一种从脐带和胎盘羊膜组织同时提取上皮细胞和间充质干细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞培养技术领域，尤其是一种从脐带和胎盘羊膜组织同时提取上皮细胞和间充质干细胞的方法。
【背景技术】
[0002]脐带和胎盘同属于胚胎周围组织，脐带组织是间充质干细胞(mesenchymal stemcellS，MSCS)的来源。胎盘由胎盘羊膜、绒毛膜和基蜕膜组成。胎盘含有大量的多种干细胞，胎盘羊膜上皮细胞(amn1tic epithelial cells，AECs)具有多种干细胞的特性，其中有一些亚全能干细胞，其特性非常接近胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESCs)。而胎盘间充质干细胞则存在于羊膜上皮细胞层之下。羊膜起源于胚胎的上皮层，其发生早于内、中、夕卜三个胚层，因此，胎盘亚全能细胞的分化能力强于起源于其他三个胚层的干细胞。许多实验证明它们更容易被诱导分化成为机体的各种细胞，因此用于临床治疗的潜能就更大，也就具有更大的市场。相比于脐带，从胎盘中获取干细胞的工作还开展的比较少，因此这个研发项目的意义就更为重大。胎盘绒毛膜也含有大量的间充质干细胞和造血干细胞(Hematopoietic stem cells，HSCs);但是因为它的体积很大，不容易取材，所以是利用胎盘组织的最后选择。
[0003]人间充质干细胞(MSC)和上皮干细胞(ESC)移植在治疗多种疾病包括治疗退行性神经病变，新生儿脑缺血和成人脑中风，以及癌症治疗中有广泛的研究，并且已经在多个领域得到临床应用。
[0004]通过检索，发现如下几篇与本专利申请相关的专利公开文献:
[0005]1、人胎盘亚全能干细胞及其干细胞库构建方法(CN103966159A)，提供了一种人胎盘亚全能干细胞，其来源于剥离的人类胎盘羊膜，针对羊膜的上皮层和间充质层所含有的细胞特点，采用了逐步分离的方法，最大限度地减少了羊膜间充质层细胞对胎盘亚全能细胞的污染，有效地提高了人胎盘亚全能细胞的干性。该发明还提供了一种从胎盘羊膜制备人胎盘亚全能干细胞并建立干细胞库的方法，该发明在剥离人类胎盘羊膜并剪成5 X 5cm组织块之后，对羊膜的上皮层和间充质层采用了逐步分离的方法，首先进行蛋白酶溶液消化，其所用的蛋白酶溶液含有胰蛋白酶，胶原蛋白酶II，和EDTA。然后进一步使用Fico 11淋巴细胞分离液梯度离心，采集两层液面间的细胞以达到分离培养一种人胎盘亚全能干细胞的目的。
[0006]上述发明方法的组织分离的步骤比较多，要使用大量的很多种的试剂包括价格昂贵的胶原酶II。
[0007]2、一种人羊膜间充质干细胞的分离与鉴定方法(CN104450612A)，公开了一种人羊膜间充质干细胞的分离与鉴定方法，采用组织块贴壁法分离出羊膜间充质干细胞并传代培养，对P1-P3代细胞进行细胞形态的观察，用流式细胞仪检测细胞膜表面阳性分子和阴性分子并采用六孔板法检测细胞增殖情况，该实验从胎盘羊膜组织中分离出细胞是hAMSCs，为进一步研究hAMSCs的生物学和免疫学特性、分化能力、核型稳定性，以及将其作为临床应用的种子细胞等提供了基础。该发明在剥离人类胎盘羊膜之后，用眼科剪剪成很细小的小块(约l-2cm)，然后夹取并平铺于细胞培养瓶中，，使细胞在培养中从组织块游移出来以实现贴壁生长和增殖。当细胞生长融合成片时，用无菌磷酸缓冲盐水(PBS)洗去羊膜组织块。
[0008]上述方法虽然避免了使用大量的试剂包括价格昂贵的胶原酶，但是种植的组织块还是比较大，不能让组织内的细胞最有效的游移出来。而且手工剪切和铺放也非常的耗时，用在胎盘羊膜的取材时尚可，但是用在脐带取材就不实际，因为脐带组织的量要大得多，而且非常坚硬。
[0009]通过技术对比，本专利申请与上述两篇专利公开文献存在较大的不同。
【发明内容】
[0010]本发明目的克服现有技术的不足之处，提供一种低成本、简单快速地从脐带和胎盘羊膜组织同时提取上皮细胞和间充质干细胞的方法。
[0011 ]为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下:
[0012]—种从脐带和胎盘羊膜组织同时提取上皮细胞和间充质干细胞的方法，步骤如下:
[0013]⑴脐带和胎盘羊膜取材和接种:
[0014]①高温消毒手术器械和大玻璃皿，同时紫外线消毒超净工作台；
[0015]②配制培养基:完全培养基的组成是:DMEM/F12加完全培养基总体积5%的胎牛血清、完全培养基总体积1%的胰岛素、铁传递蛋白和砸的混合添加物，完全培养基中终浓度为20毫微克/毫升的表皮生长因子和完全培养基中终浓度为20毫微克/毫升的碱性纤维母细胞生长因子，无菌过滤，4°C保存；
[0016]所述DMEM/F12中DMEM:F12的体积比为1:1;所述混合添加物及在混合添加物中的终浓度为胰岛素5微克/毫升、铁传递蛋白10微克/毫升和亚砸酸钠5毫微克/毫升；
[0017]③严格筛选供者，血液化验排除传染病；
[0018]④低温冰盒中运送脐带和胎盘:机械剥离胎盘羊膜之后，将脐带和胎盘羊膜分别置于大玻璃皿中，以下步骤都在无菌条件下进行，将脐带剪成lcm长的小段，将胎盘羊膜剪成约5X5cm长的方块，用磷酸缓冲盐水+总体积1 %的青霉素+总体积1 %的链霉素清洗组织两次，洗干净脐带的血液；
[0019]⑤将脐带和胎盘羊膜组织放在4°C的磷酸缓冲盐水中，以防止组织在机械剪碎时过热而影响到细胞存活，使用组织剪碎机来分别破碎成1 _3mm的碎块，使用低速破碎组织，同时保持细胞活性，得到破碎的脐带和羊膜组织；
[0020]⑥将破碎的脐带和羊膜组织分别转移到T175细胞培养瓶中，并用组织刮取器将其平铺于培养瓶底，小心加入少量完全培养基，使培养液既能覆盖破碎的脐带和羊膜组织块，又不至于使其漂浮起来，置于37°C、饱和湿度5 % C02培养箱中培养；
[0021 ]⑵间充质干细胞和羊膜上皮细胞在培养瓶中扩增和传代:
[0022]①培养过程中观察可见细胞从组织块逐渐游移出来，并进一步实现贴壁生长和增殖，在培养的第3-4天、当细胞生长融合成片时，用无菌磷酸缓冲盐水洗去残存的组织，全部换为新鲜完全培养基继续培养；
[0023]②此后每4天换一次培养液直到细胞长满90-100%培养瓶底面积，便进行胰酶消化传代；
[0024]③胰酶消化传代:倒弃培养液，用PBS洗细胞2次，每T175用10毫升质量百分数为
0.25%的胰酶-EDTA在37°C消化10分钟，待细胞悬浮后每个T175加入1毫升胎牛血清以中和胰酶反应，1000转/分离心10分钟，再悬浮于完全培养基中，按1:4细胞数比例传代到新T175培养瓶中；
[0025]⑶间充质干细胞和羊膜上皮细胞的鉴定:
[0026]①胰酶消化传到第三代时，用流式细胞仪鉴定培养细胞的纯度:
[0027]羊膜上皮细胞的标记物包括:角蛋白CK19，CD29，和⑶34;胎盘和脐带间充质干细胞的标记物包括:⑶73，⑶90，和⑶105 ；
[0028]②流式细胞仪验证细胞纯度达到90%以上，化验排除常见的传染病，并排除细菌，支原体污染，即是符合标准，即得上皮细胞和间充质干细胞的混合物。
[0029]而且，所述步骤⑴③传染病为包括艾滋病，甲，乙，丙型肝炎和梅毒；或者，所述步骤⑶②传染病为包括艾滋病，甲，乙，丙型肝炎和梅毒。
[0030]而且，所述步骤⑴⑤中低速为400-800转/分钟。
[0031]而且，所述上皮细胞和间充质干细胞的混合物的冷冻保存和复苏方法，步骤如下:
[0032]⑴取上皮细胞和间充质干细胞的混合物，用PBS洗两次以洗掉FBS，0.25%胰酶-EDTA消化，每T175用10毫升，37°C，10分钟，待细胞悬浮后每个T175加入1毫升FBS以中和胰酶反应。在1000转/分离心10分钟；
[0033]⑵再按细胞密度(l-3)X107/ml悬浮于细胞冻存液中，分装到2ml冻存管中，使用细胞冻存盒在_80°C冰箱缓慢降温冻存，一天之后转移到液氮罐中长期保存备用；
[0034]所述细胞冻存液组成:总质量20 %的DMS0，总质量20 %的人血清白蛋白，总质量的60%M199培养基；
[0035]⑶使用细胞前，将冻存管中细胞在37°C水浴中迅速解冻，在1000转/分离心10分钟，再悬浮于PBS中，制备成细胞密度为lxl08/ml的细胞悬液以用作包括移植在内的实验和临床应用，使用之前一直保存在4°C。
[0036]本发明取得的优点和积极效果是:
[0037]本方法成本低、简单快速，使用组织剪碎机来将脐带和胎盘羊膜剪碎成极小的碎块(小于2_3mm)，远小于目前任何的方法，极为利于直接接种到培养瓶之后细胞向组织外游移，从而实现帖壁生长;不使用任何蛋白酶试剂，从而大幅度地降低成本，减少制备时间，增加产量，使得大规模细胞制备成为现实;该方法使用添加生长因子及其它营养物的完全细胞培养基，从而降低胎牛血清(FBS)浓度到5%，但是取得与常规使用10%FBS同级和更佳的培养效果，节省了血清，但又不像大多数无血清培养那样，造成细胞增殖放缓或提早分化。
【具体实施方式】
[0038]下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
[0039]本发明中所使用的试剂，如无特殊规定，均为本领域内的常用试剂;本发明中所使用的方法，如无特殊规定，均为本领域内的常规方法。
[0040]—种从脐带和胎盘羊膜组织同时提取上皮细胞和间充质干细胞的方法，步骤如下:
[0041 ]⑴脐带和胎盘羊膜取材和接种:
[0042]①高温消毒手术器械和大玻璃皿，同时紫外线消毒超净工作台；