一种用于分步培养hUC-MSC的试剂盒及采用所述试剂盒获得的hUC-MSC的制作方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及干细胞的研究领域，特别是涉及一种hUC-MSC的新型、高效的无血清分步培养试剂盒。
【背景技术】
[0002]间充质干细胞普遍存在于人体多种组织和器官中，并具有多向分化潜能，具有刺激组织再生、调节免疫等功能，在细胞治疗领域有着广阔的应用前景。
[0003]骨髓间充质干细胞已经在临床上得到了广泛应用，而目前的研究表明，脐带来源的间充质干细胞不但能够成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，而且具有更大的应用潜能。其中，源于人脐带的人脐带间充质干细胞(human Umbilical Cord mesenchymal stemcells，hUC-MSC)表达多种胚胎干细胞的特有标志，具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题的限制、易于工业化制备等特征，而且研究证实hUC-MSC在神经疾病、免疫系统、内分泌系统以及癌症、心脏病等疾病的动物模型和临床研究中有良好治疗效果，因此有可能成为最具临床应用前景的多能干细胞。
[0004]若要将hUC-MSC进一步应用于临床，最重要的就是hUC-MSC的体外大量扩增达到有效的临床治疗剂量，因此hUC-MSC的体外培养成为了最基础同时也是最重要的技术之一。现有的hUC-MSC培养方法多采用在基础培养基中添加FBS、青链霉素，但非人血清成分复杂，使hUC-MSC在长期的培养过程中易分化，且非存在传播异种病原体的危险。
[0005]此外，虽然已有科研工作者开发出多种类型的血清替代物，但目前市场可购买的供hUC-MSC培养的血清替代物以及完全培养基的培养效果仍不理想，尤其对于干细胞的贴壁、增殖、以及细胞长期培养后的稳定性的维持等特性均无法达到预期效果。
【发明内容】
[0006]因此本发明的目的是针对本领域的需要，提供一种用于培养hUC-MSC的培养基，从而获得贴壁能力好、增殖快速、易分化的hUC-MSC。
[0007]本发明的另一目的是提供通过本发明的培养基获得的hUC-MSC。
[0008]具体而言，本发明提供一种新型的无血清分步培养hUC-MSC的试剂盒培养方案，该试剂盒至少包括不同组成的两种培养基，利用该试剂盒中的培养基可在无血清环境下进行hUC-MSC的分步培养和长期扩增培养，同时确保其在长期培养情况下依然保持多潜能性及较强的增殖能力。
[0009]本发明的技术方案如下。
[0010]一方面，本发明提供了一种用于分步培养hUC-MSC的试剂盒，所述试剂盒包括分开放置的TME培养基和TMD培养基。该两种培养基均无血清成分，且用于分步培养hUC-MSC。
[0011 ]其中，所述hUC-MSC为从自然分娩或剖宫产的健康新生儿脐带组织分离出的人脐带间充质干细胞。目前本领域已有多种公知的人脐带间充质干细胞分离方法。
[0012]本发明提供的试剂盒中，所述TME培养基包含a-MEM、i3_巯基乙醇和非必需氨基酸。优选地，所述TME培养基含有0.05-0.2体积份的β-巯基乙醇、0.5-2体积份的非必需氨基酸水溶液和95-100体积份的a-MEM，其中，所述非必需氨基酸水溶液包含浓度各为8-12mM的甘氨酸、丙氨酸、L-天门酰胺、L-天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸;更优选地，所述TME培养基含有0.1体积份的β_巯基乙醇、1体积份的非必需氨基酸水溶液和99体积份的a-MEM;进一步优选地，所述TME培养基由所述a-MEM、i3-巯基乙醇和非必需氨基酸水溶液组成。
[0013]本发明提供的试剂盒中，所述TMD培养基含有a-MEM/DMEM-Fl2、β-巯基乙醇、非必需氨基酸、重组人碱性成纤维生长因子(b-FGF)和血清替代物。
[0014]优选地，所述TMD培养基包含0.05-0.2体积份的β-巯基乙醇、0.5_2体积份的非必需氨基酸水溶液、8-12体积份的血清替代物、85-95体积份的a-MEM/DMEM-Fl 2和终浓度为5-15ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子，其中，所述非必需氨基酸水溶液包含浓度各为8-12mM的甘氨酸、丙氨酸、L-天门酰胺、L-天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸;更优选地，所述TMD培养基包含0.1体积份的β_巯基乙醇、1体积份的非必需氨基酸水溶液、10体积份的血清替代物、89体积份的a-MEM/DMEM-F12和终浓度为10ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子。优选地，所述TMD培养基由所述a-MEM/DMEM-Fl 2、β-巯基乙醇、非必需氨基酸水溶液、重组人碱性成纤维生长因子和血清替代物组成。
[0015]根据本申请的【具体实施方式】，所述非必需氨基酸水溶液可以采用Gibco公司货号为11140的产品。
[0016]根据本申请的【具体实施方式】，所述血清替代物可以采用KnockOutTMSerumReplacement(Gibco公司产品，货号 10828-010)。
[0017]使用本发明的试剂盒可以分步培养hUC-MSC，培养方法包括:先使用所述试剂盒中的TME培养基培养hUC-MSC，然后使用所述试剂盒中的TMD培养基进行培养。即先后采用两种培养基进行培养；
[0018]进一步地，所述培养方法包括以下步骤:
[0019](1)将hUC-MSC以0.5-4 X 104个细胞/cm2的密度接种于所述试剂盒中的TME培养基中培养3-6小时；
[0020](2)弃去TME培养基，PBS清洗，更换为所述试剂盒中的TMD培养基，每3-5天更换新鲜的TMD培养基；
[0021 ] (3)待细胞达70-90 %汇合后，收集细胞备用、冻存或重复步骤(1)和(2)传代培养；
[0022]可选择地，取步骤(3)收集的hUC-MSC细胞，检测以下项目中的一项或多项:分化能力、细胞活性、细胞纯度、细胞污染和增殖特性。
[0023 ]优选地，所述培养方法包括以下步骤:
[0024](1)将hUC-MSC以2 X104个细胞/cm2的密度接种于所述试剂盒中的TME培养基中培养3-4小时；
[0025](2)弃去TME培养基，PBS清洗1次，更换为预先37°C孵育的所述试剂盒中的TMD培养基，每3天更换新鲜的TMD培养基；
[0026](3)待细胞达90%汇合后，收集细胞备用、冻存或重复步骤(1)和(2)传代培养；
[0027]可选择地，取步骤(3)收集的hUC-MSC细胞，检测以下项目中的全部:分化能力、细胞活性、细胞纯度、细胞污染和增殖特性。
[0028]根据本发明的【具体实施方式】，所述用于hUC-MSC的无血清分步培养方法包括以下步骤:
[0029](1)使用TME培养基以一定密度接种hUC-MSC于六孔板或T75培养瓶内进行贴壁培养;优选地，hUC-MSC的接种密度为约2 X 104个细胞/cm2;
[0030](2)接种4小时后，用移液器小心吸弃旧TME培养基，用roS洗一遍，更换为同样预先37°C孵育的TMD培养基；
[0031 ] (3)待细胞达90 %汇合后，利用上述方案进行传代培养或冻存细胞。
[0032]选择性地，针对步骤(3)所得的hUC-MSC，检测以下项目:分化能力、细胞活性、细胞纯度、细胞污染和增殖特性。
[0033]另一方面，本发明还提供通过上述方法获得的hUC-MSC。
[0034]优选地，所述hUC-MSC具有以下特征:
[0035](1)粘附于塑料培养器皿成梭形旋涡状生长；
[0036](2)表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和HLA-ABC的阳性比例大于99.0% ；表达CD45、CD34和HLA-DR的阳性比例小于1.0% ；
[0037](3)体外可诱导分化为成骨细胞和成脂细胞；
[0038](4)活细胞检测比率达99%以上；
[0039](5)呈典型的“S型”生长曲线特性；
[0040](6)多能性基因表达，所述多能性基因为选自SSEA-4、0CT-4、NAN0G和S0X-2中的一种或多种。
[0041 ]又一方面，本发明还提供在上述培养方法中采用的TME培养基和/或TMD培养基。
[0042]本发明中所述试剂盒中的TME培养基和TMD培养基均为无血清组分，且组成明晰，避免了在培养细胞培养过程中因血清批次差异导致细胞生长过程不稳定的情况，也排除了传播异种病原体危险的可能。
[0043]此外，利用试剂盒中的两种培养基进行分步培养，先使用TME培养基培养促进hUC-MSC贴壁，然后更换为TMD培养基进行快速扩增，很好地解决了常规无血清培养中细胞贴壁能力差，增殖缓慢的缺点，且在长期培养过程中，细胞仍能保持良好的增殖能力和多向分化潜能，为动物细胞的体外培养提供了一种高效的解决方案。
[0044]并且，本发明的试剂盒操作简单易行，缩短了原代培养时间。
[0045]经流式细胞仪测定，经活力检测、分化能力鉴定以及多能性基因分析，通过本发明方法获得的间充质干细胞活率高，纯度高，分化能力强，建立的细胞库可直接用于科学研究和临床辅助治疗。
【附图说明】
[0046]以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中:
[0047]图1是使用含血清培养基培养hUC-MSC的图，其中图1A为接种2小时后的细胞形态，图1B为接种24小时后的细胞形态，图1C为接种48小时后的细胞形态。
[0048]图2是在培养基组成筛选过程中的细胞图，其中图2A为高浓度β-巯基乙醇培养基在细胞接种4小时后细胞形态，图2Β为低浓度血清替代物培养基接种48小时后细胞形态，图2C为高浓度血清替代物培养基接种24小时后细胞形态，图2D为低浓度bFGF培养基接种24小时后细胞形态，图2E为高浓度bFGF培养基培养细胞在传代后细胞形态。
[0049]图3是使用试剂盒中的TME培养基培养hUC-MSC的图，其中图3A为接种2小时后的细胞形态，图3B为接种24小时后的细胞形态，图3C为接种48小时