调节作用，促进T细胞及其他杀伤细胞对肿瘤细胞的杀伤。TNFa作为激发性细胞因子，可启动广泛的免疫炎性反应，介导天然细胞毒细胞、单核细胞和巨噬细胞，对癌细胞的杀伤和溶瘤作用。TNFa可作用于血管内皮细胞，对其增殖进行负调控，进而调节血管生成。并能启动血管损伤，引起肿瘤的血管内皮细胞损伤，不能调控血栓形成，从而导致肿瘤组织的局部血流阻断，发生出血性坏死或因营养缺乏而消退。TNFa的最大耐受剂量很低，因此常伴随发热、肌肉酸痛、流感样症状等副反应，严重限制了其临床应用。但是人们并没有停止对TNF α的研究，目前多通过构建变构体的形式以避免或减轻副作用、增加人体耐受性从而提高治疗效果。1.2TNFa的变构体TNF α活性三聚体的间沟是由近N端和近C端的极性基团及中部的疏水基团所组成的，而这些亚单位之间的沟是TNF与其受体结合的部位。实验表明，C端上最后一个氨基酸Leul57改变成Phe，met或者Glu，能提高其活性18倍左右，因为这种改变使疏水性的TNF-a亚单位之间的结构变得更紧凑，从而提高了 TNFa同受体结合的效率。另外，缺失1-7个N端的氨基酸，增加了 TNF-a的碱性度，提高了和受体的亲和力，活性增加了 5倍。不仅如此，N端的8，9，10和17个氨基酸变成碱性氨基酸，使某些对野生型TNFa不敏感的细胞变得敏感了，扩大了 TNFa的疗效范围，而且还增强了其抗肿瘤的活性。细胞水平和动物试验上的实验数据显示这些变构体不仅提高了同受体的结合能力，还增加了其摧毁肿瘤周围血管上皮组织的能力。另外，变构体引起的毒副作用也要比野生型TNFa低18倍。国内多家研究机构对TNFa变构体进行研究，已有多种TNF α变构体进入了临床研究阶段。发明人通过基因工程方法，将氨基端7个氨基酸残基去除，并将Pro8Ser9Aspw突变为Arg、Lys和Arg，同时把Leu157突变为Phe，改构后的TNF α比天然TNF α体外杀伤L929细胞的活性增加1000倍左右，在体内肿瘤出血坏死效应也明显增加，比单独缺失N端七个氨基酸或者单独突变157位氨基酸的活性升高的都要大，且新型重组人肿瘤坏死因子毒性比天然肿瘤坏死因子降低三倍。原因是N端的氨基酸碱性增强可扩大抗瘤谱，而C端的最后一个氨基酸被替代，疏水性增强，使三聚体更为稳定。较天然肿瘤坏死因子活性提高了 1000倍，而毒性却为天然肿瘤坏死因子的1/3。临床试验结果表明，rmhTNFa对非小细胞肺癌、黑色素瘤和头颈部肿瘤具有明显的治疗作用。已获得国家食品药品监督局的新药证书。2、特异性多肽研究现状利用噬菌体展示技术构建的随机肽库可用于筛选与某个靶细胞特异性结合的多肽。即通过确定表达在不同肿瘤细胞或组织器官上特异性分子的结合肽，并以此结合肽为载体与药物相连，这样可以有效地提高定向传递治疗药物的能力。随机肽 库技术在抗肿瘤领域的研究主要集中于以下几种方式:1.用于筛选已知肿瘤抗原的特异性结合肽，主要是针对肿瘤细胞膜分子常常出现的异常糖基化现象，这些特异性糖类可以作为肿瘤导向治疗的目标受体。2.用于筛选与肿瘤转移有关的粘附分子的特异性结合肽，如RGD多肽通过识别整合素，已成为抑制肿瘤细胞迁移及粘附的新治疗靶点。3.用于筛选组织特异性结合肽用特定的组织和细胞，对随机肽库进行多轮淘洗时，可以筛选出大量结合在细胞表面受体分子上的肽。再通过多种有效的方法减少一些噬菌体群的复杂性后，可以得到特异性结合于该组织的肽。4.用于筛选肿瘤附属组织的特异性结合肽。特异性多肽分子量小，构建简单，免疫原性更低，应用其作为导向载体是一个很好的研究策略。目前的研究结果显示:将特异性多肽与抗肿瘤药物联合使用，可提高后者抗肿瘤效率并降低其全身的毒副作用。随机肽库技术在肿瘤导向治疗中也渐渐发挥着重要的作用。GFE-1就是我们通过噬菌体随机肽库技术分离出的可与肺特异性结合的多肽，含有13个氨基酸(CGFECVRQCPERC)及2个潜在二硫键。实验分离得到的GFE-1的受体经蛋白序列鉴定与MDP (membrane dipeptidase)—致,且证实该受体在肺组织的分布远高于其他组织。3、GFE-1 及其受体3.1GFE-1GFE-1显示出比对照高35倍的特异性与肺结合的能力，含13个氨基酸及2个潜在二硫键，GFE-1的结合可被共轭多肽所阻断。另一个与肺结合的多肽GFE-2与GFE-1有相同的三肽模序。呈现GFE-2多肽的噬菌体也可在肺的血管发现，它结合于肺并被GFE-1多肽抑制，GFE-1及GFE-2主要结合在毛细血管而不是更大血管。GFE-1及GFE-2多肽都可以结合于相同的受体，GFE-1的结合作用强于GFE-2。这个受体选择性地表达在血管。3.2GFE-1 的受体Daniel Rajotte等分离出这个肺特异性多肽GFE-1的受体,蛋白序列鉴定了这个受体与MDP—致，MDP是一个多功能的蛋白，它可与脂蛋白，特别是高密度脂蛋白结合，通过参与维生素E的代谢而影响肺泡II型细胞功能，从而影响抗炎，细胞凋亡及肺泡表面活性剂合成等肺功能。它特异性的分解Cys-Gly键，有意义的是，GFE-1和GFE-2多肽的第1，2位氨基酸是Cys-Gly。它们可以结合到MDP的活性部位从而抑制MDP的酶解活性。它是MDP的竞争抑制剂。噬菌体颗粒呈现GFE-1肽段选择性地结合在转染鼠MDP cDNA的C0S-1细胞。MDP在肺，肾等几种器官表达，主要表达在肺和肾。MDP在肺部主要表达在支气管及肺泡上皮、毛细血管、肺泡及终末细支气管的基膜。在肾分布于近球小管刷状缘区。
发明内容
本发明的目的是提供一种肺小血管内皮特异性结合多肽GFE-1与重组改构人肿瘤坏死因子rmhTNFa的融合蛋白及其制备方法和用途。本发明所制备的融合蛋白GFE-1-rmhTNF α能在肺组织特异性富集，从而提高肿瘤坏死因子的治疗特异性，减少全身用量，降低毒副反应，可作为肺部疾病的治疗候选药物，特别是肿瘤、免疫等方面。本发明的目的之一是提供一种重组的、分离的或合成的融合蛋白GFE-1-rmhTNFa，该融合蛋白包括以下部分:I)肺小血管内皮特异性结合多肽(GFE-1 )，或具有GFE-1活性的片段或变体；2)经过重组改构而获得的人肿瘤坏死因子(rmhTNFa )或其片段或变体，所述重组改构改善其蛋白活性。更佳的，该融合蛋白由肺小血管内皮特异性结合多肽和经过重组改 构而获得的人肿瘤坏死因子通过连接而获得，其中连接方式为通过连接肽连接。其中，更好的，所述肺小血管内皮特异性结合多肽(GFE-1)的基因序列为为⑴ (6)中任一种:(1) SEQ ID NO: I所不的序列；(2) DNA分子，其编码与SEQ ID NO:1所不序列所编码的多肽相比，具有一个或多个氨基酸残基的保守替代的多肽；⑶与SEQ ID N0:1所示的序列具有至少90%序列同一性的DNA分子或编码其活性片段的序列；⑷与SEQ ID NO:1所示序列互补的序列；(5)由于遗传密码的简并性而衍生自SEQ ID NO:1所示序列的序列之一 ；(6)编码SEQID NO:2所示氨基酸序列的基因序列。其中，更好的，所述人肿瘤坏死因子(rmhTNFa )的基因序列为① ⑥中任一种:①SEQ ID NO:3所示的序列德DNA分子，其编码与SEQ ID NO:3所示序列所编码的多肽相比，具有一个或多个氨基酸残基的保守替代的多肽；③与SEQ ID NO:3所示的序列具有至少90%序列同一性的DNA分子或编码其活性片段的序列；④与SEQ ID NO:3所示序列互补的序列；⑤由于遗传密码的简并性而衍生自SEQ ID NO:3所示序列的序列之一；⑥编码SEQ ID NO:4所不氣基酸序列的基因序列。其中，更好的，本发明所述的融合蛋白GFE-1-rmhTNFa的基因序列还可以为a)
f)中任一种:a) SEQ ID NO:5所示的序列；b) DNA分子，其编码与SEQ ID NO:5所示序列所编码的多肽相比，具有一个或多个氨基酸残基的保守替代的多肽；c)与SEQ ID N0:5所示的序列具有至少90%序列同一性的DNA分子或编码其活性片段的序列；d)与SEQ IDNO:5所示序列互补的序列；e)由于遗传密码的简并性而衍生自SEQ ID NO:5所示序列的序列之一；f)编码SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的基因序列。本发明所述的融合蛋白GFE-1-rmhTNF α的氨基酸序列为SEQ ID NO:6所示。含有所述融合蛋白GFE-1-rmhTNFa的表达载体、表达盒，含有所述融合蛋白GFE-1-rmhTNF α或所述表达载体或表达盒的转基因细胞系或重组菌或重组病毒均属于本发明的保护范围。本发明还有一个目的是提供生产或制备本发明的融合蛋白的方法，该方法的步骤包括:1)提供DNA分子，所述DNA分子包含可在生物中表达的编码所述融合蛋白GFE-1-rmhTNF α的核苷酸序列；2)在所述生物中表达所述DNA分子以形成所述融合蛋白GFE-1-rmhTNF α ;和3)分离或纯化所述融合蛋白GFE-1-rmhTNF α。本发明还有一个目的是提供一种药物组合物，其特征在于，包括药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂，以及有效量的上述融合蛋白GFE-1-rmhTNF α、或上述表达载体或表达盒、或上述转基因细胞系、重组菌或重组病毒。本发明还有一个目的是将本发明的融合蛋白、或表达载体或表达盒、或转基因细胞系、重组菌或重组病毒应用于制备药物，特别是制备预防或治疗肺部疾病的药物。其中所述肺部疾病为肺部肿瘤。本发明还有一个目的是提供一种重组改构的人肿瘤坏死因子(rmhTNF a )，其中所述改构过程为:分别用定位基因突变技术将野生型人肿瘤坏死因子氨基端7个氨基酸残基去除，并将Pro8Ser9AsP10突变为Arg、Lys和Arg，同时把Leu157突变为Phe，从而获得重组改构的人肿瘤坏死因子(rmhTNF a )。其中所述重组改构改善所述人肿瘤坏死因子的蛋白活性，并降低其毒性。该rmhTNFa可用于制备药物，所述药物用于预防或治疗肿瘤、炎症或免疫调节。 通过上述过程获得的人肿瘤坏死因子的基因序列还可以为I) 6)中任一种:1)SEQ ID NO:3所示的序列；2) DNA分子，其编码与SEQ ID NO:3所示序列所编码的多肽相t匕，具有一个或多个氨基酸残基的保守替代的多肽；3)与SEQ ID NO:3所示的序列具有至少90%序列同一性的DNA分子或编码其活性片段的序列；4)与SEQ ID NO:3所示序列互补的序列；5)由于遗传密码的简并性而衍生自SEQ ID NO:3所示序列的序列之一；6)编码SEQ ID NO:4所不氣基酸序列的基因序列。为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是:肺小血管内皮特异性结合多肽GFE-1与重组改构人肿瘤坏死因子rmhTNF α融合蛋白，其特征在于，分别用定位基因突变技术将野生型人肿瘤坏死因子氨基端7个氨基酸残基去除，并将Pr08Ser9AsPui突变为Arg、Lys和Arg，同时把Leu157突变为Phe，构建了高效低毒的重组改构人肿瘤坏死因子rmhTNF α。在此基础上，选用通过随机肽库技术筛选分离出的与肺特异性结合的多肽GFE-1，利用基因工程方法制备肺小血管内皮特异性结合多肽与rmhTNFa融合基因，并在大肠杆菌中获得闻效表达。制备如上所述的肺小血管内皮特异性结合多肽GFE-1与重组改构人肿瘤坏死因子rmhTNFa融合蛋白，按以下步骤制备:I)定位基因突变技术将野生型人肿瘤坏死因子氨基端7个氨基酸残基去除，并将Pro8Ser9Asp10突变为Arg、Lys和Arg，同时把Leu157突变为Phe，构建了高效低毒的重组改构人肿瘤坏死因子rmhTNF α。
2) PBV-GT融合基因表达载体的构建根据GFE-1多肽序列按大肠杆菌惯用码设计核酸序列，在多肽的氨基端引入EcoR I酶切位点，羧基端引入BamH I酶切位点，序列如下:S1:5’-AATTCATGTGCGGTTTCGAATGCGTTCGTCAGTGCCCGGAACGTTGCG-3’(SEQ ID NO:
7)S2:5’-GATCCGCAACGTTCCGGGCACTGACGAACGCATTCGAAACCGCACATG-3’(SEQ ID NO:
8)将合成的GFE-1多肽核苷酸片段变性，退火，pGEM3zf(-)克隆载体连接。用BamH I 和 Pst I 双酶切 pGEM3zf (-) /GFE-1 和 pGEM3zf (-) /rmhTNF- α，分别回收前者大片段和后者小片段进行连接，鉴定正确后命名为pGEM3zf (-)-GT。用EcoR I和Pst I双酶切pGEM3zf(-)-GT和表达载体PBV220，分别回收前者小片段和后者大片段进行连接，连接产物转化入大肠杆菌DH5 α，挑取单克隆提取质粒经EcoR I和Pst I双酶切鉴定正确后得到目的菌株，命名为PBV-GT。3)融合蛋白的诱导表达与纯化 将PBV-GT/DH5 α接种于含100 μ g/mL Amp的LB培养基中，30 V振摇培养过夜，再以1:100比例转接到含Amp的培养基中，继续30°C振摇培养至对数生长期(A_为0.4-0.6)，迅速升温至42°C诱导4h诱导表达。收集菌体，溶菌酶裂菌后离心收集上清，用40%及65%饱和硫酸铵于0°C分段盐析，离心，以透析外液(20mM Tris-HCl，pH=8.5，ImM EDTA) 30mL溶解该段沉淀蛋白，透析后过 Q-Sepharose FF,收集 0.07-0.lmol/L NaCl 洗脱峰,再透析后过 SP-Sepharose FF,收集0.4-0.5mol/L NaCl洗脱峰即为纯化产物。4)纯化后融合蛋白的Western印迹将纯化后的融合蛋白用SDS-PAGE分离后，用半干转膜仪电转至NC膜上，洗涤，2%BSA的TBST于37°C封闭lh，洗涤，依次加入鼠抗人TNF单克隆抗体和碱性磷酸酶标记的羊抗鼠抗体孵育，用ECL显影。5)重组蛋白的体外活性测定按照经典的L929细胞毒法进行测定。6)体内分布实验将30只昆明小鼠随机分组，设空白对照120min组(注射生理盐水)、rmhTNF- α 40 μ g/kg60min 组、GFE-l-rmhTNF40 μ g/kg30min、60min、120min 组。各组小鼠尾静脉给药(0.05mL/10g)，给药后眼眶静脉采血并分离血清。小鼠处死取肺、肝、肾组织并分离匀浆上清。使用夹心ELISA检测小鼠血清和匀浆上清中TNF-α浓度。另取肺、肝、肾组织固定，石蜡包埋后切片，按SP试剂盒所示步骤进行免疫组织化学染色。以PBS替代一抗作阴性对照。
图1是重组克隆 载体pGEM3zf(_)/GT的酶切鉴定图，其中1:DNA marker ;2，3:EcoR I 和 Pst I 双酶切 pGEM3zf (-) /GT0图2是PBV-GT质粒DNA测序结果图3是融合蛋白GFE-1-rmhTNF诱导表达的SDS-PAGE图谱，其中1:蛋白质分子量标准；2:未诱导菌体总蛋白；3:42°C诱导表达4h后菌体总蛋白；4:裂解上清总蛋白；5:包涵体。图4是融合蛋白GFE-1-rmhTNF纯化后的SDS-PAGE图谱，其中1:蛋白质分子量标准；2:未诱导菌体总蛋白；3:裂解上清总蛋白；4:通过Q-S^harose FF后的总蛋白；5:通过SP-Sepharose FF后的总蛋白。图5是纯化后融合蛋白的Western印迹,其中1:未诱导菌体总蛋白的Western印迹；2:诱导纯化后菌体总蛋白的Western印迹。图6是小鼠血清与组织中TNF浓度ELISA检测结果；图7是免疫组织化学染色显示融合蛋白的体内分布。免疫组化显示GFE-1-rmhTNF在小鼠肺(A)Jf(B)J^(C)及rmhTNF-α在小鼠肺(D)组织的分布，生理盐水组为空白对照(Ε)。
具体实施例方式下面将通过具体实施例对本发明作详细的描述。按照本发明采用的技术方案是:使用定位基因突变技术构建了高效低毒的重组改构人肿瘤坏死因子rmhTNFa。然后根据GFE-1多肽序列按大肠杆菌惯用码设计核酸序列，在多肽两端引入酶切位点，连接入pGEM3zf(_)克隆载体。用BamH I和Pst I双酶切pGEM3zf (-) /GFE-1和pGEM3zf (-) /rmhTNF- α，分别回收前者大片段和后者小片段进行连接，构建PBV-GT融合基因表达载体。转化DH5 α感受态细胞，升温诱导表达后，经硫酸铵分段盐析及离子交换作用层析纯化重组蛋白，最终获得了高纯度的融合蛋白，并采用SDS-PAGE和Western blot对其进行鉴定。通过经典的L929杀伤试验测定其生物学活性，并检测其体内分布。结果表明，融合蛋白GFE-1-rmhTNF，可显著杀伤L929细胞并特异性富集于小鼠肺组织。实现上述GFE-1-rmhTNF融合蛋白的制备方法，按照以下步骤进行:1.PBV-GT融合基因表达载体的构建使用定位基因突变技术将野生型人肿瘤坏死因子氨基端7个氨基酸残基去除，并将Pro8Ser9Asp10突变为Arg、Lys和Arg，同时把Leu157突变为Phe，构建了高效低毒的重组改构人肿瘤坏死因子rmhTNF α。根据GFE-1多肽序列按大肠杆菌惯用码设计核酸序列，在多肽的氨基端引入EcoR I酶切位点，羧基端引入BamH I酶切位点，序列如下:S1: 5’ -AATTCATGTGCGGTTTCGAATGCGTTCGTCAGTGCCCGGAACGTTGCG-3’ (SEQ IDNO:7)；S2:5’-GATCCGCAACGTTCCGGGCACTGACGAACGCATTCGAAACCGCACATG-3’(SEQ ID NO:
8)将合成的GFE-1多肽核苷酸片段变性，退火，与EcoR I和BamH I消化过的pGEM3zf (-)克隆载体连接。用 BamH I 和 Pst I 双酶切 pGEM3zf (-)/GFE-1 和 pGEM3zf (-) /rmhTNF-α，分别回收前者大片段和后者小片段进行连接，连接产物转化入大肠杆菌DH5 α，挑取单克隆提取质粒经酶切鉴定正确后命名为pGEM3zf(-)-GT(图1)。用EcoR I和Pst I双酶切pGEM3zf(-)-GT和表达载体pBV220，分别回收前者小片段和后者大片段进行连接，连接产物转化入大肠杆菌DH5 α，挑取单克隆提取质粒经测序鉴定正确后得到目的菌株，命名为 PBV-GT (图 2)。2.GFE-1-rmhTNF融合蛋白的诱导表达与纯化将PBV-GT/DH5 α接种于含100 μ g/mL Amp的LB培养基中，30 V振摇培养过夜，再以1:100比例转接到含Amp的培养基中，继续30°C振摇培养至对数生长期(A_为
0.4-0.6)，迅速升温至42°C诱导4h，离心收集菌体，溶菌酶法裂菌，SDS-PAGE分析表达产物及表达形式(图3)。收集菌体，按每克菌体悬浮于7mL STE中并加入20mg溶菌酶裂菌，4°C搅拌20min，加入脱氧胆酸钠至菌液呈粘稠拉丝状，加入IM MgCl2 (0.2mL/g)及DNAase I ,搅拌至无拉丝现象，离心收集上清，用40%及65%饱和硫酸铵于0°C分段盐析，离心，以透析外液(20mMTris-HCl，pH=8.5，ImM EDTA) 30mL溶解该段沉淀蛋白，以50倍体积透析外液透析24h，过Q-Sepharose FF, IM NaCl连续梯度洗脱7-8个柱体积后，收集0.07-0.lmol/L NaCl洗脱峰，再以50倍体积透析外液透析24h，过SP-S^harose FF, IM NaCl连续梯度洗脱5个柱体积后，收集0.4-0.5mol/L NaCl洗脱峰，SDS-PAGE分析纯化产物(图4)。将其对30倍体积PBS透析，用0.22 μ m滤膜过滤除菌，分装后_20°C保存备用。3.纯化后的GFE-l-rmhTNF融合蛋白Western印迹检测将纯化后的融合蛋白用SDS-PAGE分离后，用半干转膜仪电转至NC膜上，洗涤，2%BSA的TBST于37°C封闭lh，洗涤，依次加入鼠抗人TNF单克隆抗体和碱性磷酸酶标记的羊抗鼠抗体孵育，用ECL显影(图5)。4.重组蛋白 的体外活性测定将L929细胞调整浓度为lX105/mL，以每孔100 μ L接种于96孔板，37 °C，5%C02培养至细胞贴满板壁80%以上。将冻干粉状待测样品与标准品梯度稀释后，吸去培养板中细胞培养上清，每孔依次加样100 μ L，37°C，5%C02培养过夜，镜检在半数死亡孔到达D或E后，吸弃上清，每孔加入30 μ I MTT溶液(5mg/mL)，37°C继续孵育4h，吸弃上清，每孔加入100 μ I DMSO,充分振荡后于酶标仪490nm波长下测定各孔OD值。以490nm波长下OD值对稀释倍数作图。效价按下式计算:hTNFa成品活性(IU/mL)=标准品效价X (样品预稀释倍数/标准品预稀释倍数)X (标准品半效量稀释度/样品相当于标准品半效量的稀释度)结果如表I所示。表I融合蛋白GFE-1-rmhTNF在纯化过程中的活性和蛋白回收率
权利要求
1.重组的、分离的或合成的融合蛋白GFE-1-rmhTNFα，其特征在于，该融合蛋白包括: 1)肺小血管内皮特异性结合多肽(GFE-1)，或具有GFE-1活性的片段或变体； 2)经过重组改构而获得的人肿瘤坏死因子(rmhTNFa)或其片段或变体，所述重组改构改善其蛋白活性。
2.权利要求1所述的融合蛋白GFE-1-rmhTNFa，其中所述肺小血管内皮特异性结合多肽(GFE-1)的基因序列为⑴ (6)中任一种: (I)SEQ ID NO:1所示的序列； ⑵DNA分子，其编码与SEQ ID NO:1所示序列所编码的多肽相比，具有一个或多个氨基酸残基的保守替代的多肽； ⑶与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少90%序列同一性的DNA分子或编码其活性片段的序列； (4)与SEQID NO:1所示序列互补的序列； (5)由于遗传密码的简并性而衍生自SEQID NO:1所示序列的序列之一； (6)编码SEQID NO:2所示氨基酸序列的基因序列。
3.权利要求1或2所述的融合蛋白GFE-1-rmhTNFα，其中所述人肿瘤坏死因子CrmhTNFa )的基因序列为① ⑥中任一种: ①SEQID NO:3所不的序列； ②DNA分子，其编码与SEQID NO:3所示序列所编码的多肽相比，具有一个或多个氨基酸残基的保守替代的多肽； ③与SEQID NO:3所示的序列具有至少90%序列同一性的DNA分子或编码其活性片段的序列； ④与SEQID NO:3所示序列互补的序列； ⑤由于遗传密码的简并性而衍生自SEQID NO:3所示序列的序列之一； ⑥编码SEQID NO:4所不氣基酸序列的基因序列。
4.权利要求1至3任一所述的融合蛋白GFE-l-rmhTNFa，其中所述融合蛋白GFE-1-rmhTNF α的基因序列为a) f)中任一种: a)SEQ ID NO:5所示的序列； b)DNA分子，其编码与SEQ ID NO:5所示序列所编码的多肽相比，具有一个或多个氨基酸残基的保守替代的多肽； c)与SEQID NO:5所示的序列具有至少90%序列同一性的DNA分子或编码其活性片段的序列； d)与SEQID NO:5所不序列互补的序列； e)由于遗传密码的简并性而衍生自SEQID NO:5所示序列的序列之一； f)编码SEQID NO:6所示氨基酸序列的基因序列。
5.权利要求1至4任一所述的融合蛋白GFE-1-rmhTNFα，其中所述融合蛋白GFE-1-rmhTNF α的氨基酸序列为SEQ ID NO:6所示。
6.含有权利要求1-5任一所述融合蛋白GFE-1-rmhTNFα的表达载体或表达盒。
7.权利要求1-5任一所述融合蛋白GFE-1-rmhTNFa的制备方法，该方法的步骤包括: O提供DNA分子，所述DNA分子包含可在生物中表达的编码所述融合蛋白GFE-1-rmhTNF α的核苷酸序列； 2)在所述生物中表达所述DNA分子以形成所述融合蛋白GFE-1-rmhTNFα ;和 3)分离或纯化所述融合蛋白GFE-1-rmhTNFα。
8.药物组合物，其特征在于，包括药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂，以及有效量的权利要求1-5任一项的融合蛋白GFE-1-rmhTNF α、或权利要求6的表达载体或表达盒。
9.权利要求1-5任一所述融合蛋白GFE-1-rmhTNFα、或权利要求6的表达载体或表达盒在制备预防或治疗肺部疾病的药物中的应用。
10.权利要求9所述的应用，其`中所述肺部疾病为肺部肿瘤。
全文摘要
本发明属于医药生物技术领域，涉及了一种肺小血管内皮特异性结合多肽GFE-1与重组改构人肿瘤坏死因子rmhTNFα的融合蛋白及其制备方法。将人肿瘤坏死因子氨基端7个氨基酸残基去除，并将Pro8Ser9Asp10突变为Arg、Lys和Arg，同时把Leu157突变为Phe，构建了高效低毒的重组改构人肿瘤坏死因子rmhTNFα。在此基础上，选用通过随机肽库技术筛选分离出的与肺特异性结合的多肽GFE-1，利用基因工程方法将其融合在rmhTNFα的氨基末端，制备的肺小血管内皮特异性结合多肽与rmhTNFα融合蛋白，能在肺组织特异性富集，从而提高肿瘤坏死因子的治疗特异性，减少全身用量，降低毒副反应。
文档编号A61K38/19GK103172753SQ201310095008
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月22日 优先权日2013年3月22日
发明者李维娜, 张阔, 薛晓畅, 李萌, 张存, 郝强, 王增禄, 张伟, 张英起 申请人:中国人民解放军第四军医大学