可区别猪支原体肺炎灭活疫苗免疫和自然感染：肌肉注射免疫猪支原体肺炎 灭活疫苗后，只产生血清中的特异性IgG抗体，而无法在呼吸道表面产生特异性SIgA抗体。 猪肺炎支原体的自然感染直接发生在呼吸道靶器管，既可在血清中产生特异性IgG抗体， 又可在呼吸道表面产生很强的特异性SIgA抗体（肺炎支原体SIgA抗体）。应用本发明提 供的试剂盒可在猪支原体肺炎灭活疫苗免疫场监测感染情况，而目前市场上的猪肺炎支原 体抗体检测试剂盒是无法做到的。
[0024] 5.可用于肺炎猪支原体感染的早期诊断：猪肺炎支原体P97R1蛋白等黏附素吸附 到猪支气管上皮细胞是猪肺炎支原体感染宿主的首要步骤，抗猪肺炎支原体P97R1蛋白抗 体也是宿主针对猪肺炎支原体不同蛋白产生的抗体中最早的一批；宿主应答呼吸道病原感 染最先产生的免疫反应为呼吸道的黏膜免疫，然后才是血液中的全身免疫。SIgA抗体是黏 膜免疫中最主要的免疫分子。该试剂盒以P97R1蛋白为包被抗原，以呼吸道SIgA抗体为检 测对象，分别从病原感染步骤和宿主免疫反应顺序两方面实现了对猪肺炎支原体感染的早 期诊断。
[0025] 6.可用于猪支原体肺炎弱毒活疫苗免疫后免疫效果的评估：猪支原体肺炎弱毒 活疫苗免疫后较难在血清中产生高滴度的特异性IgG抗体反应，暂无法通过现有商品化的 猪肺炎支原体抗体检测试剂盒对弱毒苗免疫效果进行评估。但弱毒疫苗免疫却可以在呼吸 道产生较高滴度的特异性SIgA抗体，因此，可通过本试剂盒对弱毒疫苗的免疫效果进行间 接评估。
【附图说明】
[0026] 图1是猪SC蛋白基因片段的验证电泳图，其中M-DNA marker，I-SC蛋白PCR产物
[0027] 图2 :⑷重组猪SC蛋白诱导表达SDS-PAGE图· M:蛋白maker. l:BL21-pCold I 诱导前菌体；2:BL21-pCold I诱导后菌体；3:BL21-pCold Ι/SC诱导前菌体；4:BL21-pCold Ι/SC诱导后菌体.（B)重组猪SC蛋白存在形式鉴定.Μ:蛋白maker. l:BL21-pCold I/SC 诱导后裂解液上清；2:BL21-pCold Ι/SC诱导后裂解液沉淀.（C)猪重组SC蛋白纯化鉴定 图.M:蛋白maker. 1:纯化前SDS-PAGE图；2:纯化后SDS-PAGE图.（D)猪重组SC蛋白的 Western blotting 鉴定图。
[0028] 图3是杂交瘤细胞株4H11分泌的抗猪SC蛋白单克隆抗体的特异性鉴定，其中M: 预染蛋白maker，1:猪重组SC蛋白，2:猪天然SC蛋白，3:猪IgA蛋白，4:猪IgG蛋白。
[0029] 图4.本发明制备的抗猪SC蛋白单克隆抗体与商品化单克隆抗体的特异性比较。 A显示本发明制备的抗猪SC蛋白单克隆抗体的特异性；B显示商品化猪SC单克隆抗体的特 异性；M:蛋白Marker ;1 :重组SC蛋白，2:猪IgA蛋白；3:猪IgG蛋白。
[0030] 图5猪支原体肺炎弱毒疫苗免疫后特异性SIgA抗体的检测结果。
[0031] 图6猪支原体肺炎弱毒疫苗免疫后血清中特异性抗体检测。
【具体实施方式】
[0032] 实施例1制备猪重组SC蛋白
[0033] 1.猪SC蛋白的RNA提取
[0034] 样品为猪小肠黏膜上皮细胞、气管上皮细胞或淋巴细胞，或者三者的混合物。
[0035] 猪小肠黏膜上皮（气管上皮）的处理：小心刮取猪小肠黏膜上皮（气管上皮），剪 碎，加入500 μ 1的高压灭菌后的PBS缓冲液（0· 01M，ρΗ7· 2-7. 4)后匀浆；
[0036] 淋巴细胞的处理：取500 μ 1猪血液，加入500 μ 1淋巴细胞分离液（购自上海华精 生物高科技有限公司），离心（2000rpm条件下20min)，沉淀用500 μ 1高压灭菌后的PBS缓 冲液（〇· 01Μ，ρΗ7· 2-7. 4)重悬；
[0037] 将处理后的样品采用常规方法提取细胞总RNA
[0038] 2.扩增猪SC蛋白基因片段
[0039] (1)RT_PCR(所用试剂均购自大连宝生物工程有限公司）：
[0040]
【主权项】
1. 一种分泌抗猪SC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株4H11，保藏号为：CCTCC NO: C201526。
2. 权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌的抗猪SC蛋白单克隆抗体。
3. 权利要求2所述抗猪SC蛋白单克隆抗体在制备猪肺炎支原体SIgA抗体ELISA检测 试剂盒方面的应用。
4. 猪肺炎支原体SIgA抗体ELISA检测试剂盒，所述试剂盒含有通过抗体捕获法制备的 包被有猪肺炎支原体P97R1蛋白的检测板和含有辣根过氧化物酶标记的抗猪SC蛋白单克 隆抗体的酶结合物工作液，所述抗猪SC蛋白单克隆抗体是由权利要求1所述杂交瘤细胞株 分泌。
5. 根据权利要求4所述猪肺炎支原体SIgA抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于包被 有猪肺炎支原体P97R1蛋白的检测板采用如下方法制备：将检测板先采用抗猪肺炎支原体 P97R1蛋白单克隆抗体包被，然后采用猪肺炎支原体P97R1蛋白包被。
6. 根据权利要求5所述猪肺炎支原体SIgA抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于所述抗 猪肺炎支原体P97R1蛋白单克隆抗体的包被浓度为1. 5-2. 5呢/mL，所述P97R1蛋白的包被 浓度 1. 5-2. 5Mg/mL。
7. 根据权利要求4-6之一所述猪肺炎支原体SIgA抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于 所述试剂盒还包括阳性对照液，阴性对照液，洗涤液，显色液和终止液。
8. 根据权利要求7所述猪肺炎支原体SIgA抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于阳性 对照液为人工感染猪肺炎支原体的猪肺泡灌洗液，阴性对照液为未感染猪肺炎支原体的猪 肺泡灌洗液；洗涤液配制方法：取 40g NaCl、1.0g KC1、14. 5g Na2HP04*12H20、1.2g KH2P04、 2. 5ml吐温-20溶于去离子水，定容至500ml ;显色液包括显色液A和显色液B，其中显色液 A是将21mg 3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺溶于5ml无水乙醇后得到；所述显色液B是将33mg 过氧化脲素溶于200ml磷酸盐缓冲液后得到；所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。
【专利摘要】本发明提供抗猪SC蛋白单克隆抗体及其在制备猪肺炎支原体SIgA抗体ELISA检测试剂盒方面的应用，涉及动物病毒学与动物传染病学检测技术领域。所述抗猪SC蛋白单克隆抗体由杂交瘤细胞株4H11分泌，保藏号为：CCTCC NO：C201526。本发明还要求保护该单克隆抗体及其在制备猪肺炎支原体SIgA抗体ELISA检测试剂盒方面的应用。本发明试剂盒具有高特异性、高稳定性、高敏感性，检测样品取样方便，可区别猪支原体肺炎灭活疫苗免疫和自然感染，可用于肺炎猪支原体感染的早期诊断及弱毒活疫苗免疫后免疫效果的评估。CCTCC NO：C20152620150324
【IPC分类】G01N33-577, C12N5-20, C07K16-42
【公开号】CN104877027
【申请号】CN201510239712
【发明人】冯志新, 白昀, 邵国青, 王海燕, 刘茂军, 熊祺琰, 马庆红, 甘源
【申请人】江苏省农业科学院
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2015年5月12日