专利名称：一种用于清除细胞培养中支原体污染的试剂及其使用方法
技术领域：
本发明涉及细胞培养中支原体污染的清除试剂及其使用方法。
背景技术：
支原体是细胞培养中最常见的污染物，会干扰实验结果，但是由于支原体的二分裂时间为1-6小时，所以支原体污染培养细胞后初期不易察觉。在细胞培养中常见的污染支原体来源于口腔支原体(M. orale)、精氨酸支原体(M. arginini)、猪鼻支原体 (M. hyorhinis)和莱氏无胆甾原体(A. Iaidlawii)。培养细胞污染支原体后依不同支原体的抗原性及生化代谢差别而会有不同的致病性，但大致表现是相同的，最开始引起实验者注意的是培养的细胞生长变缓慢，之后培养液很快就变黄，而且细胞生长周期延长，继而在某次传代后出现细胞间大量黑点，细胞空泡化，很多类似凋亡、坏死的细胞，细胞固缩，最终完全死亡。在细胞培养中，肿瘤系细胞一般为3η 如体，分裂时比2η体的原代细胞染色质组蛋白合成量更多。而精氨酸作为组蛋白的主要构成成分，在肿瘤系细胞分裂时所需的精氨酸量更大，所以相较于原代细胞，对支原体更敏感，所以黑点现象在肿瘤系细胞中更容易出现，出现后也更明显。而原代细胞污染支原体后的表现主要是生长缓慢，细胞变形，细胞内出现明显的空泡，逐渐出现巨细胞化及拉网现象，另外，有些悬浮生长的细胞在支原体污染后，除了生长缓慢外，经常出现细胞团集现象。支原体分类属于柔膜体纲，支原体目，其中能通过0.22um滤膜污染培养细胞的有支原体科和无胆留原体科两个科，包括支原体属的约80个种和无胆留原体的8个种中的某些种。由于支原体分类与细菌有差异，故一般用于细菌的抗生素并不能很好的杀灭抑制支原体，由于其种类繁多，故需选用有针对性的广谱抗生素联合用药才能达到最大限度的清除和抑制，而目前并没有研究出能够系统消除支原体污染的试剂及方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于清除细胞培养中支原体污染的试剂及其使用方法， 能够系统的检测出支原体的种类并将清除，可以有效的清除支原体污染，并不会对细胞的本身代谢带来影响。所述一种用于清除细胞培养中支原体污染的试剂，其特征在于1. 一种用于清除细胞培养中支原体污染的试剂，其特征在于所述试剂由A液、B液等体积混合或A液、B液、 C液等体积混合而成，其中A液由半合成截短侧耳素衍生物和0. OlMPBS混合而成，混合液中半合成截短侧耳素衍生物的质量-体积百分比浓度为0. 5% -1. 5% ；B液由喹诺酮类衍生物和0. OlMPBS混合而成，混合液中喹诺酮类衍生物质量_体积百分比浓度为0.5% -1.5% ；C液由四环素类衍生物和0. OlMPBS混合而成，混合后四环素类衍生物的质量_体积百分比浓度为0. 25% -0. 75% ；所述A液、B液等体积混合后，混合液中半合成截短侧耳素衍生物、喹诺酮类衍生物的质量比为3 2 ；所述A液、B液、C液等体积混合后，混合液中半合成截短侧耳素衍生物、喹诺酮类衍生物和四环素类衍生物的质量比为3 2 1。所述半合成截短侧耳素衍生物选用延胡索酸泰妙菌素或沃尼妙林或瑞他帕林。所述喹诺酮类衍生物选用抗生素恩诺沙星或麻保沙星或单诺沙星。所述四环素类衍生物选用多西环素或二甲胺四环素。一种使用权利要求1所述的清除试剂清除细胞培养中支原体污染的方法，其特征在于包括以下步骤a、支原体检测(1)提取细胞培养物中基因组DNA ；(2)将步骤⑴中提取的基因组DNA放入待测试管，使用设计的支原体检测简并引物，使用PCR方法扩增提取的基因组DNA目的片段，所述检测引物为支原体属正向引物5，ACACCATGGGAGYTGGTAAT3，反向引物5，CTTCWTCGACTTYCAGACCCAAGGCAT3，无胆甾原体属正向引物5，GAAAGGGAGGGAGCCGTCAAG3，
反向引物5，TGCCAAGGCATCCACTGTGTG3，；(3)将扩增的PCR产物以2%琼脂糖凝胶上样电泳，凝胶成像系统观察，根据产物片段判断支原体种类；b、清除剂配置(1)取 8gNaCl，0. 2gKCl，2. 87gNa2HP04 · 12H20,0. 27gKH2P04 溶于 1000ml 去离子水或三蒸水，经过121°C高温103Kpa高压灭菌，制成0. OlMPBS溶液，在4°C环境下冷藏备用；(2)取半合成截短侧耳素衍生物溶于0. OlMPBS配制成半合成截短侧耳素衍生物质量-体积百分比浓度为0. 5% -1. 5%的A液，在超静台内经0. 22um 一次性滤器过滤除菌，分装，避光在-20°C冻存；取喹诺酮类衍生物溶于0. OlMPBS配制成喹诺酮类衍生物质量-体积百分比浓度为0. 5% -1. 5%的B液，在超静台内经0. 22um 一次性滤器过滤除菌， 分装，避光在-20°C冻存；取四环素类衍生物溶于0. OlMPBS配制成四环素类衍生物的质量-体积百分比浓度为0. 25%-0. 75%的C液，在超静台内经0. 22um —次性滤器过滤除菌， 分装，避光在-20°C冻存；C、支原体清除步骤A中所检测出来的支原体种类为同属支原体，将配置好的A液、B液等体积混合，然后加入完全培养基中稀释500倍，培养7-14天，其中细胞培养环境为温度为37°C、5% C02,20% 02、100%湿度；在培养过程中，每24h换液一次，换液时用0. OlMPBS清洗培养容器；步骤A中所检测出来的支原体种类为不同属的混合支原体，A液、B液、C液等体积混合制成清除试剂，然后加入完全培养基中稀释333倍，培养7-14天，其中细胞培养环境为温度为37°C、5% C02,20% 02、100%湿度；在培养过程中，每24h换液一次，换液时用0. OlMPBS 清洗培养容器。在步骤a中，观察成像系统，如果观察到结果中的PCR产物片段单一，则直接纯化PCR产物后测序，检测出支原体的种类；如果PCR产物片段为混合污染，多个条带阳性，则将阳性片段克隆入T载体，挑取单克隆后测序，检测出支原体的种类。所述A液、B液等体积混合后，混合液半合成截短侧耳素衍生物和喹诺酮类衍生物的质量比为3 2;所述A液、B液、C液等体积混合后，混合液半合成截短侧耳素衍生物、喹诺酮类衍生物和四环素类衍生物的质量比为3 2 1。本发明中A液、B液均为无色透明液体，C液则为淡黄色透明液体。将A液和B液按照培养截短侧耳素类药物与氟喹诺酮类药物浓度比为3 2混合稀释后，加入细胞培养基中，可以预防培养细胞的支原体污染。A液、B液、C液注意避光保存，低温冷冻。-20°C避光保存2年有效，_70°C保存可长期保存，4°C避光一周有效，常温4 有效。使用过程中也尽量避光。使用本发明试剂和方法，如污染不严重，可在一周内显效。如污染严重，至少要处理两周，还可以用来预防污染。经治处理的污染细胞，治疗周期完成后，细胞间无黑点，细胞生长周期回复正常，细胞形态正常，无团聚生长。预防处理的培养基使用，在已经清除污染源的情况下，可最大限度预防污染再次发生。
图1是实施例一、二、三中使用清除试剂前后对照图，A是A549细胞治疗前的荧光照片，A’是A549细胞治疗治疗后的荧光照片；B是SH-SY细胞治疗前的荧光照片，B’是SH-SY细胞治疗后的荧光照片；C是HELA细胞的治疗前的荧光照片，C，是HELA细胞治疗后的荧光照片；图2是实施例一、二、三PCR产物电泳图，图3是实施例二测序图，图4是实施例四中细胞接种及药物加入示意图，图5是实施例四中反应产物熔解曲线，图6是实施例五中细胞接种及药物加入示意图，图7是实施例五内参照片段的反应曲线图，图8是实施例五中目的片段的反应曲线图，图9是实施例五中反应产物片段熔解曲线图。
具体实施例下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例一所述一种用于清除细胞培养中支原体污染的试剂由A液、B液等体积混合而成，其中A液由泰妙菌素和0. OlMPBS混合而成，混合液中泰妙菌素的质量_体积百分比浓度为1.5% ；B液由恩诺沙星和0. OlMPBS混合而成，混合液中恩诺沙星质量_体积百分比浓度为；将A液、B液等体积混合，混合液中泰妙菌素与恩诺沙星质量比为3 2。
一种用以上试剂清除支原体污染的方法，选用A549细胞(人肺腺癌细胞)的培养作为实验对象，其具体步骤如下a、支原体检测(1)A549细胞的细胞培养基以DMEM高糖培养基(美国公司GIBCO公司生产)加入10% FBS (国产四季清胎牛，无支原体级)配成完全培养基，将细胞培养于37°C，5% C02， 20% 02，相对湿度100%的无菌温箱；按蛋白酶K法快速提取基因组DNA ；(2)取步骤(1)中提取的基因组DNA放入待测试管中，使用设计的支原体检测引物，使用PCR方法扩增，所述检测引物为支原体属正向引物5，ACACCATGGGAGYTGGTAAT3，反向引物5，CTTCWTCGACTTYCAGACCCAAGGCAT3，无胆甾原体属正向引物5，GAAAGGGAGGGAGCCGTCAAG3，反向引物5，TGCCAAGGCATCCACTGTGTG3，；可以同时将两种引物加入同一个待测试管，也可以分开放入两个待测试管。(3)将扩增的PCR产物以2%琼脂糖凝胶在TAE缓冲液中电泳后，凝胶成像系统观察，观察结果如图2，图2中1、2、3泳道为A549细胞检测条带，样品分别采集自不同的培养者，显示和312bp处的无胆甾原体，分别代表莱氏无胆甾原体(Achol印Iasma laidlawii)禾口中度无胆留原体(Acholeplasma mocurum)；b、清除剂配置(1)取 8gNaCl，0. 2gKCl，2. 87gNa2HP04 · 12H20,0. 27gKH2P04 溶于 1000ml 去离子水或三蒸水，经过121°C高温103Kpa高压灭菌，制成0. OlMPBS溶液，在4°C环境下冷藏备用(2)分别配置A液、B液；取1. 5g(1500mg)泰妙菌素溶于IOOml 0. OlMPBS溶液中，在超静台内经0. 22um 一次性滤器过滤除菌制成泰妙菌素质量-体积百分比浓度为 1.5%的A液，分装，-20°C冻存；取Ig(IOOOmg)恩诺沙星溶于IOOml 0. 01MPBS，在超静台内经0. 22um 一次性滤器过滤除菌制成恩诺沙星质量-体积百分比浓度为1 %的B液，分装，_20°C冻存；C、支原体清除将配置好的A液、B液等体积混合制成清除试剂，其混合后泰妙菌素和恩诺沙星的浓度比为3 2。将清除试剂加入A549细胞的完全培养基中稀释500倍，稀释后泰妙菌素和恩诺沙星的质量-体积比分别为15ug/ml和lOug/ml，其中，每24h换液一次，换液时用0. OlMPBS洗瓶壁至少一次，处理2周，待治疗过程中A549细胞长满至瓶底面积的 60% -80%时，胰酶消化传代，转新瓶培养2周。取上述AB液清除试剂处理后的A549细胞，再次进行PCR检测。未再检测出阳性片段。将污染的未经清除试剂处理的A549细胞用hoechst33258蓝色染料染色(染料使用浓度300nM)，荧光显微镜观察照相，如图1中的照片A。同时将处理后的A549细胞也用 h0echst33258蓝色染料(300nM)染色观察照相，见图1中照片A’。胞浆中的绿色荧光为针对 LC3 (microtubule associated protein 1 light chain 3-LC3)的一抗，FITC 标记的二抗免疫荧光显色。将A549细胞治疗前的荧光照片图A与治疗后的荧光照片图A’对比，其结果为治疗前可见细胞内由支原体污染激活的吞噬泡；治疗后细胞生理状态明显恢复，细胞内无明显空泡聚集。实施例二所述一种用于清除细胞培养中支原体污染的试剂由A液、B液等体积混合而成，其中A液由沃尼妙林和0. OlMPBS混合而成，混合液中沃尼妙林的质量_体积百分比浓度为1.5% ；B液由麻保沙星和0. OlMPBS混合而成，混合液中麻保沙星的质量_体积百分比浓度为；A液、B液等体积混合，混合液中沃尼妙林与麻保沙星质量比为3 2。一种用以上试剂清除支原体污染的方法，选用SH-SY-5Y细胞(人神经母细胞瘤) 的培养作为实验，其具体步骤如下a、支原体检测(1) SH-SY-5Y细胞的细胞培养基以DMEM高糖培养基(GIBC0公司生产)加入10% FBS (国产四季清太牛，无支原体级)配成完全培养基，将细胞培养于37°C，5% C02,20% 02，相对湿度100%的无菌温箱；按蛋白酶K法快速提取基因组DNA ；(2)取步骤(1)中提取的基因组DNA分别放入两个待测试管中，并在两个PCR反应管中分别放入下面两种支原体检测引物，使用PCR方法扩增，其检测引物序列为支原体属正向引物5，ACACCATGGGAGYTGGTAAT3，反向引物5，CTTCWTCGACTTYCAGACCCAAGGCAT3，无胆甾原体属正向引物5，GAAAGGGAGGGAGCCGTCAAG3，反向引物5，TGCCAAGGCATCCACTGTGTG3，； (3)分别取两个试管中的PCR产物以2 %琼脂糖凝胶在TAE缓冲液中电泳，凝胶成像系统观察，PCR产物成像结果如图2，图2中7、8、9泳道为SH-SY细胞检测条带，第7道未见无胆留原体片段，第8道可见472bp肺支原体(M. Pulmonis)片段产物，第9道为空白对眧.
/、、、 G) PCR产物切胶回收后，直接连接PMD19T载体，连接产物转染实验室制备的感受态大肠杆菌DH5ci株，涂板37°C培养过夜挑克隆，小提质粒酶切鉴定后送测序；(5)测序结果如图3，结果证实SH-SY-5Y细胞为实验鼠呼吸道来源的支原体 (Mycoplasma pulmonis)污染；b、清除剂配置(1)取 8gNaCl，0. 2gKCl，2. 87gNa2HP04 · 12H20,0. 27gKH2P04 溶于 1000ml 去离子水或三蒸水，经过121°C高温103Kpa高压灭菌，制成0. OlMPBS溶液，在4°C环境下冷藏备用⑵)分别配置A液、B液；取1.5g(1500mg)泰妙菌素溶于IOOml 0. OlMPBS溶液中，在超静台内经0. 22um 一次性滤器过滤除菌制成泰妙菌素质量-体积百分比浓度为 1.5%的A液，分装，-20°C冻存；取Ig(IOOOmg)麻保沙星溶于IOOml 0. 01MPBS，在超静台内经0. 22um 一次性滤器过滤除菌制成麻保沙星质量-体积百分比浓度为1 %的B液，分装，-20°C冻存；C、支原体清除将配置好的A液、B液等体积混合制成清除试剂，其混合后沃尼妙林和麻保沙星的质量比为3 2。将清除试剂加入SH-SY-5Y细胞的完全培养基中稀释500倍，稀释后沃尼妙林和麻保沙星的质量-体积比分别为15ug/ml和10ug/ml，每24h换液一次，换液时用0. OlMPBS洗瓶壁至少一次，处理2周，待治疗过程中SH-SY-5Y细胞长满至瓶底面积的 60% -80%时，胰酶消化传代，转新瓶培养，处理1-2周。取上述AB液清除试剂处理后的中SH-SY细胞，提取基因组DNA，再次进行PCR 检测。未再检测出阳性片段，将污染的未经清除试剂处理的SH-SY-5Y细胞做荧光染色 hoechst和PI双染，hoechst染料5ug/ml，PI染料0. 5ug/ml (含RNAase)，荧光显微镜观察照相，如图1中的照片B，用同种方法检测处理后的SH-SY-5Y细胞观察照相，见图1中的照片B，。将SH-SY细胞治疗前的荧光照片B与治疗后的荧光照片B’对比，其结果为治疗前PI染色可见细胞外花环状排列的支原体集落；经治疗后PI染色未见明显异常结构。实施例三所述一种用于清除细胞培养中支原体污染的试剂由A液、B液、C液等体积混合而成，其中A液由沃尼妙林和0. OlMPBS混合而成，混合液中沃尼妙林的质量_体积百分比浓度为1.5% ；B液由恩诺沙星和0. OlMPBS混合而成，混合液中恩诺沙星的质量_体积百分比浓度为；C液由二甲胺四环素和0. OlMPBS混合而成，混合液中二甲胺四环素的质量_体积百分比浓度为0.5% ；A液、B液、C液等体积混合，混合液中沃尼妙林、恩诺沙星、二甲胺四环素质量比为—种用以上试剂清除支原体污染的方法，选用HELA细胞的培养作为实验，其具体步骤如下a、支原体检测(I)HELA细胞的细胞培养基以DMEM高糖培养基(GIBC0公司生产)加入10% FBS(国产四季清太牛，无支原体级)配成完全培养基，将细胞培养于37°C，5% C02,20% 02，相对湿度100%的无菌温箱；按蛋白酶K法快速提取基因组DNA ；(2)将步骤(1)中提取的基因组DNA放入待测试管，然后向试管中加入经标记的支原体检测引物，使用PCR方法扩增，所述检测引物为支原体属正向引物5，ACACCATGGGAGYTGGTAAT3，反向引物5，CTTCWTCGACTTYCAGACCCAAGGCAT3，无胆甾原体属正向引物5，GAAAGGGAGGGAGCCGTCAAG3，反向引物5，TGCCAAGGCATCCACTGTGTG3，；(3)将扩增的PCR产物以2%琼脂糖凝胶在TAE缓冲液中电泳，凝胶成像系统观察，观察结果如图2，图2中，4，5，6泳道为HELA细胞检测条带，第4道所示为莱氏无胆甾原体(A. Laidlawii)产物，第5道和第6到所示为混合污染的支原体属产物；G) PCR产物切胶回收后，直接连接PMD19T载体，连接产物转染实验室制备的感受态大肠杆菌DH5ci株，涂板37°C培养过夜挑克隆，小提质粒酶切鉴定后送测序；
(5)检测结果，测序证实HELA细胞为混合污染，既有血清来源的无胆留原体也有实验动物来源的支原体多种；b、清除剂配置(1)取 8gNaCl，0. 2gKCl，2. 87gNa2HP04 · 12Η20，0· 27gKH2P04 溶于 1000ml 去离子水或三蒸水，经过121°C高温103Kpa高压灭菌，制成0. OlMPBS溶液，在4°C环境下冷藏备用(2)分别配置A液、B液、C液；取1. 5g(1500mg)泰妙菌素溶于IOOml 0. OlMPBS 溶液中，在超静台内经0. 22um 一次性滤器过滤除菌制成泰妙菌素质量-体积百分比浓度为1.5%的A液，分装，-20°C冻存；取Ig(IOOOmg)恩诺沙星溶于IOOmlO. 01MPBS，在超静台内经0. 22um 一次性滤器过滤除菌制成恩诺沙星质量-体积百分比浓度为1 %的B液， 分装，-20°C冻存；取二甲胺四环素0. 5g(500mg)溶于IOOml 0. 01MPBS，在超静台内经 0. 22um 一次性滤器过滤除菌配制成二甲胺四环素质量-体积百分比浓度为0. 5%的C液， 分装，-20°C冻存。C、支原体清除将配置好的A液、B液、C液等体积混合制成清除试剂，其混合后泰妙菌素、恩诺沙星和二甲胺四环素的质量比为3 2 1。将配置好的清除试剂加入HELA细胞的完全培养基中稀释333倍，稀释后泰妙菌素、恩诺沙星和二甲胺四环素的质量-体积比分别约为 15ug/ml、10ug/ml和5ug/ml。每24h换液一次，换液时用0. OlMPBS洗瓶壁至少一次，处理 2周，待治疗过程中HELA细胞长满至瓶底面积的60% -80%时，胰酶消化传代；传代时收集消化下来的细胞，特别注意需吹散成单细胞悬液，然后用离心洗涤的方法传代。(分散的支原体沉降系数小，常规的转速下可以留在上清中弃去，减少培养物中的荷菌量，故转速宜低速500-800r/min)弃去离心后的培养基后，以0. OlMPBS重悬细胞沉淀，吹勻后再次离心，重复至少1次，洗涤后的细胞转入新瓶培养(旧瓶弃去)。经上述处理程序后的HELA细胞恢复快速生长，细胞周期约Mh，故需频繁传代，同上述方法传代，换液交替处理，至首次用药处理的第14天终止。取上述ABC液清除试剂处理后的HELA细胞，再次进行PCR检测。未再检测出阳性片段。将污染的未经清除试剂处理的HELA细胞做hoechst33258染料染色(染料使用浓度300nM)，荧光显微镜观察照相，如图1中的照片C，同时将处理后的HELA细胞做 hoechst33258染料(300nM)染色观察照相，如图1中的照片C’。将HELA细胞的治疗前的荧光照片C和治疗后的荧光照片C’作为对比，其结果为 治疗前白色箭头示细胞核外蓝染小点，为支原体阳性染色，图片中横线为20um;治疗后视野背景清晰，无核外蓝染小点，支原体染色阴性。实施例四本发明通过本实施例对于A液、B液、C液单独效力进行检测，其具体操作如下(1) 分别配置A液、B液、C液；取1.5g(1500mg)泰妙菌素溶于IOOml 0. OlMPBS溶液中，在超静台内经0. 22um 一次性滤器过滤除菌制成泰妙菌素质量-体积百分比浓度为1. 5%的A液， 分装，-20°C冻存；取Ig(IOOOmg)恩诺沙星溶于IOOmlO. 01MPBS，在超静台内经0. 22um—次性滤器过滤除菌制成恩诺沙星质量-体积百分比浓度为的B液，分装，-20°C冻存；取二甲胺四环素0. 5g(500mg)溶于IOOml 0. 01MPBS，在超静台内经0. 22um—次性滤器过滤除菌配制成二甲胺四环素质量-体积百分比浓度为0. 5%的C液，分装，-20°C冻存。
10
(2)将实施例二中污染单一种支原体的SH-SY细胞换用新鲜完全培养基培养；(3)将A、B、C液分别设4个2倍稀释的浓度梯度，加入完全培养基，即终浓度分别为，A 液 16、8、4、2ug/ml ；B 液 16、8、4、2ug/ml ；C 液 8、4、2、lug/ml。(4)将上述污染的细胞接种入12孔板，依浓度梯度分别用药物处理，处理组合方式见附图4;(5)处理一周后，如实施例1方法提取基因组DNA，用于PCR检测；(6)将测序构建的PMD19T载体质粒做10倍的梯度稀释；(7)用检测引物做荧光定量PCR检测支原体模版的拷贝数，其检测引物为(正向引物 5，GGAGCTGGTAATGCCCAAAGT 3，反向引物5，ACGTTCTCGTAGGGATACCTTG3，)(8)采用绝对定量法绝对定量以质粒测浓度后作为标准品，10倍梯度稀释，共6 个梯度，根据插入片段后质粒分子量算出质粒模板mol浓度，再换算成实际模板分子数，根据反应标准曲线(图幻计算待测样品的实际模板分子数，数据用单因素方差分析进行统计处理。结果见数据统计表1。表权利要求
1.一种用于清除细胞培养中支原体污染的试剂，其特征在于所述试剂由A液、B液等体积混合或A液、B液、C液等体积混合而成，其中A液由半合成截短侧耳素衍生物和0. OlMPBS混合而成，混合液中半合成截短侧耳素衍生物的质量-体积百分比浓度为0.5%-1.5% ；B液由喹诺酮类衍生物和0. OlMPBS混合而成，混合液中喹诺酮类衍生物质量-体积百分比浓度为0.5% -1.5% ；C液由四环素类衍生物和0. OlMPBS混合而成，混合液中四环素类衍生物的质量-体积百分比浓度为0. 25% -0. 75% ；
2.根据权利要求1所述的一种用于清除细胞培养中支原体污染的试剂，其特征在于 所述A液、B液等体积混合后，混合液中半合成截短侧耳素衍生物、喹诺酮类衍生物的质量比为3 2;所述A液、B液、C液等体积混合后，混合液中半合成截短侧耳素衍生物、喹诺酮类衍生物和四环素类衍生物的质量比为3 2 1。
3.根据权利要求1所述的一种用于清除细胞培养中支原体污染的试剂，其特征在于 所述半合成截短侧耳素衍生物选用延胡索酸泰妙菌素或沃尼妙林或瑞他帕林。
4.根据权利要求1所述的一种用于清除细胞培养中支原体污染的试剂，其特征在于 所述喹诺酮类衍生物选用抗生素恩诺沙星或麻保沙星或单诺沙星。
5.根据权利要求1所述的一种用于清除细胞培养中支原体污染的试剂，其特征在于 所述四环素类衍生物选用多西环素或二甲胺四环素。
6.一种使用权利要求1所述的清除试剂清除细胞培养中支原体污染的方法，其特征在于包括以下步骤a、支原体检测(1)提取细胞培养物中基因组DNA；(2)将步骤(1)中提取的基因组DNA放入待测试管，使用设计的支原体检测简并引物， 使用PCR方法扩增提取的基因组DNA目的片段，所述检测引物为支原体属正向引物 5，ACACCATGGGAGYTGGTAAT3，反向引物 5，CTTCWTCGACTTYCAGACCCAAGGCAT3‘无胆甾原体属正向引物5，GAAAGGGAGGGAGCCGTCAAG3，反向引物5，TGCCAAGGCATCCACTGTGTG3，；(3)将扩增的PCR产物以2%琼脂糖凝胶上样电泳，凝胶成像系统观察，根据产物片段判断支原体种类；b、清除剂配置(1)取8gNaCl，0. 2gKCl，2. 87gNa2HP04 · 12Η20，0· 27gKH2P04 溶于 1000ml 去离子水或三蒸水，经过121°C高温103Kpa高压灭菌，制成0. OlMPBS溶液，在4°C环境下冷藏备用；(2)取半合成截短侧耳素衍生物溶于0.OlMPBS配制成半合成截短侧耳素衍生物质量-体积百分比浓度为0.5%-1.5%的A液，在超静台内经0. 22um—次性滤器过滤除菌，分装，避光在-20°C冻存；取喹诺酮类衍生物溶于0. OlMPBS配制成喹诺酮类衍生物质量-体积百分比浓度为0. 5% -1. 5%的B液，在超静台内经0. 22um—次性滤器过滤除菌，分装，避光在-20°C冻存；取四环素类衍生物溶于0. OlMPBS配制成四环素类衍生物的质量-体积百分比浓度为0. 25% -0. 75%的C液，在超静台内经0. 22um—次性滤器过滤除菌，分装，避光在-20°C冻存；C、支原体清除步骤A中所检测出来的支原体种类为同属支原体，将配置好的A液、B液等体积混合， 然后加入完全培养基中稀释到一定浓度，培养7-14天，其中细胞培养环境的温度为37°C、 5% C02,20% 02、100%湿度；在培养过程中，每24h换液一次，换液时用0. OlMPBS清洗培养容器；步骤A中所检测出来的支原体种类为不同属的混合支原体，A液、B液、C液等体积混合制成清除试剂，然后加入完全培养基中稀释一定浓度，培养7-14天，其中细胞培养环境为温度为37°C、5% C02,20% 02、100%湿度；在培养过程中，每24h换液一次，换液时用 0. OlMPBS清洗培养容器。
7.根据权利要求6所述的一种使用权利要求1所述的清除试剂清除细胞培养中支原体污染的方法，其特征在于在步骤a中，观察成像系统，如果观察到结果中的PCR产物片段单一，则直接纯化PCR产物后测序，检测出支原体的种类；如果PCR产物片段为混合污染，多个条带阳性，则将阳性片段克隆入T载体，挑取单克隆后测序，检测出支原体的种类。
8.根据权利要求6所述的一种使用权利要求1所述的清除试剂清除细胞培养中支原体污染的方法，其特征在于所述A液、B液等体积混合后，混合液半合成截短侧耳素衍生物和喹诺酮类衍生物的质量比为3 2;所述A液、B液、C液等体积混合后，混合液半合成截短侧耳素衍生物、喹诺酮类衍生物和四环素类衍生物的质量比为3 2 1。
全文摘要
本发明提供一种用于清除细胞培养中支原体污染的试剂及其使用方法。所述试剂由A液、B液等体积混合或A液、B液、C液等体积混合而成，其中A液由半合成截短侧耳素衍生物和0.01MPBS混合，混合后溶质的质量-体积百分比浓度为0.5％-1.5％；B液由喹诺酮类衍生物和0.01MPBS混合，混合溶质的质量-体积百分比浓为0.5％-1.5％；C液由四环素类衍生物和0.01MPBS混合，混合后溶质的质量-体积百分比浓度为0.25％-0.75％。使用本发明试剂和方法，污染不严重，可在一周内显效。经治处理的污染细胞，治疗周期完成后，细胞间无黑点，细胞生长周期回复正常，细胞形态正常，无团聚生长及拉网现象。
文档编号C12Q1/04GK102409019SQ20111017139
公开日2012年4月11日 申请日期2011年6月23日 优先权日2011年6月23日
发明者胡晓鹏 申请人:胡晓鹏