抗猪SC蛋白单克隆抗体及其在制备猪肺炎支原体SIgA抗体ELISA检测试剂盒方面的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物病毒学与动物传染病学检测技术领域，具体涉及抗猪SC蛋白单 克隆抗体及其在应用。
【背景技术】
[0002] 猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)是引起猪支原体肺炎（MPS)，俗 称猪气喘病的病原。猪气喘病是猪群中流行最广、传播最快、最难净化的疫病之一。猪肺 炎支原体通过呼吸道传播，感染呼吸道上皮后导致呼吸道纤毛萎缩、脱落、损坏，上皮细胞 坏死，降低呼吸道黏膜的免疫功能，引起肺部功能损伤，容易产生其它呼吸道病原的继发感 染。
[0003] 研宄表明，对MPS的预防主要通过呼吸道局部的细胞免疫和黏膜免疫。SIgA(分泌 型免疫球蛋白A)是参与黏膜免疫反应的主要效应因子。它们是机体免疫系统中的重要组 成部分，在免疫应答中分别起着重要作用。SIgA能够抗病毒、中和毒素及其它生物活性抗 原，具有广泛的免疫保护作用，但最主要的保护作用是阻止细菌对上皮细胞表面粘附，并清 除入侵的病原。它也是病原体侵入后最先产生的免疫反应，因此，常根据特异性SIgA的检 测作为疾病的早期诊断。SIgA由分泌成份（SC蛋白）、IgA和J链构成。SC蛋白是上皮细 胞上的多免疫球蛋白受体（PlgR)的胞外段部分，是黏膜免疫的第一防线，能够阻止呼吸道 与肠腔中的病毒、细菌、毒素和外来异物等有害物质的入侵。SC蛋白增强了 SIgA的最佳保 护作用，使SIgA对蛋白酶的敏感性下降，黏液更粘稠，增强了黏附作用及防御能力。SC 蛋白是黏膜免疫系统的重要组分，当SC不能正常产生时，会导致SlgA无法正常合成而引 发多种疾病。SC蛋白还是区分血清型IgA和分泌型IgA的标志。
[0004] 抗猪肺炎支原体SIgA是Mhp感染或免疫后在呼吸道首先产生的特异性标志，同时 也反映了疫苗免疫后的保护效果。
[0005] 猪肺炎支原体的诊断方法包括病原检测和血清抗体检测。病原检测方法包括病 原的分离与鉴定，聚合酶链式反应（PCR)、实时定量PCR和原位杂交法，但是这些方法均存 在敏感性和特异性较低、耗时较长、检测难度大、检测结果不确定性、所需设备条件和不适 合活体检测等缺点。血清抗体检测方法包括：微量间接血凝试验（IHA)和酶联免疫吸附试 验（ELISA)等。但是，IHA的检测中存在着检测滴度低、结果与感染的相关性低、凝集终点 判定的主观性较强以及本身固有的技术缺陷等问题，因此IHA在商品猪群的Mhp检测中实 际应用前景有限。现有检测血清抗体的ELISA方法的敏感性和特异性不能满足诊断要求。 另外，目前所用的ELISA方法均是用来检测Mhp IgG抗体。由于猪肺炎支原体感染后，IgG 抗体产生相对较慢；且研宄表明，全身的体液免疫对该病原的免疫保护作用不大。相反，呼 吸道局部产生的黏膜免疫和细胞免疫能产生较好的免疫保护效果。因此，现有血清抗体的 ELISA不适用于该病的早期诊断与主动免疫后免疫指标的监测。
[0006] Rl区是Mhp纤毛黏附蛋白（又称为黏附因子或黏附素）P97的一个重复单元，存在 于纤毛黏附蛋白P97的C端，也是该蛋白主要的抗原决定簇。Mhp纤毛黏附蛋白P97的Rl 区称为P97R1蛋白。Mhp通过粘附感染猪支气管纤毛上皮细胞，继而产生后续的致病作用。 机体针对支原体的粘附能迅速产生相应的黏膜免疫反应。若利用ro7Rl蛋白作为包被原能 在感染后第一时间检测到相应的SIgA反应，适合于该病的早期诊断。且P97蛋白具有种属 特异性，与其它猪支原体不存在血清学交叉干扰。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供分泌抗猪SC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0008] 本发明的另一目的在于提供所述杂交瘤细胞株分泌的抗猪SC蛋白单克隆抗体， 该单克隆抗体具有较高的特异性。
[0009] 本发明的再一目的是提供所述抗猪SC蛋白单克隆抗体在制备猪肺炎支原体SIgA 抗体ELISA检测试剂盒方面的应用。
[0010] 本发明的又一目的是提供猪肺炎支原体SIgA抗体ELISA检测试剂盒，具有较高 的特异性、灵敏度和稳定性，可以区别猪支原体肺炎灭活疫苗免疫和自然感染，用于早期诊 断；还可用于猪支原体肺炎弱毒活疫苗免疫后免疫效果的评估。
[0011] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
[0012] 一种分泌抗猪SC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株4H11，保藏号为：CCTCC NO: C201526。
[0013] 本发明还要求保护所述杂交瘤细胞株分泌的抗猪SC蛋白单克隆抗体及其在制备 猪肺炎支原体SIgA抗体ELISA检测试剂盒方面的应用。
[0014] 猪肺炎支原体SIgA抗体ELISA检测试剂盒，含有通过抗体捕获法制备的包被有猪 肺炎支原体P97R1蛋白的检测板和含有辣根过氧化物酶标记的抗猪SC蛋白单克隆抗体的 酶结合物工作液，所述抗猪SC蛋白单克隆抗体是由权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌。
[0015] 在本发明中，包被有猪肺炎支原体P97R1蛋白的检测板采用如下方法制备：将检 测板先采用抗猪肺炎支原体P97R1蛋白单克隆抗体包被，然后采用猪肺炎支原体P97R1蛋 白包被。
[0016] 优选的技术方案中，所述抗猪肺炎支原体P97R1蛋白单克隆抗体的包被浓度为 1. 5-2. 5 μ g/mL，所述 P97R1 蛋白的包被浓度 1. 5-2. 5 μ g/mL。
[0017] 在本发明中，所述试剂盒还包括阳性对照液，阴性对照液，洗涤液，显色液和终止 液。
[0018] 优选的技术方案中，阳性对照液为人工感染猪肺炎支原体的猪肺泡灌洗液，阴性 对照液为未感染猪肺炎支原体的猪肺泡灌洗液；洗涤液配制方法：取40g NaCl、LOg KCl、 14. 5g Na2HPO4 ·12Η20、1· 2g ΚΗ2Ρ04、2· 5ml吐温-20溶于去离子水，定容至500ml ;显色液包 括显色液A和显色液B，其中显色液A是将21mg3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺溶于5ml无水乙 醇后得到；所述显色液B是将33mg过氧化脲素溶于200ml磷酸盐缓冲液后得到；所述终止 液为2mol/L的硫酸溶液。
[0019] 有益效果：
[0020] 1.高特异性：本试剂盒通过以下三个方面确保检测的高特异性。（1)通过单抗捕 获包被法确保包被抗原P97R1蛋白的纯净性，避免了由大肠杆菌表达制备的P97R1蛋白抗 原中杂蛋白对检测敏感性的影响；（2)检测板使用的包被抗原M7R1蛋白为猪肺炎支原体 的特异性蛋白，避免了待检样品中其它猪支原体或病原的交叉干扰；(3)酶结合物工作液 中活性成分为HRP标记的抗猪SC蛋白单克隆抗体，因此，只有猪肺炎支原体SIgA抗体才能 被检测，避免了待检样品中IgG和IgM抗体的干扰。实验结果也显示本发明试剂盒不会与 猪群常见病毒猪呼吸与繁殖综合征病毒、猪伪狂犬、Hl型猪流感病毒、猪胸膜肺炎、猪鼻支 原体和大肠杆菌SIgA抗体阳性鼻拭子样品产生交叉反应。
[0021] 2.高稳定性与高敏感性：由于不同批次制备的包被抗原的抗原反应能力不同，通 过抗体捕获包被法制备的检测板确保了不同批次产品的高稳定性，而且保证了抗体检测板 中包被抗原的高反应性，大大提高了试剂盒的高敏感性。
[0022] 3.样品取样方便：待检样品为鼻拭子，而非血清，实现了无针化采样，减小了对猪 的应激。
[0023] 4.