预防猪鼻支原体感染细胞的方法及制剂的制作方法

预防猪鼻支原体感染细胞的方法及制剂的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种新的预防猪鼻支原体感染细胞的方法及制剂。具体地，本发明提供了针对猪鼻支原体膜蛋白P37或宿主细胞膜蛋白Annexin?A2的拮抗剂在制备预防猪鼻支原体感染细胞或促细胞迁移的制剂中的应用。本发明主要是发现了猪鼻支原体通过其表面的膜蛋白P37的氨基端22个氨基酸片段与细胞膜蛋白Annexin?A2氨基端25个氨基酸片段相互作用感染细胞，从而可以利用抗P37蛋白抗体、或猪鼻支原体P37的氨基端多肽、或Annexin?A2氨基端多肽或抗宿主细胞膜蛋白Annexin?A2的抗体预防猪鼻支原体感染细胞。
【专利说明】预防猪鼻支原体感染细胞的方法及制剂

【技术领域】
[0001] 本发明涉及预防猪鼻支原体感染细胞的方法及制剂，具体地涉及针对猪鼻支原体 通过其表面的膜蛋白P37的氨基端22个氨基酸片段与细胞膜蛋白Annexin A2相互作用感 染细胞这一发现、而提供的针对猪鼻支原体膜蛋白P37或宿主细胞膜蛋白Annexin A2的拮 抗剂在制备预防猪鼻支原体感染细胞或促细胞迁移的制剂中的应用，以及预防猪鼻支原体 感染细胞或促细胞迁移的方法。

【背景技术】
[0002] 支原体属于原核生物中的柔膜体纲，是自然界存在的、能独立复制的最小 微生物，其大小约为〇. lm，能透过微孔滤膜，存在于宿主细胞的膜表面或内吞到胞内 (Lo SC. Mycoplasmas and AIDS. In:Maniloff J, McElheney, RN, Finch LR, Baseman JB, editors. Mycoplasmas:molecular biology and pathogenesis. Washington, DC:Am Soc Microbiol Press ;1992. p.525-45)。值得注意的是，越来越多的实验数据提示支原体的持 续性慢性感染与肿瘤的发生发展有一定的相关性（Namiki K，Goodison S，Porvasnik S，et al. (2009)Persistent Exposure to Mycoplasma Induces Malignant Transformation of Human Prostate Cells. PLoS ONE 4,e6872 ;Urbanek C, Goodison S，Chang M，et al. (2011) Detection of antibodies directed at M. hyorhinis p37 in the serum of men with newly diagnosed prostate cancer. BMC Cancer 11, 233 ；Yang H，Qu LK，Ma HC，et al. (2010)Mycoplasma hyorhinis infection in gastric carcinoma and its effects on the malignant phenotypes of gastric cancer cells. BMC Gastroenterol 10, 132)。早在1965年，Paton等报道口腔支原体可引起人类二倍体细胞株WI38的染色体异 常，并诱导其发生细胞转化（Paton GR，Jacobs JP，Perkins FT. (1965) Chromosome changes in human Diploid-cell cultures infected with mycoplasmas. Nature 207,43-45)〇 1986年，H. Kotani等发现非凡螺原体可使鼠 NIH3T3细胞及猴肾CV21细胞发生恶性转化 (Kotani H, Phillips D,McGarrity GJ. Malignant transformation of NIH-3T3 and CV-1 cells by a helical mycoplasma, Spiroplasma mirum，strain SMCA. (1986)In Vitro Cell Dev Biol 22,756-762)。引起研究者更多兴趣的是Tsai等的研究工作，他们用发 酵支原体及穿透支原体感染小鼠胚胎细胞系C3H10T1/2,在感染11周后细胞出现恶性改 变，在感染18周之后细胞可在软琼脂上形成集落，在裸鼠体内成瘤（Tsai S，Wear DJ，Shih JW, et al. Mycoplasmas and oncogenesis:persistent infection and multistage malignant transformation. (1995)Proc Natl Acad Sci USA 92, 10197-10201)。 2009 年 Namiki等人研究发现生殖支原体或猪鼻支原体的持续感染可以增加前列腺增生上皮细胞 BPH-1的迀移和侵袭能力，引起细胞核型异常，并可在裸鼠体内成瘤（Namiki K，Goodison S,Porvasnik S，et al. (2009)Persistent Exposure to Mycoplasma Induces Malignant Transformation of Human Prostate Cells. PLoS ONE 4, e6872)。这些研究均说明支原体 感染与肿瘤的发生发展有密切的关系。
[0003] 发明人所在的实验室在上世纪八十年代通过采用肿瘤细胞免疫，制备获得了鼠源 性的抗肿瘤单克隆抗体PD4 (Dong ZW, Wan WH, Li ZF，et al. A monoclonal antibodies PD4 against gastric cancer cell line MGC803. (1985)Shengwu Huaxue Zazhi 2,52-58), 但后续的抗原鉴定工作却发现单抗PD4对应的抗原并非来自于肿瘤细胞，而是来自于 猪鼻支原体，提示猪鼻支原体可能和肿瘤相关。2001年，发明人所在的实验室黄甦等人 采用TO4,通过免疫组织化学染色的方法对包括胃癌及肠癌组织在内的600例组织样本 进行检测，结果显示该抗体与胃癌组织的阳性反应率为56%，而相应的非肿瘤组织阳性 率分别为：慢性浅表型胃炎：28%，胃良性溃疡：30%，肠上皮：37% (Huang S，Li JY，· J, et al. Mycoplasma infections in different human carcinomas. (2001)World J Gastroenterol 7,266-269)。由此可见，胃癌与胃良性疾患的猪鼻支原体感染率有显著的 差异，胃癌组明显高于胃良性疾病各组，并且，随着疾病的加重，猪鼻支原体的感染率也随 之增加。这些结果提示猪鼻支原体的感染可能和疾病以及肿瘤的发生发展存在一定相关 性。此外，来自第四军医大学的曹军等人亦利用同样的方法检测了 95例肾癌组织中的猪 鼻支原体感染情况，发现64. 2%的组织中存在猪鼻支原体感染，而对猪鼻支原体膜表面蛋 白P40蛋白在不同病理类型肾癌组织中的表达分析结果表明，猪鼻支原体感染与人类肾癌 的病理类型不存在某种相关性（曹军，李建平，程伟，等.猪鼻支原体P40蛋白在肾癌组 织中的表达及意义.（2008)西安交通大学学报（医学版）29,556-558)。2010年，杨华等 人用PD4对61例胃癌组织样本和109例卵巢癌组织标本进行了免疫组织化学染色分析， 结果发现，61例胃癌标本中猪鼻支原体感染率为45. 9%，猪鼻支原体感染与胃癌的淋巴结 转移、Lauren 分型和 TNM 分期呈正相关（Yang H，Qu LK，Ma HC，et al· (2010)Mycoplasma hyorhinis infection in gastric carcinoma and its effects on the malignant phenotypes of gastric cancer cells. BMC Gastroenterol 10,132) ;109 例卵巢癌标本 中猪鼻支原体感染率为43. 1% (47/109)。
[0004] 既然肿瘤组织中有较高的猪鼻支原体感染率，那么，猪鼻支原体感染与肿瘤发 生发展之间的关系如何？ 2009年，Namiki等报道了猪鼻支原体慢性感染可以诱导前列 腺良性增生细胞BPH发生染色体核型异常，最终导致其恶性转化（Namiki K，G〇〇dis〇n S,Porvasnik S, et al. (2009)Persistent Exposure to Mycoplasma Induces Malignant Transformation of Human Prostate Cells. PLoS ONE 4, e6872)。猪鼻支原体可以增 强肿瘤细胞系的侵润并抑制细胞的接触抑制（Elkind E，Rechnitzer H，Vaisid T，et al. Mycoplasma hyorhinis upregulates calpastatin and inhibits calpain-dependent proteolysis in SH-SY5Y neuroblastoma cells. (2010)FEMS Microbiol Lett 304, 62-68)。发明人所在实验室的研究发现，猪鼻支原体感染的胃癌细胞MGC803在软琼 脂中形成集落的能力远远大于无支原体感染的细胞（Yang H，Qu LK，Ma HC，et al. (2010) Mycoplasma hyorhinis infection in gastric carcinoma and its effects on the malignant phenotypes of gastric cancer cells. BMC Gastroenterol 10,132)。此夕卜， 多项研究显示猪鼻支原体可以增强肿瘤细胞的体外迁移和侵袭能力。
[0005] 以上临床标本的检测及实验室的相关研究结果均提示，猪鼻支原体感染和肿瘤的 发生发展有密切的关系。但对猪鼻支原体感染细胞的分子机制尚不明确，故缺乏特异性预 防猪鼻支原体感染细胞的方法。


【发明内容】

[0006] 本发明的一个目的在于对猪鼻支原体感染细胞的分子机制进行研究，提供一种特 异性预防猪鼻支原体感染细胞的方法。
[0007] 本发明的另一目的在于提供一种预防猪鼻支原体感染细胞或促细胞迁移的制剂。
[0008] 本发明的另一目的在于提供针对猪鼻支原体膜蛋白P37或宿主细胞膜蛋白 Annexin A2的拮抗剂在制备预防猪鼻支原体感染细胞或促细胞迁移的制剂中的应用。
[0009] 本案发明人通过对猪鼻支原体感染细胞的分子机制研究，发现猪鼻支原体感染哺 乳动物细胞依赖于其表面膜蛋白P37,具体而言是猪鼻支原体通过其表面的膜蛋白P37的 氨基端多肽（更具体而言是膜蛋白P37的氨基端第2-23位氨基酸序列）与细胞膜蛋白 Annexin A2(更具体而言是其氨基端多肽，例如第2-26位氨基酸序列）的相互作用感染细 胞。
[0010] 在此研究结果的基础上，本发明提供了一种预防抗猪鼻支原体感染细胞的方法， 其包括采用针对猪鼻支原体膜蛋白P37的拮抗剂抑制猪鼻支原体与细胞结合。由于拮抗剂 (例如蛋白、核酸、碳水化合物）可以与膜蛋白P37结合并抑制或封闭膜蛋白P37的生物活 性，从而可以用于防止猪鼻支原体与细胞结合而感染细胞。例如，可以用抗猪鼻支原体P37 蛋白的抗体，它与猪鼻支原体P37蛋白的结合可通过封闭作用抑制猪鼻支原体感染细胞。 在本发明的一具体实施方案中，发明人通过实验证实，抗P37抗体不仅可以阻断猪鼻支原 体感染细胞，也可以阻断猪鼻支原体所引起的细胞迁移能力增强。
[0011] 基于上述研究结果，本发明还提供了另外一种预防猪鼻支原体感染细胞的方法， 其包括采用针对宿主细胞膜蛋白Annexin A2的拮抗剂抑制猪鼻支原体与细胞结合。类似 的，由于拮抗剂（例如蛋白、核酸、碳水化合物）可以与蛋白Annexin A2结合并抑制或封闭 蛋白Annexin A2的生物活性，从而可以用于防止猪鼻支原体与细胞结合而感染细胞。
[0012] 例如，可以用抗Annexin A2的抗体封闭宿主细胞上与可与猪鼻支原体结合的分子 Annexin A2,使猪鼻支原体的P37蛋白不能与其结合，进而可以抑制猪鼻支原体感染细胞。 在本发明的一具体实施方案中，发明人通过实验证实，抗Annexin A2抗体处理细胞后猪鼻 支原体与细胞的结合显著减少，可以明显阻断猪鼻支原体感染细胞。
[0013] 再如，可以采用小分子RNA干扰Annexin A2的表达，使细胞不表达或减少Annexin A2的表达，进而可以抑制猪鼻支原体感染细胞。在本发明的一具体实施方案中，发明人通过 实验证实，用小分子RNA干扰Annexin A2表达后猪鼻支原体感染细胞及促进细胞迁移的能 力明显下降。
[0014] 又如，还可以采用P37的氨基端多肽，例如，包含P37蛋白氨基端22个氨基酸片段 LKKLKNFILFSSIFSPIAFAIS(SEQ ID No. 1，P37蛋白氨基端第2-23位氨基酸序列）的多肽，使 其通过与宿主细胞膜蛋白Annexin A2的结合，从而竞争性抑制猪鼻支原体与细胞的结合， 进而预防猪鼻支原体感染细胞。在本发明的一具体实施方案中，发明人通过实验证实，原核 重组表达的氨基端多肽融合蛋白（GST-p37-2-23)可以和胃癌细胞系结合；把氨基端多肽 直接标记荧光素 FITC(FITC-p37-2-23)后得到的FITC-p37-2-23也可以直接和细胞结合； 此外，合成的P37-2-23多肽也可呈浓度梯度依赖性地阻断猪鼻支原体和胃癌细胞AGS的结 合。
[0015] 此外，还可以采用Annexin A2的氨基端多肽，例如，包含Annexin A2蛋白氨基端 25 个氨基酸片段 STVHEILCKLSLE⑶HSTPPSAYGS(SEQ ID No. 2，Annexin A2 蛋白氨基端第 2-26位氨基酸序列）的多肽，使其通过与猪皮支原体膜蛋白P37的结合，从而竞争性抑制猪 鼻支原体与宿主细胞的结合，进而预防猪鼻支原体感染细胞。在本发明的一具体实施方案 中，发明人通过定量PCR实验验证了 Annexin A2氨基端2至25位氨基酸的多肽可通过竞 争性结合阻断猪鼻支原体同细胞Annexin A2的结合，可以有效阻断支原体的感染。
[0016] 本发明中，所述的"针对猪鼻支原体膜蛋白P37的拮抗剂"是指与P37结合并抑制 或封闭P37的生物活性的物质，可以是蛋白、核酸或碳水化合物等。其中所述的"生物活性" 是指P37与宿主细胞结合的生物活性，特别是指与宿主细胞膜蛋白Annexin A2结合的生物 活性。
[0017] 本发明中，所述的"针对宿主细胞膜蛋白Annexin A2的拮抗剂"是指与Annexin A2结合并抑制或封闭Annexin A2的生物活性的物质，可以是蛋白、核酸或碳水化合物等。 其中所述的"生物活性"是指Annexin A2与猪鼻支原体结合的生物活性，特别是指与猪鼻 支原体膜蛋白P37结合的生物活性。
[0018] 本发明中，所述"结合"是指猪鼻支原体与细胞的相互作用并在此基础上感染细 胞。发明人发现猪鼻支原体能够通过其表面的膜蛋白P37,具体地说是通过P37蛋白氨基 端的第2至23位氨基酸的多肽片段，与细胞膜蛋白Annexin A2的结合，具体地说是通过与 Annexin A2蛋白氨基端的第2至26位氨基酸多肽片段的结合，进而实现猪鼻支原体与细 胞的结合并感染细胞。根据这一发现，不管是采用P37或Annexin A2的单抗或多抗封闭相 应的抗原，还是采用P37或Annexin A2氨基端的多肽以竞争抑制P37蛋白与Annexin A2 的结合，还是通过敲除细胞Annexin A2的表达，凡是能够阻断P37蛋白与Annexin A2的结 合，都可以实现预防猪鼻支原体感染细胞并促进细胞迁移的目的。
[0019] 从而，本发明还提供了针对猪鼻支原体膜蛋白P37或宿主细胞膜蛋白Annexin A2 的拮抗剂在制备预防猪鼻支原体感染细胞或促细胞迁移的制剂中的应用。
[0020] 根据本发明的具体实施方案，本发明中，针对猪鼻支原体膜蛋白P37的拮抗剂为 与猪鼻支原体膜蛋白P37结合、从而抑制猪鼻支原体与细胞结合的试剂。
[0021] 根据本发明的具体实施方案，本发明中，针对猪鼻支原体膜蛋白P37的拮抗剂为 与猪鼻支原体膜蛋白P37氨基端第2-23位氨基酸结合、从而抑制猪鼻支原体与细胞结合的 试剂。
[0022] 根据本发明的具体实施方案，本发明中，针对猪鼻支原体膜蛋白P37的拮抗剂为 抗猪鼻支原体膜蛋白P37或其抗原性片段的特异性单克隆抗体或多克隆抗体。这里所述的 "特异性"是指抗体能结合于本发明的P37或其片段，优选那些能与本发明的P37结合但不 识别且不与其它非相关抗原分子结合的抗体。本领域普通技术人员已知，所述的单克隆抗 体或多克隆抗体可以参照现有技术通过P37的全长或其抗原性的片段作为抗原进行免疫 获得。
[0023] 根据本发明的另一具体实施方案，针对猪鼻支原体膜蛋白P37的拮抗剂为包含宿 主细胞膜蛋白Annexin A2氨基端氨基酸序列（例如Annexin A2氨基端第2-26位氨基酸 序列）的多肽或蛋白。其中，包含Annexin A2蛋白氨基端第2-26位氨基酸序列的多肽或 蛋白，例如可以是SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列组成的多肽，也可以是在SEQ ID No. 2所 示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且与SEQ ID No. 2所示的氨基 酸序列组成的多肽具有相同功能（这里是指与猪鼻支原体膜蛋白P37结合的功能）的衍生 多肽或蛋白。所述多肽或蛋白可不带有或带有重组标签或荧光素等标记物。本领域普通技 术人员已知，这样的多肽或蛋白可以参照现有技术通过原核重组表达融合蛋白来制备，或 者通过化学方法合成来制备。
[0024] 根据本发明的具体实施方案，本发明中，针对宿主细胞膜蛋白Annexin A2的拮抗 剂为与Annexin A2结合、从而抑制猪鼻支原体与细胞结合的试剂。
[0025] 根据本发明的具体实施方案，本发明中，针对宿主细胞膜蛋白Annexin A2的拮抗 剂为与Annexin A2氨基端第2-26位氨基酸结合、从而抑制猪鼻支原体与细胞结合的试剂。
[0026] 在本发明的一具体实施方案中，针对宿主细胞膜蛋白Annexin A2的拮抗剂为针对 Annexin A2或其抗原性片段的特异性单克隆抗体或多克隆抗体。这里所述的"特异性"是 指抗体能结合于本发明的Annexin A2或其片段，优选那些能与本发明的Annexin A2结合 但不识别且不与其它非相关抗原分子结合的抗体。本领域普通技术人员已知，所述的单克 隆抗体或多克隆抗体可以参照现有技术通过Annexin A2的全长或其抗原性的片段作为抗 原进行免疫获得。
[0027] 在本发明的另一具体实施方案中，针对宿主细胞膜蛋白Annexin A2的拮抗剂为干 扰Annexin A2表达的小分子干扰RNA。优选地，所述小分子干扰RNA具有SEQ ID No. 3所 示核苷酸序列。所述小分子干扰RNA可以通过诸如化学合成等现有技术方法来制备。
[0028] 在本发明的另一具体实施方案中，针对宿主细胞膜蛋白Annexin A2的拮抗剂为包 含猪鼻支原体膜蛋白P37氨基端氨基酸序列（例如P37氨基端第2-23位氨基酸序列）的 多肽或蛋白。其中，包含P37蛋白氨基端第2-23位氨基酸序列的多肽或蛋白，例如可以是 SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列组成的多肽，也可以是在SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列中 经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且与SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列组成的多肽 具有相同功能（这里是指与宿主细胞膜蛋白Annexin A2结合的功能）的衍生多肽或蛋白。 所述多肽或蛋白可不带有或带有重组标签或荧光素等标记物。本领域普通技术人员已知， 这样的多肽或蛋白可以参照现有技术通过原核重组表达融合蛋白来制备，或者通过化学方 法合成来制备。
[0029] 根据本发明的具体实施方案，本发明中，抑制猪鼻支原体感染细胞、抑制猪鼻支 原体促进细胞迁移中所说的细胞，可以为胃癌细胞MGC803、胃癌细胞AGS、人肾上皮细 胞293T、人胃粘膜永生化上皮细胞GES-1、非洲绿猴肾细胞C0S-7或人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)等。
[0030] 此外，本发明还提供了一种预防猪鼻支原体感染细胞或促细胞迁移的制剂，其包 含针对猪鼻支原体膜蛋白P37或宿主细胞膜蛋白Annexin A2的拮抗剂。所述的针对猪鼻 支原体膜蛋白P37的拮抗剂或针对宿主细胞膜蛋白Annexin A2的拮抗剂如前所述。
[0031] 综上所述，本发明针对猪鼻支原体通过其表面的膜蛋白P37的氨基端与细胞膜蛋 白Annexin A2氨基端相互作用感染细胞这一发现，提供了新的预防猪鼻支原体感染细胞或 促细胞迁移的方法及相关制剂，可以从阻止或抑制P37与Annexin A2结合的角度预防猪鼻 支原体感染细胞。

【专利附图】

【附图说明】
[0032] 图1A :显示猪鼻支原体感染胃癌细胞MGC803和AGS且呈时间一浓度梯度依赖性 的细胞ELISA实验结果。
[0033] 图1B :显示GST-p37与胃癌细胞MGC803和AGS结合呈时间一浓度梯度依赖性的 ELISA实验结果。
[0034] 图1C :显示抗p37抗体能阻断猪鼻支原体感染293T、GES-1、C0S-7和HUVEC等非 肿瘤细胞的PCR检测结果。
[0035] 图1D :显示抗p37抗体阻断猪鼻支原体和胃癌细胞结合的ELISA实验结果。
[0036] 图1E :显示抗p37抗体阻断猪鼻支原体和胃癌细胞结合的免疫荧光染色结果。
[0037] 图1F :显示抗p37抗体可以阻断猪鼻支原体的促胃癌细胞迁移作用的Transwell 实验结果。
[0038] 图2A :显示支原体p37氨基端多肽融合蛋白GST-p37-2-23能和胃癌细胞MGC803、 AGS结合，并呈时间一浓度梯度依赖性的细胞ELISA结果。
[0039] 图2B :显示支原体氨基端多肽FITC-p37-2-23可以和胃癌细胞膜表面结合的激光 共聚焦检测结果。
[0040] 图2C :显示p37氨基端多肽p37-2-23可阻断支原体感染细胞的PCR检测结果。
[0041] 图3A :MALDI-T0F质谱分析结果显示p37和ANXA2相互作用。
[0042] 图3B :双向免疫共沉淀实验证实p37和ANXA2的相互作用。
[0043] 图3C :显示p37和ANXA2存在共定位的激光共聚焦免疫荧光检测结果。
[0044] 图3D :显示p37的氨基端多肽介导p37和ANXA2的相互作用的GST pull-down检 测结果。
[0045] 图3E :显示ANXA2的氨基端介导p37和ANXA2相互作用的GST pull-down检测结 果。
[0046] 图 3F :显示 GST-p37 以及 GST-p37-2-23 和 ANXA2-2-26 的相互作用的 ELISA 实验 结果。
[0047] 图3G :显示p37的氨基端多肽p37-2-23阻断GST-p37和ANXA2的相互作用的 ELISA实验结果。
[0048] 图3H:显示ANXA2氨基端2至26位的多肽片段可以阻断猪鼻支原体的感染的定 量PCR检测结果。
[0049] 图4A :显示抗ANXA2抗体阻断猪鼻支原体与胃癌细胞结合的激光共聚焦免疫荧光 染色实验结果。
[0050] 图4B :显示抗ANXA2抗体阻断猪鼻支原体感染293T、GES-1、C0S-7和HUVEC等非 肿瘤细胞的PCR检测结果。
[0051] 图4C :显示抗p37抗体可以阻断猪鼻支原体的促胃癌细胞迁移作用的Transwell 实验结果。
[0052] 图4D :显示ANXA2的RNAi干扰效果的Western Blot检测结果。
[0053] 图4E :显示干扰ANXA2表达后抑制猪鼻支原体感染细胞的PCR检测结果。
[0054] 图4F :显示干扰ANXA2后阻断猪鼻支原体和胃癌细胞结合的激光共聚焦免疫荧光 染色检测结果。
[0055] 图4G:显示干扰ANXA2表达后抑制阻断猪鼻支原体的促胃癌细胞迁移作用的 Transwell实验结果。
[0056] 图5A :胃癌组织中有猪鼻支原体的感染（p37蛋白免疫组化检测的代表图）。
[0057] 图5B :胃癌组织猪鼻支原体感染与各种临床病理参数的相关性分析。
[0058] 图5C :猪鼻支原体感染胃癌患者的生存期短（Kaplan-Meier曲线分析）。

【具体实施方式】
[0059] 下面结合具体实施例进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域 的常规条件或按照制造厂商所建议的条件进行。实施例中所用各原始试剂和材料均可商购 获得。
[0060] 实施例1、猪鼻支原体感染哺乳动物细胞依赖于其表面膜蛋白p37
[0061] 本实施例中，通过文献报道的常用细胞ELISA实验证实猪鼻支原体和p37蛋白均 可以分别与细胞结合。
[0062] 细胞ELISA实验即首先将胃癌细胞MGC803和AGS(这些细胞源自中国医学科学 院肿瘤细胞库）接种于96孔板进行培养48小时，然后分别加入1 X 103(XU，1 X 104(XU， 1 x 105(XU/mL的猪鼻支原体以感染细胞。感染持续24小时后，用PBS洗三遍，用0. 4%戊 二醛室温固定lOmin，用5%奶粉/PBST室温封闭2h，然后依次常规加入抗猪鼻支原体抗体、 酶标二抗及底物液，最后用ELISA READER测0D492nm。读数越高表明支原体与细胞的结合越 多。结果显示，猪鼻支原体和细胞结合呈浓度梯度依赖性（图1A)。
[0063] 接下来，采用上述1 X 104(XU/mL的猪鼻支原体分别感染胃癌细胞MGC803和AGSO、 24、48小时，细胞ELISA结果显示猪鼻支原体和细胞结合呈时间梯度依赖性（图1A)。
[0064] 另外，用原核细胞重组表达纯化的GST-p37处理胃癌细胞后，发现重组表达的 GST-p37蛋白也可以和胃癌细胞系结合，而且这种结合也呈明显的时间和浓度梯度依赖性 (图1B)。这提示猪鼻支原体感染胃癌细胞很可能是通过其表面膜蛋白p37所介导的。
[0065] 上述原核细胞重组表达蛋白GST-P37通过常规基因重组、细菌表达及蛋白纯化的 方法获得。简言之，即将通过突变、能在细胞及细菌表达全长P37蛋白的cDNA(见Wen-Bin Liu,Jian-Zhi Zhang, Bei-Hai Jiang, et al: Lipoprotein p37 from mycoplasma hyorinis inhibiting mammalian cell adhesion J Biomedical. Science 2006 13:323-331)与原核 表达质粒PGEX4T-1进行重组，将重组质粒导入大肠杆菌BL21培养于LB培养基中，待0D_ 达到1. 0时加入IPTG进行诱导表达，4小时后收集细菌，经溶菌酶处理及超声裂解后离心， 取其上清用GST凝胶柱纯化，获得的GST-P37融合蛋白用蛋白电泳对其纯度进行鉴定和定 量。
[0066] 用多聚酶链式反应实验（PCR)扩增细胞中猪鼻支原体特异性DNA片段，结果揭示， 猪鼻支原体不仅可以感染肿瘤细胞系，也可以感染293T、GES-l、C0S-7和HUVEC等非肿瘤细 胞系（所用细胞除胃粘膜永生化细胞GES-1由北京市肿瘤防治研究所提供外，其余非肿瘤 细胞均源自美国ATCC细胞库）（图1C)。
[0067] 为了揭示p37在猪鼻支原体感染细胞中是否发挥重要作用，本实施例中采用了 P37抗体阻断的方法，即先用抗P37的兔抗体与猪鼻支原体反应2小时，随后把反应混合液 加到细胞培养体系中，培养24小时后弃去培养液，收集细胞并提取DNA，然后用PCR扩增细 胞中猪鼻支原体特异性DNA片段。结果显示，5 μ g/mL的抗p37抗体可以明显阻断猪鼻支原 体对细胞的感染（图1C)。其中，抗P37兔抗体的制备采用常规方法，简言之用细菌表达获 得的P37蛋白与福氏佐剂充分混合后常规皮下多点免疫家兔，共免疫三次，每次免疫至少 间隔四周，在末次免疫后第十至十四天采血，待血自然凝固后离心获得抗血清，然后用蛋白 A凝胶柱纯化，获得兔抗P37蛋白抗体。
[0068] 细胞ELISA实验结果也揭示抗p37抗体可以明显阻断猪鼻支原体对细胞的感染， 并且这种阻断作用呈浓度梯度依赖性（图1D)。
[0069] 免疫荧光染色结果也显示抗p37抗体可以明显阻断猪鼻支原体感染胃癌细胞系 (图 1E)。
[0070] 抗p37抗体不仅可以阻断猪鼻支原体感染细胞，也可以阻断猪鼻支原体所引起的 细胞迁移能力增强（图1F)。
[0071] 以上实验结果充分表明，猪鼻支原体感染细胞是依赖于其表面膜蛋白P37的，用 抗P37的抗体可以阻断猪鼻支原体感染细胞。
[0072] 实施例2、p37的氨基端多肽阻断支原体感染细胞
[0073] p37的氨基端序列（p37蛋白序列的第2位至第23位氨基酸序列，记做p37-2-23 : LKKLKNFILFSSIFSPIAFAIS，SEQ ID No. 1)是猪鼻支原体所特有的，而在其他类型的支原体 中并不存在（Dudler R, Schmidhauser C, Parish Rff, et al. A mycoplasma high-affinity transport system and the in vitro invasiveness of mouse sarcoma cells. (1988)The ΕΜΒ0 Journal 7, 3963-3970)。
[0074] 为了探讨p37的氨基端在介导猪鼻支原体感染细胞中所发挥的作用，本实施例中 用GST融合蛋白通过ELISA检测了其与细胞的结合。结果发现，原核重组表达的氨基端多 肽融合蛋白（GST-p37-2-23)可以和胃癌细胞系结合，并呈时间和浓度梯度依赖性，而缺失 氨基端多肽的P37蛋白（GST-p37- Λ 2-23)并不能够和细胞结合（图2A)。
[0075] 本实施例中GST-p37-2-23和GST-p37- Λ 2-23制备方法与上述GST-P37蛋白的 制备相类似。在制备GST-p37-2-23时，首先合成能编码Ρ37第2至23位多肽片段的正义 寡核苷酸（5, -GATCCGAGGTAGCTTTTATGCTCAAAAAATTTAAAAATTTTATTC TATTTTCATCTATATTT TCGCCAATAGCATTTGCTATATCA JGA ￡-3'，SEQ ID No. 4)和反义寡核苷酸（5, -AATTC TC：A TGATATAGCAAATGCTATTGGCGAAAATATA GATGAAAATAGAATAAAATTTTTAAATTTTTTGAGCATAAAAGCT ACCTC ￡-3'，SEQ ID No. 5)，将二者退火形成双链寡核苷酸后再与原核表达质粒pGEX4T-l 进行重组（寡核苷酸链中用黑体标出的为内切酶粘性末端序列）、表达及纯化。在制备缺 失P37氨基端22个氨基酸片段的融合蛋白GST-p37- Λ 2-23时，采用相应的引物（正义 链引物为：5' -CGC GGATCC TTTGCTATATCATGTTC-3'，SEQ ID No. 6 ;反义链引物为：5' -CCG GAATTC TC'A TAATGGCTTTTTCAT-3'，SEQ ID No. 7 ;黑体为引入的酶切位点）通过常规 PCR 扩增获得缺少编码P37氨基端22个氨基酸的P37 cDNA，经过常规酶切和与pGEX4T-l进行 重组、表达及纯化。
[0076] 把氨基端多肽直接标记荧光素 FITC (FITC-p37-2-23)后进行免疫荧光染色，结果 显示，FITC-p37-2-23也可以直接和细胞结合（图2B)。
[0077] 此外，合成的p37-2-23多肽可呈浓度梯度依赖性地阻断猪鼻支原体和胃癌细胞 AGS的结合，在30 μ Μ时达到了接近完全阻断的效果，而序列与p37-2-23多肽无关的对照肽 (序列为：DSGE⑶FLAEGGGVR，SEQ ID No. 8)没有阻断作用（图2C)。
[0078] 以上结果表明，p37的氨基端多肽介导了其与细胞的结合，猪鼻支原体感染细胞依 赖于P37的氨基端多肽，用p37的氨基端多肽可以通过与细胞的结合竞争性抑制猪鼻支原 体的感染。
[0079] 实施例3、p37蛋白和宿主ANXA2蛋白分别通过氨基端发生相互作用
[0080] 为了寻找和p37相互作用的宿主细胞表面受体分子，本实施例首先通过GST pull-down技术将细胞裂解液中和p37相互作用蛋白进行富集，然后通过SDS-PAGE及考马 斯亮蓝染色找出差异条带（图3A中箭头所示），将该条带通过MALDI-T0F质谱分析鉴定，发 现其多肽片段为Annexin A2序列（图3A)，表明p37的相互作用蛋白为Annexin A2(以下 称 ANXA2)。
[0081] 为了验证p37和Annexin A2之间存在相互作用，本实施例中，还分别用p37和 ANXA2抗体（该抗体购自Novus Biotechnology公司）通过常规双向免疫共沉淀实验，结果 表明用P37抗体进行免疫沉淀可以将ANXA2沉淀下来，反之用ANXA2抗体也能将P37沉淀 下来，说明P37和ANXA2确实存在相互作用（图3B)，在实施例中也检测了 P37与Annexin 蛋白家族其他分子，如ANXA1和ANXA4的相互作用，发现p37和它们并不存在相互作用（图 3B)。
[0082] 在本实施例中还通过特异抗体分别将P37蛋白和ANXA2蛋白分别标记为绿色和红 色，通过激光共聚焦免疫荧光实验以更为直观地判断两种蛋白之间是否存在相互作用，二 者如果存在共同的细胞定位，则绿色和红色重叠显示黄色。结果表明，P37和ANXA2在细胞 膜上存在共定位（图3C)。
[0083] 为了确定P37蛋白与ANXA2相互作用的具体区域，在本实施例中，还进行了 GST pull-down实验。结果显示，p37的N端多肽融合蛋白GST-p37-2-23可以与ANXA2直接相 互作用，而缺失N端多肽的p37融合蛋白GST-p37- Λ 2-23和ANXA2并不能相互作用（图 3D)，说明ρ37的Ν端多肽介导了 ρ37蛋白与ΑΝΧΑ2的相互作用。
[0084] ΑΝΧΑ2属于钙离子依赖型的膜联蛋白家族，在人类中这一蛋白家族共有12个成 员。每个成员在蛋白质组成上的区别主要体现在其氨基端前26个氨基酸上，每个成员 氨基端特有的序列决定了其具有其他家族成员所不具有的某些特定功能（Gerke V，Moss S.Annexins:form structure to function. (2002)Physiol Rev 82, 331-371)。比如ANXA2 的N端结构域介导其与其他蛋白质相互作用。ANXA2的N端也包含一些磷酸化修饰位点， 这些位点被磷酸化激活后，都介导ANXA2的特定生物学功能。比如，ANXA2第23位酪氨酸 磷酸化可以促使其从胞浆里向细胞膜外表面转运，进而促进相关生物学功能的发挥（Gerke V，Moss S.Annexins:form structure to function. (2002)Physiol Rev 82,331-371)。
[0085] 通过体外GST pull-down实验，本发明发现ANXA2的N端结构域介导其与p37结 合，缺失N端25个氨基酸的ANXA2蛋白并不能够和p37发生直接相互作用（图3E)。此外，固 相结合实验揭示，ANXA2的N端结构域和p37以及p37的N端多肽均存在直接相互作用（图 3F)，而且p37的N端多肽可以竞争性地阻断ANXA2与p37的结合（图3G)。本实施例通过体 外GST pull-down实验，发现完整的ANXA2融合蛋白（His-ANXA2-FL)能够同GST-p37相互 作用，而缺少氨基端25个氨基酸的ANXA2融合蛋白（His-ANXA2- Λ 2-26)不能与GST-p37 相互作用，表明ΑΝΧΑ2氨基端从第2至26的25个氨基酸多肽片段介导了 ΑΝΧΑ2与ρ37的 结合（图3Ε)。
[0086] 为了进一步证明ρ37和ΑΝΧΑ2的结合是通过它们氨基端的多肽相互作用实现的， 本实施例还采用ELISA方法，用合成的ΑΝΧΑ2氨基端第2至26位的多肽包被96孔板（以 无关多肽SEQ ID No. 8作为对照），然后分别加入含有完整p37的GST-p37融合蛋白、只含 有P37氨基端多肽的GST-p37-2-23融合蛋白及缺失氨基端的GST-p37- Λ 2-23融合蛋白， 在反应一定时间后常规先后加入抗GST鼠单抗、抗鼠酶标二抗及底物液，然后在酶标仪上 进行度数检测，结果表明，GST-p37和GST-p37-2-23均能与包被的ΑΝΧΑ2氨基端多肽特异 结合（与对照肽不结合），而缺少氨基端的Ρ37融合蛋白GST-p37- Λ 2-23与ΑΝΧΑ2氨基端 多肽不结合，这进一步证明了 ΑΝΧΑ2的氨基端结构域和ρ37以及ρ37的氨基端多肽均存在 直接相互作用（图3F)。
[0087] 采用类似的ELISA实验，用ΑΝΧΑ2的融合蛋白His-ANXA2包被96孔板，分别加入 GST-p37和GST-p37-2-23或同时加入GST-p37和GST-p37-2-23,检测结果表明，p37氨基 端多肽融合蛋白GST-p37-2-23可以竞争性地阻断GST-p37与ANXA2的结合（图3G)，进一 步佐证了 P37与ANXA2的结合是通过其氨基端的22个多肽片段实现的。
[0088] 在证明猪鼻支原体通过p37氨基端同Annexin A2氨基端2至26位氨基酸的多肽 (STVHEILCKLSLE⑶HSTPPSAYGS，SEQ ID No. 2)结合后，为证明 Annexin A2 氨基端 2 至 26 位 氨基酸的多肽可通过竞争性结合阻断猪鼻支原体同细胞Annexin A2的结合，进而抑制支原 体感染细胞，本案通过常规定量PCR对这一设想进行了验证。实施方法是常规培养肿瘤细 胞MGC803,然后在加入猪鼻支原体的同时分别加入不同浓度的Annexin A2氨基端2至26 位氨基酸的多肽（分别为4 μ m和20 μ m)，以不加小肽或无关肽做对照，在感染细胞24小时 后洗去细胞培养上清，常规方法、提取DNA并通过定量PCR扩展p37基因。结果参见图3H， 图中①为未加入支原体、②为加只入支原体、③为加入支原体同时加入无关对照肽、④和⑤ 为加入支原体同时加入不同浓度的Annexin A2氨基端2至26位氨基酸的多肽（分别为 4μπι和20 μ m)。结果表明，Annexin A2氨基端2至26位氨基酸的多肽（SEQ ID No. 2)可 以有效阻断支原体的感染。
[0089] 上述实验从不同角度充分证明了猪鼻支原体蛋白p37和宿主细胞蛋白ANXA2的相 互作用是是分别通过他们氨基端的直接结合实现的。
[0090] 实施例4、ANXA2在介导猪鼻支原体感染细胞中是必需的
[0091] 为了探讨ANXA2在介导猪鼻支原体感染细胞中的作用，本实施例中，在无支原体 感染的细胞培养液中先加入抗ANXA2抗体（5μ g/ml)，以封闭ANXA2蛋白。反应2小时后 再加入猪鼻支原体感染细胞，在培养24小时后分别用免疫荧光染色实验及PCR扩增支原体 DNA的方法检测猪鼻支原体感染细胞的情况。实验结果显示，抗ANXA2抗体处理细胞后，猪 鼻支原体与细胞的结合显著减少（表现为荧光染色看不到支原体或PCR扩增支原体DNA的 量显著减少，图4A和图4B)，说明用ANXA2抗体处理细胞可以明显阻断猪鼻支原体感染细 胞，表明ANXA2介导了猪鼻支原体对细胞的感染。
[0092] 采用常规的细胞迁移实验（即Transwell chamber实验，可参考文献Hua Yang, Like Qu，Huachong Ma，et al:Mycoplasma hyorhinis infection in gastric carcinoma and its effets on the malignant phenotypes of gastric cancer cells. 2010, BMC Gastroenterology 10:132)检测表明，细胞在先经ANXA2抗体处理后，可 显著降低由猪鼻支原体引起的促细胞迁移作用（图4C)。
[0093] 为了进一步验证ANXA2在介导猪鼻支原体在感染细胞中的作用，本实施例中还采 用小分子 RNA (干扰序列为：AAGGACAU-UAUUUCGGACACA，SEQ ID No. 3)干扰 ANXA2 的表达， 使细胞不表达或减少ANXA2的表达（图4D)，然后通过上述类似方法检测猪鼻支原体对细 胞的感染情况，结果发现，用小分子RNA干扰ANXA2表达后猪鼻支原体感染细胞的能力明显 下降（图4E，用PCR检测细胞的支原体DNA ;图4F，用免疫荧光检测细胞的猪鼻支原体蛋白 P37)。采用细胞迁移实验发现，干扰ANXA2表达后猪鼻支原体的及促进细胞迁移能力也明 显下降（图4G)。这进一步证明了猪鼻支原体是通过ANXA2感染细胞的。
[0094] 上述实验证明，通过抗ANXA2抗体封闭细胞膜上与可与猪鼻支原体结合的分子， 进而可以抑制猪鼻支原体感染细胞，从而本发明提供了一种可以预防猪鼻支原体感染细胞 的新的方法。
[0095] 实施例5、人胃癌组织的猪鼻支原体感染的检测及与患者预后的相关性分析 [0096] 为了检测胃癌组织中猪鼻支原体的感染与临床病理参数与患者预后的关系，发明 人用常规的免疫组织检测方法，用特异性抗P37蛋白抗体PD4对339例有随访资料的胃癌 组织进行了免疫组织化学的检测（方法见Yang H，Qu LK，Ma HC，et al. (2010)Mycoplasma hyorhinis infection in gastric carcinoma and its effects on the malignant phenotypes of gastric cancer cells. BMC Gastroenterol 10,132)。图 5A 提供的检测 结果阳性的代表性图片，5A中的1是用无关抗体的阴性对照，2至6分别表示对不同分化程 度的胃癌组织的组化检测阳性结果。
[0097] 图5B是胃癌组织猪鼻支原体感染与各种临床病理参数的相关性分析，结果显示， 在339例组织中，134例为染色阳性，阳性率为39. 5% (134/339)，支原体感染检测阳性的病 例，其肿瘤侵犯血管及发生远处转移的比例明显高于检测阴性的病例，说明支原体感染与 肿瘤侵犯血管及发生远处转移呈明显正相关（P值分别为〇. 021和0. 029,图5B)。
[0098] 用Kaplan-Meier曲线分析显示，支原体阳性的胃癌患者预后较支原体阴性的患 者差，生存期短（P值为〇. 040,图5C)。
[0099] 上述研究结果表明，人胃癌组织中存在猪鼻支原体的感染，有猪鼻支原体感染的 患者其预后差，生存时间短。
【权利要求】
1. 针对猪鼻支原体膜蛋白P37或宿主细胞膜蛋白Annexin A2的拮抗剂在制备预防猪 鼻支原体感染细胞或促细胞迁移的制剂中的应用。
2. 根据权利要求1所述的应用，其中，针对猪鼻支原体膜蛋白P37的拮抗剂为与猪鼻支 原体膜蛋白P37结合、从而抑制猪鼻支原体与细胞结合的试剂。
3. 根据权利要求1所述的应用，其中，针对猪鼻支原体膜蛋白P37的拮抗剂为与猪鼻支 原体膜蛋白P37氨基端第2-23位氨基酸结合、从而抑制猪鼻支原体与细胞结合的试剂。
4. 根据权利要求1所述的应用，其中，针对猪鼻支原体膜蛋白P37的拮抗剂为抗猪鼻支 原体膜蛋白P37或其抗原性片段的特异性单克隆抗体或多克隆抗体，或者包含Annexin A2 氨基端第2-26位氨基酸的多肽或蛋白。
5. 根据权利要求1所述的应用，其中，针对宿主细胞膜蛋白Annexin A2的拮抗剂为与 Annexin A2结合、从而抑制猪鼻支原体与细胞结合的试剂。
6. 根据权利要求1所述的应用，其中，针对宿主细胞膜蛋白Annexin A2的拮抗剂为与 Annexin A2氨基端第2-26位氨基酸结合、从而抑制猪鼻支原体与细胞结合的试剂。
7. 根据权利要求1所述的应用，其中，针对宿主细胞膜蛋白Annexin A2的拮抗剂为包 含猪鼻支原体膜蛋白P37氨基端第2-23位氨基酸的多肽或蛋白。
8. 根据权利要求1所述的应用，其中，针对宿主细胞膜蛋白Annexin A2的拮抗剂为： 针对Annexin A2或其抗原性片段的特异性单克隆抗体或多克隆抗体，或者干扰Annexin A2 表达的小分子干扰RNA;优选地，所述小分子干扰RNA具有SEQ ID No. 3所示核苷酸序列。
9. 根据权利要求1所述的应用，其中，所述细胞为哺乳动物细胞，例如，为胃癌细胞 MGC803、胃癌细胞AGS、人肾上皮细胞293T、人胃粘膜永生化上皮细胞GES-1、非洲绿猴肾细 胞C0S-7或人静脉内皮细胞。
10. -种预防猪鼻支原体感染细胞或促细胞迁移的制剂，其包含针对猪鼻支原体膜蛋 白P37或宿主细胞膜蛋白Annexin A2的拮抗剂。
【文档编号】A61K39/40GK104138598SQ201410404272
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2014年8月15日 优先权日:2014年8月15日
【发明者】寿成超, 段红英, 陈玲, 杨华, 孟麟 申请人:北京市肿瘤防治研究所