猪肺炎支原体的lamp检测引物组、检测试剂盒及其检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种猪肺炎支原体的LAMP检测引物组、检测试剂盒及其检测方法。检测引物组包括6条特异性引物；检测试剂盒包括引物液、反应液、DNA聚合酶和对照；试剂盒还可以有显色剂或荧光指示剂；其检测方法是通过提取待检猪肺炎支原体的DNA、采用6条特异性引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在60～65℃对样品DNA模板进行扩增，短时间扩增效率可达到109～1010个拷贝，其鉴定采用反应管内沉淀的浊度变化、加入显色剂观察反应管内颜色变化、利用实时荧光检测仪观察确定待检样本是否含有或为猪肺炎支原体。本发明具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等优点，适于推广应用。
【专利说明】
猪肺炎支原体的LAMP检测引物组、检测试剂盒及其检测方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及分子生物学技术领域，涉及转猪支原体肺炎的快速检测方法，具体是一种猪肺炎支原体的LAMP检测引物组、检测试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002]本发明涉及分子生物学技术领域，涉及转猪支原体肺炎的快速检测方法，具体是一种猪肺炎支原体的LAMP检测引物组、检测试剂盒及其检测方法。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种猪肺炎支原体的LAMP检测引物组、检测试剂盒及基于上述检测引物组和检测试剂盒的猪肺炎支原体的恒温基因扩增检测方法，以解决上述【背景技术】中提出的问题。
[0004]为实现上述目的，本发明提供如下技术方案:
一种猪肺炎支原体的LAMP检测引物组，包括外引物I和外引物2、内引物I和内引物2，正环引物LF和反环引物LB，其核苷酸序列分别如下所示:
外引物1:GTATTTGCCTCGGTCATTT SEQ ID No: I；
外引物2:CCTTTGCTGATTATACCCAG SEQ ID No:2；
内引物1:TCCCTGAATCTCTAACTCGTGAGGGGAGATATTATCAAGTTCC SEQ ID No:3；
内引物2:TCGGCACGAGTTTCAAATCTTAAGAATGGATGTCGATCTTG SEQ ID No:4;
正环引物LF:TCATTATTCGCCAAGTACCG SEQ ID No:5；
反环引物LB:TCGATCTTAGCCAAGAAAGTC SEQ ID No:6。
[0005]—种猪肺炎支原体的LAMP检测试剂盒，包括以下成分:
(1)引物液:含有权利要求1所述的引物组，浓度分别为48?52μΜ外引物1、48?52μΜ外引物2，48?52μΜ内引物1、48?52μΜ内引物2;
(2)反应液:含有12mM dNTP、10 X Isothermal Amplificat1n反应缓冲液、150 mMMgS04水溶液，三者的体积比是7?9:4?6:2;
(3)DNA聚合酶:浓度为7?9UAU;
作为本发明进一步的方案:所述弓丨物液中含有50μΜ外引物1、50μΜ外引物2，50μΜ内引物
1、50μΜ内引物2。
[0006]作为本发明再进一步的方案:所述DNA聚合酶为BstDNA聚合酶，浓度为8υ/μ1。
[0007]作为本发明再进一步的方案:所述反应液中，12mM dNTP: 10 X IsothermalAmplificat1n反应缓冲液:150mM MgS04的体积比为8:5:2。
[0008]作为本发明再进一步的方案:还含有显色剂，所述显色剂为SYBRgreen/HNB染料。
[0009]所述的猪肺炎支原体的检测试剂盒检测猪肺炎支原体的方法，包括如下步骤:
1)待检样品DNA的提取:采用煮沸法提取纯化样品DNA;
2)恒温检测反应:在PCR管中配制反应体系:弓I物液1.8μ1，反应液15.2μ1，DNA聚合酶1μI，待检DNA I?6μ1，用DNase/RNase-Free Distilled Water补齐到25μ1;设置阳性对照反应时，用猪肺炎支原体的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA;将配制好的PCR管混匀后离心，并于60?65°C反应45?90min，并在80°C持续2min;
3)结果判断:通过观察PCR管内沉淀的浊度变化来判断扩增结果，或者肉眼显色剂或者荧光曲线法来判断。
[0010]作为本发明再进一步的方案:所述的猪肺炎支原体的LAMP检测试剂盒检测猪肺炎支原体的方法，步骤I)中所述的煮沸法提取猪肺炎支原体的方法为:
(a)将装有100 uL液体样本的1.5 mL离心管，12000 rpm,离心lmin，去上清；
化)在1.5 mL离心管中加入0.15 g玻璃珠，以及200 yL 5% ChelexlOO；
(c)震荡仪最大转速祸旋5200rpm，祸旋震荡3min，瞬时离心后100°C，5min，12000rpm离心2min;
(d)将上清液转移至新的离心管中，作为模板备用。
[0011]本发明基于环介导等温扩增技术(LAMP法)，根据靶基因设计的六条引物能特异性识别靶基因序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎一环DNA混合物。采用4条特异性引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在60?65 °C对核酸进行扩增反应，反应需在恒温条件下进行，反应时间依据模板DNA质量变化，一般为90 min或更少，在45?90min的短时间内扩增效率可以达到19?1iq个拷贝。加入模板DNA，在60?65°C反应45?90min后，在80°C保温2min，终止反应。在反应中，有核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中Mg离子结合，产生副产物焦磷酸镁的白色沉淀。
[0012]与现有技术相比，本发明的有益效果是:
(1)快速高效:整个扩增只用45?90min即可完成，扩增产量可达19?1iq个拷贝；
(2)操作简便:不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性等繁琐步骤，只需要一部实时荧光检测仪就能反应和检测，条件比较温和；
(3)高特异性:本发明根据设计了六条特异性引物，应用上述六条引物，扩增靶序列的6个区域，具有很强的品系特异性，且非常稳定，形成引物二聚体概率低，保证了反应的顺利进行；
(4)高灵敏度:最低检测极限可达到10个拷贝；
(5)鉴定简便:可通过观察加入颜色变化、是否存在焦磷酸镁沉淀或是否出现“S”型扩增曲线来判断扩增与否，无需电泳等其他任何分析步骤，适合现场检测。
【附图说明】
[0013]图1为实施例2中猪肺炎支原体LAMP引物的灵敏度测试和凝胶电泳图一。
[0014]图2为实施例2中猪肺炎支原体LAMP引物的灵敏度测试和凝胶电泳图二。
[0015]图3为实施例3中猪肺炎支原体LAMP特异性检测曲线图之MHl引物体系下的扩增曲线图。
[0016]图4为实施例3中猪肺炎支原体LAMP特异性检测曲线图之MH2引物体系下的扩增曲线图。
[0017]图5为实施例3中猪肺炎支原体LAMP特异性检测曲线图之MH3引物体系下的扩增曲线图。
[0018]图6为实施例3中猪肺炎支原体LAMP特异性检测曲线图之MH4引物体系下的扩增曲线图。
[0019]图7为实施例3中猪肺炎支原体LAMP特异性检测曲线图之MH5，6，8-12引物体系下的扩增曲线图。
[0020]图8为实施例3中猪肺炎支原体LAMP特异性检测曲线图之MH7引物体系下的扩增曲线图。
[0021]图9为肉眼显色反应体系在猪肺炎支原体LAMP检测体系中的应用图。
【具体实施方式】
[0022]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0023]实施例1
猪肺炎支原体的LAMP检测试剂盒的具体使用
猪肺炎支原体的LAMP检测试剂盒，包括引物液、反应液、DNA聚合酶、对照和显色剂:
(1)引物液:含有50μΜ外引物1、50μΜ外引物2，50μΜ内引物1、50μΜ内引物2，四条引物为: 外引物1:GTATTTGCCTCGGTCATTT(SEQ ID No: I)；
外引物2:CCTTTGCTGATTATACCCAG(SEQ ID No:2)；
内引物1:TCCCTGAATCTCTAACTCGTGAGGGGAGATATTATCAAGTTCC(SEQ ID No:3)；
内引物2:TCGGCACGAGTTTCAAATCTTAAGAATGGATGTCGATCTTG(SEQ ID No:4)。
[0024]正环引物LF:TCATTATTCGCCAAGTACCG(SEQ ID No:5)
反环引物LB:TCGATCTTAGCCAAGAAAGTC (SEQ ID No:6)
(2)反应液:含有12mM dNTP、10 X Isothermal Amplif icat1n反应缓冲液、150mMMgS04水溶液，三者的体积比是8:5:2;
(3)DNA聚合酶:BstDNA聚合酶，浓度为8U/yl ；
(4)对照:含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液；
(5)显色剂:荧光染料或者肉眼显色染料。
[0025]本实施例中，阳性肉眼显色为天蓝色，而阴性和空白对照显色为紫色，天蓝色表明待测样品为猪肺炎支原体，判断为阳性结果。
[0026]实施例2
猪支原体肺炎LAMP反应方法灵敏度的比较:
根据猪支原体肺炎LAMP灵敏度实验方案，将猪支原体肺炎标准株基因组DNA分别稀释到0.4X10—1 ng/yL、0.4X 10—2 ng/yL, 0.4X10—3 ng/yL, 0.4X10—4 ng/yL, 0.4X10—5ng/yL,0 ng/yL总共6个梯度，每个稀释度分别取2 yL进行LAMP实验，以ddH20代替DNA模板作为阴性对照，以人工构建的阳性质粒作为阳性对照，进行LAMP扩增，63°C运行60 min，结果图1-2所示。
[0027]采用不同浓度梯度稀释的猪支原体肺炎样本进行灵敏度测试研究。结果如下:
同时对体系进行最低检测限下的稳定性测试，实验结果表明稳定性良好。
[0028]在筛选出LAMP的扩增体系下，灵敏度测试中，可稳定检测出0.4X10—4 ng/yL浓度的猪肺炎支原体。6通道为空白对照，I通道为0.4 X 10—1 ng/yL; 2通道为0.4 X 10—2 ng/yL，3通道为0.4X10—3呢/^1^，4通道为0.4\10—4 ng/yL，5通道为OX 10—5 ng/yL目标病原体。
[0029]实施例3
猪肺炎支原体特异性LAMP引物的特异性实验
应用优化的反应体系和设计的猪肺炎支原体12套LAMP引物，进行LAMP引物的筛选和反应效果的评估。结果如图3-8所示。
[0030]在12套引物中，引物I，2，3，4有扩增;其他因无扩增或者扩增效果不理想，其中引物体系I具有非常良好的扩增效果，可以作为后续的备选引物进行灵敏度和特异性进一步测试。
[0031 ] 实施例4
显色剂的试剂盒及其检测方法:
如图9所示，根据具体肉眼显色剂研究。本项目采用HNB (4 mM, 25 ul)+Sybr Green(500X ,50 ul)显色液，进行LAMP猪支原体肺炎肉眼显色研究。在反应体系中加入2 uL肉眼显色液至反应管盖子上，63°C运行60 min,反应后颠倒混匀进行肉眼显色，判读结果如下。阳性肉眼显色为天蓝色，而阴性和空白对照显色为紫色，阴阳性判定比较明显，可以作为常规肉眼显色进行，同时灵敏度上与荧光曲线和电泳检测保持一致性。
[0032]I为猪肺炎支原体标准质粒;2浓度为0.4 X 10-2 ng/yL;3浓度为0.4 X 10-3 ng/μL;4浓度为0.4X 10-4 ng/yL;5通道为0.4X10-5 ng/yL;6为空白对照。
[0033]对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
[0034]此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
【主权项】
1.一种猪肺炎支原体的LAMP检测引物组，其特征在于，包括外引物I和外引物2、内引物I和内引物2，正环引物LF和反环引物LB，其核苷酸序列分别如下所示: 外引物1:GTATTTGCCTCGGTCATTT SEQ ID No: I； 外引物2:CCTTTGCTGATTATACCCAG SEQ ID No:2； 内引物1:TCCCTGAATCTCTAACTCGTGAGGGGAGATATTATCAAGTTCC SEQ ID No:3； 内引物2:TCGGCACGAGTTTCAAATCTTAAGAATGGATGTCGATCTTG SEQ ID No:4; 正环引物LF:TCATTATTCGCCAAGTACCG SEQ ID No:5； 反环引物LB:TCGATCTTAGCCAAGAAAGTC SEQ ID No:6。2.猪肺炎支原体的LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括以下成分: (1)引物液:含有权利要求1所述的引物组，浓度分别为48?52μΜ外引物1、48?52μΜ外引物2，48?52μΜ内引物1、48?52μΜ内引物2; (2)反应液:含有12mM dNTP、10 X Isothermal Amplificat1n 反应缓冲液、150 mMMgS04水溶液，三者的体积比是7?9:4?6:2; (3)DNA聚合酶:浓度为7?9UAU。3.根据权利要求2所述的猪肺炎支原体的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述引物液中含有50μΜ外引物1、50μΜ外引物2，50μΜ内引物1、50μΜ内引物2。4.根据权利要求2所述的猪肺炎支原体的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为Asi DNA聚合酶，浓度为8υ/μ1。5.根据权利要求2所述的猪肺炎支原体的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述反应液中，12mM dNTP: 10 X Isothermal Amplif icat1n 反应缓冲液:150mM MgS04 的体积比为 8:5:2。6.根据权利要求2-5任一所述的猪肺炎支原体的LAMP检测试剂盒，其特征在于，还含有显色剂，所述显色剂为SYBR green/HNB染料。7.—种如权利要求2-5任一所述的猪肺炎支原体的LAMP检测试剂盒检测猪肺炎支原体的方法，其特征在于，包括如下步骤: 1)待检样品DNA的提取:采用煮沸法提取纯化样品DNA; 2)恒温检测反应:在PCR管中配制反应体系:引物液1.8μ1，反应液15.2μ1，DNA聚合酶1μI，待检DNA I?6μ1，用DNase/RNase-Free Distilled Water补齐到25μ1;设置阳性对照反应时，用猪肺炎支原体的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA;将配制好的PCR管混匀后离心，并于60?65°C反应45?90min，并在80°C持续2min; 3)结果判断:通过观察PCR管内沉淀的浊度变化来判断扩增结果，或者肉眼显色剂或者荧光曲线法来判断。8.根据权利要求7所述的猪肺炎支原体的LAMP检测试剂盒检测猪肺炎支原体的方法，其特征在于，步骤I)中所述的煮沸法提取猪肺炎支原体的方法为: (a)将装有100 uL液体样本的1.5 mL离心管，12000 rpm,离心lmin，去上清； 化)在1.5 mL离心管中加入0.15 g玻璃珠，以及200 yL 5% ChelexlOO； (c)震荡仪最大转速祸旋5200rpm，祸旋震荡3min，瞬时离心后100°C，5min，12000 rpm离心2min;(d)将上清液转移至新的离心管中，作为模板备用。
【文档编号】C12Q1/04GK106048029SQ201610487954
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月29日
【发明人】熊炜, 方雪恩, 王艳, 李杨, 孔继烈
【申请人】上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心, 复旦大学, 上海速创诊断产品有限公司