专利名称：一种利用气升式生物反应器生产食用菌液体菌种的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用气升式生物反应器进行食用菌菌种液体培 养，规模化生产食用菌液体菌种的方法。
背景技术：
蘑燕类大型食用菌生产步骤可分为三步制备菌种；制备栽培料 并将菌种接入栽培料；出菇管理和收获。菌种制备又分为固体菌种制 备和液体菌种制备。目前常用的菌种制备方法主要是固体菌种制备， 其主要步骤为斜面母种一固体原种一原种扩繁一栽培种。该方法在 食用菌生产中已广泛应用，但缺点非常明显1、制种时间长，从母 种一栽培种需要150天时间；2、全部为手工操作，需要大量人工；3、 占用设备和场地大，时间长。由于以上原因，固体菌种的制备一般由 专门的菌种生产单位来完成，造成菌种生产与食用菌生产脱节，菌种 成本过高，严重制约了食用菌生产的发展。食用菌菌种的另一个制备方法为液体菌种制备。其主要步骤为 斜面母种一摇瓶液体菌种一发酵罐液体菌种，液体制种相对于固体制 种有着明显的优势1、制种时间短，整个制种周期仅需20-30天；2、 用功省，用工量只及固体制种的1/20-1/10，占用场地很小；3、液 体菌种的纯度高，菌龄一致，因而其菌袋的发菌时间可縮短l/3且出菇整齐，产品的质量好。液体制种方法必将取代固体制种方法，成为 今后食用菌生产中制种技术的主要方法。常规的食用菌液体制种主要设备是搅拌式发酵罐，它主要由发酵 主罐、搅拌系统、供养系统、控温系统及其它分析检测系统组成。它 的开发主要是为生物工程菌的发酵而设计的，目的是为了获得高附加 值的基因工程产品，其操作技术要求高，设备投资大，因此，将它移 置到食用菌液体菌种的生产是不合适的，该设备也没有真正在食用菌
生产中得到推广应用。由于蘑菇类食用菌大都是好氧真菌，生长需要充足的氧气供应。 因此，相对于搅拌式发酵罐，气升式生物反应器是更好的液体制种设 备。气升式生物反应器主要由主罐、空气发生及过滤系统、控温系统、 PH控制系统、溶氧测定系统、消泡及蒸气消毒系统组成。它提供的 氧气远较搅拌式发酵罐大，非常适于食用菌液体菌种的培养。但是气 升式生物反应器是专门为植物细胞培养而设计的，目的是为了获得高 附加值的细胞工程次生代谢产物，它的操作技术难度大，设备投资也 很高。由于当前我国食用菌生产的主体是分散经营的个体种植户，他 们没有足够的资金购买昂贵的设备，它们缺乏相关的技术知识，难以 在生产中正确地使用和操作这些设备，因此，发酵罐和气升式生物反 应器均不适用于我国食用菌生产的现状，气升式生物反应器在食用菌 生产中的应用未见报道，正是由于这个原因，食用菌液体制种生产工 艺至今没有得到普及和推广。市场急需的是面向个体菇农的，小型化 的，操作简便、价格低廉的液体菌种生产设备。本发明所提供的"简易气升式生物反应器"是利用中国专利ZL200420107291. 6的气升式生物反应器，该反应器正是面向个体菇 农户，实现小型化的，操作简便、价格低廉的液体菌种生产设备。目 前食用菌菌种的液体培养已经非常成熟，先后有近百个食用菌品种的 液体培养获得成功，但仅限于三角瓶的培养，本发明提供的是利用气 升式生物反应器进行食用菌液体菌种生产方法。发明内容本发明目的在于，提供一种利用气升式生物反应器，规模化进行 食用菌液体菌种生产的方法。该方法是将食用菌斜面菌种，在无菌条 件下，接入一级菌种用气升式生物反应器内的液体培养基中，室温培 养，形成一级液体菌种；将发酵完成的一级菌种，在无菌条件下，分 接至二级菌种用气升式生物反应器的各单元液体培养基中，室温培养 获得二级生产用液体菌种，在生产过程结束后，在无菌条件下，取出 每瓶中的空气分布器及连接管，将罐上塑料盖盖好，即可用于食用菌生产。该方法操作简单，安全可靠，价格低廉，适用于个体菇农户使 用，从而解决了个体菇农无法生产食用菌液体菌种的现状。本发明所述的一种利用气升式生物反应器生产食用菌液体菌种 的方法，按下列步骤进行a、 取一支食用菌斜面菌种，在无菌条件下，取l-2cm2大小的菌 块，接入一级菌种用气升式生物反应器内的液体培养基0. 1-1.0%蛋 白胨，0. 1-1.0%酵母提取物，2-6%蔗糖，0.1-0. 3%磷酸氢二钾， . 1-0.3%硫酸镁，10%小麦水，pH 6.0-7.5中，加入消泡剂植物油 7.5-20ml/瓶，室温培养10-15天，通气量0. 8-1. 2 L/(min瓶)，形 成一级液体菌种；b、 将发酵完成的一级菌种，在无菌条件下，分接至二级菌种用 气升式生物反应器的各单元液体培养基0. 1-1.0%蛋白胨，0.1-1.0% 酵母提取物，2-6。/。蔗糖，0. 1-0. 3%磷酸氢二钾，0. 1-0. 3°/。硫酸镁，10% 小麦水，pH 6.0-7.5中，加入消泡剂植物油7.5-20 ml/瓶，每瓶接 种量为10-20ml，通气量为0. 8-1. 2 L/(min瓶)，室温培养5-7天， 获得二级生产用液体菌种，在生产过程结束后，在无菌条件下，取出 每瓶中的空气分布器及连接管，将罐上塑料盖盖好，即可用于食用菌 生产。步骤a气升式生物反应器的容积为2 L/瓶，装液量为1. 5-1. 8 L/瓶。步骤a、 b中加入消泡剂选用一种或数种的植物油。 步骤a中涉及的一级菌种用气升式生物反应器为单罐。 步骤b涉及的一级菌种分接至二级罐中，二级罐为48个罐。 步骤a、 b中加入液体培养基的反应器需进行整体消毒，消毒方式为将气泵与空气过滤器断开，用夹子将空气过滤器与橡皮塞之间的硅胶管夹死，将整个气升式生物反应器及其所有连接管，放入消毒锅中100-105°C，消毒8小时。步骤a、 b中所涉及的培养基配方中的小麦水的制备方法为50g小麦加入300ml自来水，煮至200ml，过滤备用。
本发明所述的方法中的气升式生物反应器是在中国专利ZL200420107291. 6的进一步改进简化的气升式生物反应器，是由罐 体(1)、硅胶管(2) (8)、空气分布器(3)、气泵(4)、橡胶塞(5)、 玻璃管(6) (7)、和空气过滤器(9)组成。在罐体(1)瓶口内通过 橡胶塞(5)插入玻璃管(6)、 (7)，玻璃管(6)的一端通过硅胶管 (2)固定空气分布器(3)，另一端通过空气过滤器(9)与气泵(4) 相连，玻璃管(7)的一端与硅胶管(8)连接。本发明所述步骤a—级菌种用气升式生物反应器为单罐，每套由 一个2L主罐(食品级无毒PC塑料瓶，耐温-20-120 。C)， 一个微型 气泵(220 V，4.5W)， 一个空气过滤器， 一个空气分布器及连接管组 成。本发明所述步骤b二级菌种用气升式生物反应器为一组48套(每 套包括一个主罐， 一个空气分布器， 一个空气过滤器)气升式生物反 应器， 一个小型气泵(80-120 W， 220 V，排气量70-120 L/min)及 气体分配器组成，总容积为96 L。本发明所述的气升式生物反应器专用液体培养基由0. 1-1.0%蛋 白胨，0. 1-1.0%酵母提取物，2-6%蔗糖，0. 1-0.3%磷酸氢二钾， 0.1-0. 3%硫酸镁，10%小麦水组成，pH 6.0-7.5，附加7.5-20 ml植 物油(小麦水的制备方法为50g小麦加入300ml自来水，煮至200 ml，过滤备用)。本发明所述的消毒方法为将整个气升式生物反应器(除气泵外) 连带罐内培养基一起放入消毒锅内，将空气过滤器和罐体之间的硅胶管夹死，100-105 x:消毒8小时。
图1为本发明气升式生物反应器示意图具体实施方式
实施例1首先将一级菌种使用的气升式反应器打开罐体(1)上口处的橡 胶塞(5)，装入1.5L/瓶液体培养基0. 1%蛋白胨，1.0%酵母提取物， 2%蔗糖，0. 1%磷酸氢二钾，0. 3%硫酸镁，10%小麦水，pH6.0，每瓶附 加20ml植物油，将插有玻璃管(6) (7)的橡胶塞(5)固定在罐体(1)的上口处，将气泵(4)与空气过滤器(9)断开，把空气过滤 器(9)和罐体(1)之间的硅胶管夹死，将整个气升式生物反应器(除 气泵外)连带罐内培养基一起放入消毒锅内，10(TC消毒8小时，取 出放置在超净台上，打开橡胶塞(5);取一支阿魏菇斜面菌种，在无菌条件下，切取lcm2大小的菌块， 接入一级菌种用气升式生物反应器单罐内的液体培养基中，开启气泵(4)，调节通气量至0.8-1.2L/(min瓶)，使得培养液中的阿魏菇菌 丝随气泡的移动上下翻滚，在一级菌种用气升式生物反应器内，室温 培养13-15天，形成一级液体菌种；将发酵完成的一级阿魏菇菌种，在无菌条件下，分接至二级菌种 用气升式生物反应器的48个罐体(1)内液体培养基中(二级发酵所 用液体培养基的组成和消毒方式与一级发酵培养基相同)，每瓶接种 量为10ml，开启气泵(4)，调节通气量至0.8-1.2 L/(min瓶)，使得培养液中的阿魏菇菌丝随气泡的移动上下翻滚，室温培养7天，获 得二级生产用液体菌种，在生产过程结束后，在无菌条件下，打开瓶 塞(5)，取出每瓶中的空气分布器(3)，将罐上塑料盖盖好，即可用 于食用菌生产。 实施例2首先将一级菌种使用的气升式反应器打开罐体(1)上口处的橡 胶塞(5)，装入1.6 17瓶液体培养基0.5%蛋白胨，0.5%酵母提取物， 4%蔗糖，0.3%磷酸氢二钾，0. 1%硫酸镁，10%小麦水，pH7.5，每瓶附 加7.5 ml植物油，将插有玻璃管(6) (7)的橡胶塞(5)固定在罐 体(1)的上口处，将气泵(4)与空气过滤器(9)断开，把空气过 滤器(9)和罐体(1)之间的硅胶管夹死，将整个气升式生物反应器 (除气泵外)连带罐内培养基一起放入消毒锅内，102"C消毒8小时， 取出放置在超净台上，打开橡胶塞(5);取一支草燕斜面菌种，在无菌条件下，切取1.5cm2大小的菌块, 接入一级菌种用气升式生物反应器单罐内的液体培养基中，开启气泵(4)，调节通气量至0.8-1.2L/(min瓶)，使得培养液中的草菇菌丝 随气泡的移动上下翻滚，在一级菌种用气升式生物反应器内，室温培 养10-12天，形成一级液体菌种；将发酵完成的一级草菇菌种，在无菌条件下，分接至二级菌种用 气升式生物反应器的48个罐体(1)内液体培养基中(二级发酵所用 液体培养基的组成和消毒方式与一级发酵培养基相同)，每瓶接种量 为20ml，开启气泵(4)，调节通气量至0.8-1.2 L/(min瓶)，使得 培养液中的草菇菌丝随气泡的移动上下翻滚，室温培养5天，获得二 级生产用液体菌种。在生产过程结束后，在无菌条件下，打开瓶塞(5)， 取出每瓶中的空气分布器(3)，将罐上塑料盖盖好，即可用于食用菌 生产。实施例3首先将一级菌种使用的气升式反应器打开罐体(1)上口处的橡 胶塞(5)，装入1.7 17瓶液体培养基1.0%蛋白胨，0. 1%酵母提取物， 6%蔗糖，0.2%磷酸氢二钾，0.2%硫酸镁，10%小麦水，pH7.0，每瓶附 加15ml植物油，将插有玻璃管(6) (7)的橡胶塞(5)固定在罐体 (1)的上口处，将气泵(4)与空气过滤器(9)断开，把空气过滤 器(9)和罐体(1)之间的硅胶管夹死，将整个气升式生物反应器(除 气泵外)连带罐内培养基一起放入消毒锅内，105'C消毒8小时，取 出放置在超净台上，打开橡胶塞(5);取一支平菇斜面菌种，在无菌条件下，切取2 cm2大小的菌块， 接入一级菌种用气升式生物反应器单罐内的液体培养基中，开启气泵 (4)，调节通气量至0.8-1.2L/(min瓶)，使得培养液中的平菇菌丝 随气泡的移动上下翻滚，在一级菌种用气升式生物反应器内，室温培 养11-13天，形成一级液体菌种；将发酵完成的一级平菇菌种，在无菌条件下，分接至二级菌种用 气升式生物反应器的48个罐体(1)内液体培养基中(二级发酵所用 液体培养基的组成和消毒方式与一级发酵培养基相同)，每瓶接种量
为15ml，开启气泵(4)，调节通气量至0.8-1.2 L/(min瓶)，使得 培养液中的平菇菌丝随气泡的移动上下翻滚，室温培养6天，获得二 级生产用液体菌种。在生产过程结束后，在无菌条件下，打开瓶塞(5)， 取出每瓶中的空气分布器(3)，将罐上塑料盖盖好，即可用于食用菌 生产。实施例4首先将一级菌种使用的气升式反应器打开罐体(1)上口处的橡 胶塞(5)，装入1.8L/瓶液体培养基0.6。/。蛋白胨，0.3%酵母提取物， 5%蔗糖，0. 1%磷酸氢二钾，0.2%硫酸镁，10%小麦水，pH6. 5，每瓶附 加10ml植物油，将插有玻璃管(6) (7)的橡胶塞(5)固定在罐体 (1)的上口处，将气泵(4)与空气过滤器(9)断开，把空气过滤 器(9)和罐体(1)之间的硅胶管夹死，将整个气升式生物反应器(除 气泵外)连带罐内培养基一起放入消毒锅内，103'C消毒8小时，取 出放置在超净台上，打开橡胶塞(5);取一支金针菇斜面菌种，在无菌条件下，切取lcm2大小的菌块， 接入一级菌种用气升式生物反应器单罐内的液体培养基中，开启气泵 (4)，调节通气量至0.8-1.2L/(min瓶)，使得培养液中的金针菇菌 丝随气泡的移动上下翻滚，在一级菌种用气升式生物反应器内，室温 培养10-13天，形成一级液体菌种；将发酵完成的一级金针菇菌种，在无菌条件下，分接至二级菌种 用气升式生物反应器的48个罐体(1)内液体培养基中(二级发酵所用液体培养基的组成和消毒方式与一级发酵培养基相同)，每瓶接种 量为10ml，开启气泵(4)，调节通气量至0.8-1.2 L/(min瓶)，使 得培养液中的金针菇菌丝随气泡的移动上下翻滚，室温培养5天，获 得二级生产用液体菌种。在生产过程结束后，在无菌条件下，打开瓶 塞(5)，取出每瓶中的空气分布器(3)，将罐上塑料盖盖好，即可用 于食用菌生产。 实施例5首先将一级菌种使用的气升式反应器打开罐体(1)上口处的橡
胶塞(5)，装入1.617瓶液体培养基0.2%蛋白胨，0.8%酵母提取物， 3%蔗糖，0.3%磷酸氢二钾，0.2%硫酸镁，10%小麦水，pH7.0，每瓶附 加12ml植物油，将插有玻璃管(6) (7)的橡胶塞(5)固定在罐体(1)的上口处，将气泵(4)与空气过滤器(9)断开，把空气过滤 器(9)和罐体(1)之间的硅胶管夹死，将整个气升式生物反应器(除 气泵外)连带罐内培养基一起放入消毒锅内，105"C消毒8小时，取 出放置在超净台上，打开橡胶塞(5);取一支双孢菇斜面菌种，在无菌条件下，切取2cm2大小的菌块， 接入一级菌种用气升式生物反应器单罐内的液体培养基中，开启气泵(4)，调节通气量至0.8-1.2L/(min瓶)，使得培养液中的双孢燕菌 丝随气泡的移动上下翻滚，在一级菌种用气升式生物反应器内，室温 培养12-15天，形成一级液体菌种；将发酵完成的一级双孢菇菌种，在无菌条件下，分接至二级菌种 用气升式生物反应器的48个罐体(1)内液体培养基中(二级发酵所 用液体培养基的组成和消毒方式与一级发酵培养基相同)，每瓶接种 量为20ml，开启气泵(4)，调节通气量至0.8-1.2 L/(min瓶)，使 得培养液中的双孢菇菌丝随气泡的移动上下翻滚，室温培养6天，获 得二级生产用液体菌种。在生产过程结束后，在无菌条件下，打开瓶 塞(5)，取出每瓶中的空气分布器(3)，将罐体瓶口处用己灭菌的塑 料盖盖好，即可用于食用菌生产。
权利要求
1、一种利用气升式生物反应器生产食用菌液体菌种的方法，其特征在于按下列步骤进行a、取一支食用菌斜面菌种，在无菌条件下，取1-2cm2大小的菌块，接入一级菌种用气升式生物反应器内的液体培养基0.1-1.0％蛋白胨，0.1-1.0％酵母提取物，2-6％蔗糖，0.1-0.3％磷酸氢二钾，0.1-0.3％硫酸镁，10％小麦水，pH 6.0-7.5中，加入消泡剂植物油7.5-20ml/瓶，室温培养10-15天，通气量0.8-1.2L/(min瓶)，形成一级液体菌种；b、将发酵完成的一级菌种，在无菌条件下，分接至二级菌种用气升式生物反应器各单元的液体培养基0.1-1.0％蛋白胨，0.1-1.0％酵母提取物，2-6％蔗糖，0.1-0.3％磷酸氢二钾，0.1-0.3％硫酸镁，10％小麦水，pH 6.0-7.5中，加入消泡剂植物油7.5-20ml/瓶，每瓶接种量为10-20ml，通气量为0.8-1.2L/(min瓶)，室温培养5-7天，获得二级生产用液体菌种，在生产过程结束后，在无菌条件下，取出每瓶中的空气分布器及连接管，将罐上塑料盖盖好，即可用于食用菌生产。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a气升式生物 反应器的容积为2 L/瓶，装液量为1.5-1.8 L/瓶。
3、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a、 b中加入消 泡剂选用一种或数种植物油。
4、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a中涉及的一 级菌种用气升式生物反应器为单罐。
5、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b涉及的一级 菌种分接至二级罐中，二级罐为48个罐。
6、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a、 b中加入液 体培养基的反应器需进行整体消毒，消毒方式为将气泵与空气过滤 器断开，用夹子将空气过滤器与橡皮塞之间的硅胶管夹死，将整个气升式生物反应器及其所有连接管，放入消毒锅中100-105°C，消毒8 小时。
7、根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a、 b中所涉及 的培养基配方中的小麦水的制备方法为50g小麦加入300ml自来水， 煮至200ml，过滤备用。
全文摘要
本发明涉及一种利用气升式生物反应器，规模化进行食用菌液体菌种生产的方法。该方法是将食用菌斜面菌种，在无菌条件下，接入一级菌种用气升式生物反应器内的液体培养基中，室温培养，形成一级液体菌种；将发酵完成的一级菌种，在无菌条件下，分接至二级菌种用气升式生物反应器的各单元液体培养基中，经过15-22天二级连续培养，可获得大量食用菌液体菌种。该方法操作简单，安全可靠，价格低廉，无需摇床、设备简单，特别适用个体菇农使用，从而解决了个体菇农无法生产食用菌液体菌种的现状。
文档编号C12N1/14GK101157895SQ20071014986
公开日2008年4月9日 申请日期2007年9月18日 优先权日2007年9月18日
发明者曹玉锦, 赵民安 申请人:中国科学院新疆理化技术研究所