专利名称：利用脐带或胎盘制备含有内皮祖细胞制剂的方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物制剂，尤其时利用脐带或胎盘制备含有内皮祖细胞 制剂的方法及其用途。
背景技术：
内皮祖细胞(endothelial progenitor cell，EPC)又称血管母细胞， 是来源于骨髓，并能在体内循环、增殖并分化为成熟内皮细胞(EC)的前体 细胞。在体内EPC可以定居到缺血部位参与新血管的形成。经基因修饰后的 EPC还用于抗新生血管治疗肿瘤性及炎症性疾病。用EPC作为种子细胞可在 动物实验中构建组织工程血管。将EPC接种到生物可降解支架上，并移植入 犬的下腔静脉，结果证实EPC在犬体内分化成内皮细胞和平滑肌细胞。目前 从脐血、骨髓、外周血都能分离出EPC，但其来源较少，细胞增殖能力有限， 在一些特定的病理条件下，其表型会发生改变，生物学活性下降，使其应用 受到限制。
血管组织工程近年来发展迅速，但是要临床应用还有不少问题有待解 决。例如种子细胞来源少、体外构建自体血管的时间较长的问题，如何在 较短时间内完成干细胞的分离、纯化、倍增，从而达到临床应用要求的问题。
间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是近年来研究的一个 热点，间充质干细胞具有多向分化能力，体外扩增能力强，抗原性弱，不涉 及伦理道德等问题。
骨髓间充质干细胞(BMSCs)是骨髓中中胚层来源的未分化细胞，具备 分化为成骨细胞、肌细胞、血管内皮细胞等多种组织细胞及高增殖的潜能。 其有以下优势①取材方便；②对供体健康无害；③体外扩增能力强、不易 丢失细胞表型；④不存在组织配型的问题。但是随着年龄的增长，骨髓中 BMSCs的含量会降低，增加了分离培养的难度，而且得到的细胞增殖分化的 能力会降低。 近些年来，人们从脐带、胎盘中也陆续分离出间充质干细胞。其具有骨 髓基质干细胞相同的特点，细胞的扩增分化能力不受年龄的影响。胎盘及脐 带来源丰富，其间充质细胞产量很高，因此，可为临床应用，组织工程提供 理想的种子细胞。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种利用脐带或胎盘制备含有内皮 祖细胞制剂的方法及其用途，即一种新型来源的内皮袓细胞制剂的制备方 法，在脐带胎盘来源间充质细胞分化实验中，发现间充质干细胞可以很容易
地分化为内皮祖细胞，转化率80%以上，而且转化过程中及转化后仍具有扩 增能力，为解决内皮祖细胞的来源及增殖能力差的问题提供了解决方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是 一种利用脐带或胎 盘制备含有内皮祖细胞制剂的方法，所述内皮袓细胞制剂来源于从体外的脐 带或胎盘中分离培养的间充质干细胞，在间充质培养基中体外扩增后，再加
入含VEGF、 ECGF和肝素的诱导培养基诱导间充质干细胞分化为内皮祖细胞。 所述的脐带或胎盘是人的脐带或胎盘。
所述的分离培养的间充质干细胞包括间充质干细胞的分离、间充质干细 胞的的体外扩增和间充质干细胞的诱导分化。
所述的诱导培养基中含5-100ng/ml的VEGF， 5-300ug/ml的ECGF和 5-200U/ml的肝素。
所述的诱导培养基的中含10ng/ml的VEGF， 20ug/ml的ECGF和100 U/ml 的肝素。
所述的利用脐带或胎盘制备含有内皮袓细胞制剂的方法，包括以下步
骤
A、 将体外处理干净的脐带或胎盘经过机械切碎后，再经过胶原酶消化 为单细胞悬液，洗涤去除胶原酶残留，之后接种于培养瓶或培养皿或培养袋 内；
B、 在含10-20%胎牛血清、10ng/ml bFGF 、 20ng/ml EGF的间充质培养
基中培养，经多次换液、传代后得到较纯的间充质干细胞；
C、 将获得的间充质细胞改用含有5-100ng/ml VEGF、 5-300ug/ml ECGF 和5-200U/ml肝素的诱导培养液中诱导7-21天，获得含有内皮袓细胞的制 剂。
所述的步骤B中的传代为三代以上。
上述方法制备的内皮祖细胞制剂可直接或经基因修饰后用于治疗脑血 管、心血管、外周血管闭塞性疾病或其他存在供血障碍的疾病，还可用于肿 瘤性及炎症性疾病抑制血管新生。还可用于组织工程中作为种子细胞，构建 组织工程血管。
本发明的有益效果使用本方法制备的内皮祖细胞制剂含有大量具有良 好增殖潜力的内皮祖细胞，而且来源丰富，供者无痛苦，为解决内皮祖细胞 的来源及增殖能力差的问题提供了解决方法，为组织工程提供良好的种子细 胞来源，可建成细胞库，快速、反复、大量提供细胞来源。
图1未分化的间充质干细胞Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光染色鉴定 图2已诱导分化为内皮袓细胞的细胞Di1-ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光
染色鉴定
具体实施例方式
下面，结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不受限于下述实 施例。
一种利用脐带或胎盘制备含有内皮祖细胞制剂的方法，所述内皮祖细胞 制剂来源于从体外的脐带或胎盘中分离培养的间充质干细胞，在间充质培养 基中体外扩增后，再加入含VEGF、 ECGF和肝素的诱导培养基诱导间充质干 细胞分化为内皮祖细胞。
所述的脐带或胎盘是人的脐带或胎盘。
所述的分离培养的间充质干细胞包括间充质干细胞的分离、间充质干细 胞的的体外扩增和间充质干细胞的诱导分化。
所述的诱导培养基中含5-100ng/ml的VEGF， 5-300ug/ml的ECGF和 5-200U/ml的肝素。
所述的诱导培养基的中含10ng/ml的VEGF， 20ug/ml的ECGF和100 U/ml 的肝素。 所述的利用脐带或胎盘制备含有内皮袓细胞制剂的方法，包括以下步
骤
A、 将体外处理干净的脐带或胎盘经过机械切碎后，再经过胶原酶消化 为单细胞悬液，洗涤去除胶原酶残留，之后接种于培养瓶或培养皿或培养袋
内；
B、 在含10-20%胎牛血清、10ng/ml bFGF 、 20ng/ml EGF的间充质培养 基中培养，经多次换液、传代后得到较纯的间充质干细胞；
C、 将获得的间充质细胞改用含有5-100ng/ml VEGF、 5-300ug/ml ECGF 和5-200U/ml肝素的诱导培养液中诱导7-21天，获得含有内皮祖细胞的制 剂。
所述的步骤B中的传代为三代以上。
上述方法制备的内皮祖细胞制剂可直接或经基因修饰后用于治疗脑血 管、心血管、外周血管闭塞性疾病或其他存在供血障碍的疾病，还可用于肿 瘤性及炎症性疾病抑制血管新生。还可用于组织工程中作为种子细胞，构建 组织工程血管。
实施例1:脐带来源间充质细胞分化的内皮袓细胞制剂及其制备方法 A制备脐带间充质干细胞
1、 取健康足月顺产婴儿脐带，用加入含庆大霉素(浓度2-4万U /L) 肝素(浓度50-200U/ml)的生理盐水冲洗表面，去除残留血液及可能的细菌 污染，至少三次，每次更换容器及器械。
2、 机械粉碎组织，加入4-5倍体积的胶原酶消化液，37'C，搅拌，2 小时后收集消化液，200目滤网过滤，细胞悬液加入2倍体积洗涤液(DF12 加5-20%胎牛血清)洗涤两遍，使用间充质培养基(含10-20%胎牛瓶清、 10ng/mlbFGF、 20ng/ml EGF)重悬沉淀后接种于培养瓶中，24-72小时后全 量换液，每3天半量换液。
3、 待细胞生长至80-90%融合时，进行传代操作。弃去培养基，PBS洗 涤细胞一次，加入1%胰蛋白酶消化5-10分钟，加入洗涤液终止消化，离心 弃上清，再加入洗涤液洗涤一次。沉淀用适量间充质培养基重悬，按l: 2-3 传代。培养3-4代后取样鉴定间充质干细胞，其余细胞加入冻存液(40y。DF1250%胎牛血清10%DMS0)，细胞浓度106-107/ml，经程控降温后，置于液氮中 永久保存。
4、间充质干细胞的鉴定。分为免疫表型测定及分化能力测定。 4.1、免疫表型检测CD14， CD31， CD44, CD45， CD105, CD144, VWF， CD29， CD34, CD73, CD90， CD95， CD106, KDR， HLA-DR。使用1%胰蛋白酶消化体外 扩增的第3-4代的间充质干细胞，PBS洗涤2次，分成每管含5X1()5细胞， 第一管加入同型对照抗体(Mouse IgGl FITC/ Mouse IgGl PE) 20ul，其 余管中加入其它相应抗体20ul (或者按使用说明书规定的试剂量加入)，混 匀，室温避光静置30分钟，加入PBS 2ml，混匀，300g离心5分钟，弃上 清，加入1%多聚甲醛400111，混匀，即可上机检测。 4. 2细胞的成骨及成脂分化潜能及分化后鉴定
消化体外扩增的第3-4代间充质干细胞，以5xlOVcm2的密度接种于预 先放置无菌消毒盖玻片的6孔板中，制备细胞爬片，每孔加2ml上述分离培 养基。在细胞达到60%—700%融合时，更换诱导分化培养基。 4. 2.1成骨诱导分化
诱导分化培养基为含有10—7mol/L的地塞米松，lOmmol / L 3 -磷酸甘油， 0. 05mmo1 / L 2-磷酸抗坏血酸和10%FBS的DMEM—LG / F12培养液，每周 换液2次，培养21天。取出玻片，PBS洗涤一次，70%酒精固定10分钟， 行茜素红及范可萨染色，显微镜下观察，照相。 4. 2. 2成脂诱导分化
诱导分化培养基为含有10—6mol/L的地塞米松，10ug/ml胰岛素， 0. 5mmo1 / L异丁基甲基黄嘌吟(IBMX)， 200umo1 / L消炎痛(均为Sigma公 司产品)和10%FBS的DMEM—LG / F12培养液，每周换液2次，培养14 天。取出玻片，PBS洗涤一次，70%酒精固定10分钟，以油红O染色，镜 检、照相。
B间充质干细胞分化为内皮祖细胞制剂及其鉴定
1、取第3-4代间充质干细胞，在原培养基中加入VEGF10ng/ml ECGF20ug/ml和肝素100 U/ml形成诱导扩增培养基，每3天半量换液。细胞 生长至80-90%融合时，进行传代操作。弃去培养基，PBS洗涤细胞一次，加入1%胰蛋白酶消化5-10分钟，加入培养基终止消化，离心弃上清，再加 入培养基洗涤一次。沉淀用适量诱导扩增培养基重悬，按l: 2-3传代。
2、培养7-21天后，取样鉴定内皮袓细胞，其余细胞加入冻存液(40% DF12 50。/。胎牛血清10%DMSO)，细胞浓度106-107/ml，经程控降温后，置 于液氮中永久保存。鉴定内皮袓细胞包括免疫表型，DiI-ac-LDL和 FITC-UEA-1双荧光染色鉴定。
2.1、免疫表型检测CD14, CD31， CD44， CD45, CD105, CD144, VWF， CD29， CD34, CD73, CD90, CD95， CD106， KDR， HLA-DR。使用1% 胰蛋白酶消化体外扩增的内皮祖细胞制剂，PBS洗涤2次，分成每管含5X105 细胞，第一管加入同型对照抗体(Mouse IgGl FITC/MouseIgGl PE)20ul， 其余管中加入其它相应抗体20ul (或者按使用说明书规定的试剂量加入)， 混匀，室温避光静置30分钟，加入PBS 2ml，混匀，300g离心5分钟，弃 上清，加入l。/。多聚甲醛400ul，混匀，即可上机检测。(结果见图3)
2. 2 Dil-ac-LDL和FITC-UEA-l双荧光染色鉴定贴壁细胞60%融合更换 培养基时加入四甲基吲哚碳花青探针标记乙酰化低密度脂蛋白(3， 3， 3，， 3' -tetramethylindocarbocyanine perchlorate labeled acetylated low density lipoprotein, Dil-acLDL; BTI)10ug/ml，置于37。C 、 5%孵育 箱中孵育4 h，尔后用无荧光的PBS洗涤细胞3次，再用10g/L多聚甲醛固定 细胞10min。固定后，用PBS浸洗，将10mg / L的FITC-UEA-l加于上述标本中 于37"C下孵育1 h。未经诱导处理的间充质干细胞为对照。在荧光显微镜下 观察，Dil-ac-LDL和FITC-UEA-I双染色阳性的细胞即为内皮袓细胞。(结果 见图l、图2) ,
实施例2:胎盘来源间充质细胞分化的内皮祖细胞制剂及其制备方法 A制备胎盘间充质干细胞
1、 取健康足月顺产婴儿胎盘，用加入含庆大霉素(浓度2-4万U/L)肝 素(50-200U/ml)的生理盐水冲洗表面，去除残留血液及可能的细菌污染， 至少三次，每次更换容器及器械。
2、 机械粉碎组织，加入4-5倍体积的胶原酶消化液，37°C，搅拌，2小 时后收集消化液，200目滤网过滤，细胞悬液加入2倍体积洗涤液(DF12加
5-20%胎牛血清)洗涤两遍，使用间充质培养基(含10-20。/。胎牛血清10ng/ml bFGF20ng/mlEGF)重悬沉淀后接种于培养瓶中，24-72小时后全量换液，每 3天半量换液。
3、 待细胞生长至80-90%融合时，进行传代操作。弃去培养基，PBS洗 涤细胞一次，加入1%胰蛋白酶消化5-10分钟，加入洗涤液终止消化，离心弃 上清，再加入洗涤液洗涤一次。沉淀用适量间充质培养基重悬，按l: 2-3传 代。培养3-4代后取样鉴定间充质干细胞，其余细胞加入冻存液(40%DF12 50%胎牛血清10%DMSO)，细胞浓度106-107/1111，-经程控降温后，置于液 氮中永久保存。
4间充质干细胞的鉴定分为免疫表型测定及分化能力测定 4.1、免疫表型检测CD14， CD31, CD44, CD45， CD105, CD144， VWF， CD29, CD34, CD73， CD90， CD95， CD106， KDR， HLA-DR。使用1%胰 蛋白酶消化体外扩增的第3-4代的间充质干细胞，PBS洗涤2次，分成每管含 5X1()5细胞，第一管加入同型对照抗体(Mouse IgGl FITC/ Mouse IgGl PE) 20ul，其余管中加入其它相应抗体20ul (或者按使用说明书规定的试剂量加 入)，混匀，室温避光静置30分钟，加入PBS2ml，混匀，300g离心5分钟， 弃上清，加入P/。多聚甲酸400ul，混匀，即可上机检测。
4. 2细胞的成骨及成脂分化潜能及分化后鉴定
消化体外扩增的第3-4代间充质干细胞，以5xlOVcm2的密度接种于预 先放置无菌消毒盖玻片的6孔板中，制备细胞爬片，每孔加2ml上述分离培 养基。在细胞达到60%—70%融合时，更换诱导分化培养基。 4. 2. 1成骨诱导分化
诱导分化培养基为含有10—7mol/L的地塞米松，l(kmol / L 3 -磷酸甘油， 0. 05mmo1 / L 2-磷酸抗坏血酸和10%FBS的DMEM—LG / F12培养液，每周 换液2次，培养21天。取出玻片，PBS洗涤一次，70%酒精固定10分钟， 行茜素红及范可萨染色，显微镜下观察，照相。 4. 2. 2成脂诱导分化
诱导分化培养基为含有10—6mol / L的地塞米松，10ug/ml胰岛素，0.5mmo1 / L异丁基甲基黄嘌吟(IBMX) ， 200咖o1 / L消炎痛(均为Sigma公司产品)和 10XFBS的DMEM—LG/F12培养液，每周换液2次，培养14天。取出玻片， PBS洗涤一次，70%酒精固定10分钟，以油红O染色，镜检、照相。 B间充质干细胞分化为内皮祖细胞制剂及其鉴定
1、 取第3-4代间充质干细胞，在原培养基中加入VEGF10ng/ml ECGF20ug/ml和肝素100U/ml形成诱导扩增培养基，每3天半量换液。细胞 生长至80-90%融合时，进行传代操作。弃去培养基，PBS洗涤细胞一次，加 入iy。胰翠白酶消化5-IO分钟，加入培养基终止消化，离心弃上清，再加入 培养基洗涤一次。沉淀用适量诱导扩增培养基重悬，按l: 2-3传代。
2、 培养7-21天后，取样鉴定内皮祖细胞，其余细胞加入冻存液(40% DF12 50%胎牛血清10%DMSO)，细胞浓度106-107ml，经程控降温后，置于液氮中 永久保存。鉴定内皮祖细胞包括免疫表型，Dil-ac-LDL和FITC-UEA-l双荧 光染色鉴定。
2. 1、免疫表型检测CD14， CD31, CD44, CD45, CD105， CD144， VWF, CD29， CD34, CD73， CD90， CD95， CD106， KDR， HLA-DR。使用1%胰蛋白酶消化体外 扩增的内皮祖细胞制剂，PBS洗涤2次，分成每管含5X105细胞，第一管加 入同型对照抗体(Mouse IgGl FITC/Mouse IgGl PE) 20ul，其余管中加 入其它相应抗体20ul (或者按使用说明书规定的试剂量加入)，混匀，室温 避光静置30分钟，加入PBS 2ml，混匀，300g离心5分钟，弃上清，加入 1%多聚甲醛400111，混匀，即可上机检测。
2.2、 DiI-ac-LDL和FITC-UEA-l双荧光染色鉴定贴壁细胞60%融合更 换培养基时加入四甲基吲哚碳花青探针标记乙酰化低密度脂蛋白(3， 3， 3，， 3' -tetramethylindocarbocyanine perchlorate labeled acetylated low density lipoprotein, Dil-acLDL; BTI)10ug/ml，置于37。C 、 5%孵育 箱中孵育4 h,尔后用无荧光的PBS洗涤细胞3次，再用10g/L多聚甲醛固定 细胞10min。固定后，用PBS浸洗，将10mg / L的FITC-UEA-1加于上述标本中 于37'C下孵育1 h。未经诱导处理的间充质干细胞为对照。在荧光显微镜下 观察，Dil-ac-LDL和FITC-UEA-I双染色阳性的细胞即为内皮袓细胞。
上述方法制备的内皮袓细胞制剂可直接或经基因修饰后用于治疗脑血 管、心血管、外周血管闭塞性疾病或其他存在供血障碍的疾病，经基因修饰
后还可用于肿瘤性及炎症性疾病抑制血管新生。由于该内皮祖细胞制剂具有 良好的增值能力，因此还可用于组织工程中作为种子细胞，构建组织工程血 管。
综上所述，本发明的内容并不局限在的实施例中，相同领域内的有识之 士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实 施例都包括在本发明的范围之内。
权利要求
1、一种利用脐带或胎盘制备含有内皮祖细胞制剂的方法，其特征在于，所述内皮祖细胞制剂来源于从体外的脐带或胎盘中分离培养的间充质干细胞，在间充质培养基中体外扩增后，再加入含VEGF、ECGF和肝素的诱导培养基诱导间充质干细胞分化为内皮祖细胞。
2、 根据权利要求1所述的利用脐带或胎盘制备含有内皮祖细胞制剂的 方法，其特征在于，所述的脐带或胎盘是人的脐带或胎盘。
3、 根据权利要求1所述的利用脐带或胎盘制备含有内皮祖细胞制剂的 方法，其特征在于，所述的分离培养的间充质干细胞包括间充质干细胞的分 离、间充质干细胞的的体外扩增和间充质干细胞的诱导分化。
4、 根据权利要求1所述的利用脐带或胎盘制备含有内皮祖细胞制剂的 方法，其特征在于，所述的诱导培养基中含5-100ng/ml的VEGF， 5-300ug/ml 的ECGF和5-200U/ml的肝素。
5、 根据权利要求4所述的利用脐带或胎盘制备含有内皮祖细胞制剂的 方法，其特征在于，所述的诱导培养基的中含10ng/ml的VEGF， 20ug/ml 的ECGF和100 U/ml的肝素。
6、 根据权利要求1所述的利用脐带或胎盘制备含有内皮祖细胞制剂的 方法，包括以下步骤A、 将体外处理干净的脐带或胎盘经过机械切碎后，再经过胶原酶消化 为单细胞悬液，洗涤去除胶原酶残留，之后接种于培养瓶或培养皿或培养袋 内；B、 在含10-20%胎牛血清、10ng/ml bFGF 、 20ng/ml EGF的间充质培养 基中培养，经多次换液、传代后得到较纯的间充质干细胞；C、 将获得的间充质细胞改用含有5-100ng/ml VEGF、 5-300ug/ml ECGF 和5-200U/ml肝素的诱导培养液中诱导7-21天，获得含有内皮祖细胞的制 剂。
7、 根据权利要求6所述的利用脐带或胎盘制备含有内皮袓细胞制剂的 方法，其特征在于，所述的步骤B中的传代为三代以上。
8、 权利要求l制备的内皮祖细胞制剂直接或经基因修饰后在治疗脑血管、心血管、外周血管闭塞性疾病或其他存在供血障碍的疾病，以及用于肿 瘤性及炎症性疾病抑制血管新生和用于组织工程中作为种子细胞，构建组织 工程血管中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种利用脐带或胎盘制备含有内皮祖细胞制剂的方法及其用途，主要涉及一种内皮祖细胞制剂的新型来源及其制备方法。该干细胞制剂采用胎盘或脐带作为细胞来源，首先分离、扩增间充质干细胞，然后再加入VEGF诱导间充质干细胞分化为内皮祖细胞。按照本发明制备的内皮祖细胞制剂，含有大量有良好增殖能力的内皮祖细胞。该制剂可用于临床治疗、组织工程等应用。其原料来源丰富、分离成功率及产率高，细胞增殖能力强。
文档编号C12N5/0775GK101199550SQ20071015019
公开日2008年6月18日 申请日期2007年11月16日 优先权日2007年11月16日
发明者孟恒星, 燕 徐, 邱录贵 申请人:中国医学科学院血液学研究所