一种Vimentin-Fc融合蛋白及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物和医药技术领域，具体涉及一种新的重组Vimentin-Fc融合蛋白 及其用途。
【背景技术】
[0002] 日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV)，我国又称乙脑病毒，属于黄 病毒科黄病毒属。JEV引起的流行性乙型脑炎（乙脑)，是一种严重的急性中枢神经系统传 染病，主要流行于东亚、东南亚和南亚，临床以高热、惊厥、意识障碍及脑膜刺激征为主。JEV 每年引起大约3~5万人感染，1~1. 5万人死亡，幸存者中高达50%伴有严重的神经系统后遗 症。乙脑是2004年我国卫生部公布的病死率最高的十大传染病之一，2006年山西等地再次 出现疫情。近年来在一些乙脑非流行地区，如塞班岛、巴基斯坦和澳洲北部也有病例报道， 表明乙脑已经扩大流行，并且有继续扩大流行的趋势。JEV更可作为生物战剂使用，其重要 性不应忽视。
[0003] 目前对JEV的病原学研宄已较深入，病毒基因组和蛋白的结构与功能已基本清 楚。但JEV宿主细胞上受体分子尚未完全明确，JEV的致病机制尚未阐明，正在使用的疫 苗尚不理想，灭活疫苗免疫力不持久、伴随一些副作用，减毒活疫苗有潜在的毒力变异危险 性。JEV的发病机理和抗病毒研宄成为当前研宄的重点和难点。
[0004] Vimentin是目前发现的JEV的重要潜在受体之一，研宄证实，波形蛋白是一个能 够与JEV病毒粒子相互作用的细胞表面分子，并且体外原核表达出的重组波形蛋白竞争性 抑制JEV病毒的感染。因此对于JEV的感染起着关键作用。
[0005] "病毒受体陷阱（virus rec印tor trap)疗法"是指利用人工合成的可溶性病毒受 体来结合病毒，进而阻断病毒与靶细胞膜上的受体结合及随后的病毒内吞。病毒受体陷阱 已被成功应用于实验性小鼠 CVB3心肌炎的治疗，且表现出良好的抗病毒效果。目前国内外 基于病毒受体融合蛋白的"病毒受体陷阱"研宄在其它病毒的研宄中则非常有限。
[0006] 该融合蛋白将JEV受体基因的cDNA融合入人IgGl的Fc区即构建成重组二聚体 蛋白（Vimentin-Fc)，Vimentin-Fc 的 Vimentin 段相当于 IgG 的 Fab 区，因此 Vimentin-Fc 有可能作为JEV感染神经细胞的抑制剂。此融合蛋白的成功研制将为新型抗病毒药物开发 提供思路，并对提高乙型脑炎的防控和治疗效果具有重要意义和实用价值。
【发明内容】
[0007] 为了解决上述的技术问题，本发明的目的在于提供一种Vimentin-Fc融合蛋白， 融合蛋白的氨基端是中间丝的波形蛋白，羧基端是人免疫球蛋白的Fc片段，波形蛋白与Fc 片段之间直接融合或通过连接序列融合；所述Vimentin-Fc融合蛋白为P1-L-P2或P1-P2 形式，其中Pl为Vimentin蛋白全长，P2为人IgG Fc区段，L为连接肽。
[0008] 所述波形蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示。
[0009] 所述人免疫球蛋白的Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
[0010] 所述的连接肽序列为GlySerGly4。
[0011] 本发明另一目的在于提供编码上述Vimentin-Fc融合蛋白的基因序列； 本发明还提供了编码Vimentin全长区段、Linker与Fc融合蛋白的编码基因在融合后 的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示。
[0012] 本发明另一目的在于提供上述Vimentin-Fc融合蛋白在制备用于抗乙型脑炎病 毒感染药物中的应用。
[0013] 本发明的技术方案通过下述具体方法和步骤来实现： a) 根据Vimentin和人IgG Fc基因序列分别设计引物，并分别在人IgG Fc和Vimentin 基因的正向和反向引物中引入Linker蛋白对应的基因序列GGATCAGGCGGGGGTGGG，以便在 随后的融合PCR中在Vimentin和人IgG Fc的融合基因间引入Linker序列； b) 将步骤a)中的设计并合成的引物分别对成神经瘤细胞和人淋巴细胞的cDNA进行 扩增，分别获得Vimentin和人IgG Fc基因片段后，再以两个基因片段为模板，以Vimentin 正向引物和人IgG Fc基因反向引物为上下游引物，进行融合PCR扩增，获得Vimentin-Fc 融合基因； c) 利用融合基因两端引入的和I酶切位点，将融合基因片段引入表达载体 中，获得Vimentin-Fc融合蛋白的重组表达载体； d) 将步骤c)中的重组表达载体转入宿主细胞，筛选获得表达Vimentin-Fc融合蛋白 的工程菌； e) 培养步骤d)获得的工程菌； f) 从步骤e)中的培养产物中以亲和纯化的方式分离Vimentin-Fc融合蛋白，以PBS 溶液进行蛋白复性。
[0014] 所述步骤c)中的表达载体可以选用各种已知的载体，优选为载体pET32a或载体 pPIC9K〇
[0015] 所述步骤d)中的宿主细胞优先为与载体pET32a对应的Rosetta菌或与载体 PPIC9K对应的毕赤酵母菌。
[0016] 本发明一个优选的实施例中，上述Vimentin-Fc融合蛋白的制备方法为：将筛 选得到并测序正确的工程菌在LB培养基中培养条件为37°C，0. 5mM IPTG条件下诱导表 达4小时，9000rpm离心后，收集菌体，超声破碎，用8M尿素裂解过夜，再用Ni-NTA分离 Vimentin-Fc融合蛋白。
[0017] 本发明通过基因克隆和基因重组技术合成一种Vimentin-Fc融合蛋白，该融合 蛋白中的Vimentin部分是Vimentin蛋白全长，通过其乙型脑炎病毒受体的功能来结合 并达到捕获病毒的目的；而Fc部分则起效应功能，如抗体依赖的细胞毒作用和补体依 赖的细胞毒作用，从而达到使捕获的病毒易于机体免疫系统识别和清除的作用。通过将 Vimentin-Fc融合蛋白的基因克隆到一个表达载体中，转化受体细胞得到工程菌，扩大培养 制备Vimentin-Fc融合蛋白。通过蛋白复性，使得Vimentin-Fc融合蛋白具有较高的生物 活性。
【附图说明】
[0018] 图1是本发明中重组质粒的电泳结果示意图；其中泳道M为DNA相对分子质量标 记；泳道1为Vimentin-Fc融合基因菌液PCR结果； 图2是本发明中重组质粒的酶切鉴定结果示意图；其中泳道M为DNA相对分子质量标 记；泳道1为双酶切鉴定重组质粒； 图3是本发明中蛋白的SDS-PAGE检测结果示意图；其中泳道M为蛋白相对分子质量标 准；泳道1为未诱导菌液样品；泳道2为已诱导菌液样品； 图4是本发明中纯化后的蛋白的SDS-PAGE检测示意图；其中泳道M为蛋白相对分子质 量标准；泳道1为未诱导菌液样品；泳道2为已诱导菌液样品；泳道3-7为纯化条带； 图5是本发明不同浓度Vimentin-Fc重组蛋白对JEV复制的影响结果。
【具体实施方式】
[0019] 下面用实施例对本发明做进一步阐述，应当理解为，这些实施例仅用于说明本发 明而非对本发明有任何限制，本领域技术人员在本说明书的启示下对本发明实施中所做的 任何变动都将落在权利要求书的范围内。
[0020] 实施例1 :融合蛋白Vimentin-Fc的载体构建和蛋白表达 Vimentin-Fc融合蛋白的表达过程包括以下步骤：克隆基因；把基因插入表达载体， 将表达载体转化进入Rosetta菌；利用表达载体的Kana抗性筛选出正确转入载体的 Rosetta菌株，培养该菌株，利用IPTG作为诱导剂，诱导蛋白表达，最后从包涵体中分离纯 化Vimentin-Fc蛋白，具体包括： 1、基因克隆 在基因合成的专业公司（上海生工生物工程技术服务有限公司）合成引物，利用引物通 过融合PCR技术从人淋巴细胞和成神经瘤细胞中克隆SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列。其 中1-6是及I的酶切位点；7-1404是编码中间丝的波形蛋白的核苷酸序列，1405-1422 是插入的linker序列，1423-2091是编码IgG Fc片段的核苷酸序列；2091-2099是I 的酶切位点。
[0021] I. I Vimentin 基因的获得 1. 1. 1病毒培养 将培养瓶内中汇合率长至90%的成神经瘤细胞，以PBS溶液洗1遍，再以Iml Trizol 裂解液加入裂解细胞。
[0022] I. I. 2 RNA 提取 将Trizol裂解的细胞静置5min，加200 μ 1氯仿，剧烈震荡5s。室温静置5min，然后 4°C，12000r/min离心15min。取上层水相移至另一个Ep管中。加入500 μ1异丙醇轻柔 颠倒混勾，室温静置5min，13000r/min离心5min弃上清。加入1ml 75%乙醇洗绦沉淀，温 和震荡离心管，使沉淀悬浮。13000r/min离心15min弃上清，室温晾干15min。加入30 μ 1 DEPC 水溶解 RNA，用 spectro photometer 检测 RNA 浓度。
[0023] I. 1. 3 反转录 使用RevertAidFirst Stand cDNA Synthesis Kit，按照使用说明操作，反应体系：
【主权项】
1. 一种Vimentin-Fc融合蛋白，其特征在于：融合蛋白包括中间丝的波形蛋白和人免 疫球蛋白的Fc片段，波形蛋白与Fc片段之间直接融合或通过连接序列融合。
2. 根据权利要求1所述的Vimentin-Fc融合蛋白，其特征在于：所述波形蛋白氨基酸 序列如SEQ ID NO :1所示。
3. 根据权利要求1或2所述的Vimentin-Fc融合蛋白，其特征在于：所述人免疫球蛋 白的Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
4. 编码权利要求1-3中任一项所述Vimentin-Fc融合蛋白的核酸分子。
5. 根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示。
6. 权利要求1所述的Vimentin-Fc融合蛋白在制备抗乙型脑炎病毒感染药物中的应 用。
【专利摘要】本发明公开了一种Vimentin-Fc融合蛋白及其应用，本发明利用分子生物学和细胞生物学技术，构建波形蛋白Vimentin与人IgG的Fc片段的融合蛋白，所述的融合蛋白包括中间丝的波形蛋白和人免疫球蛋白的Fc片段，波形蛋白与Fc片段之间直接融合或通过连接序列融合；本发明提供的融合蛋白可用于乙型脑炎病毒感染的预防或治疗或作为生物制剂用于Vimentin和Fc蛋白功能的相关科学研究。
【IPC分类】A61K38-17, A61K47-48, A61P31-14, C07K19-00, C12N15-62
【公开号】CN104877029
【申请号】CN201510197134
【发明人】张金阳, 靳子安, 宋玉竹, 韩芹芹, 陈强, 夏雪山
【申请人】昆明理工大学
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2015年4月24日