本发明涉及一种栽培菌种的制备方法，具体是一种基于一次性竹筷再生利用的食用菌枝条菌种的制备方法。
背景技术：
食用菌生产无公害、纯天然，可循环、可再生、环保。食用菌已成为传统农业生产领域中继粮、棉、油、果、菜后的第六大宗农产品；在农业现代化进程中食用菌产业已经成为现代农业发展的排头兵和主力军；国务院发展研究中心的侯正祥称，作为朝阳产业食用菌即将超过中国的粮棉油产业，超过中国的汽车产业。
进入新世纪，我国食用菌生产技术发展日新月异，在许多技术领域不断突破，正由食用菌大国向食用菌强国迈进。然而食用菌栽培菌种制备技术工艺却始终困扰食用菌生产。
原因在于目前生产中普遍使用的“固体菌种”(包括枝条菌种)存在制种周期长，隐性污染几率大，菌龄不齐和难以标准化管理等弊端，导致生产者成本升高，生产风险加大。近年来普遍推广使用的“液体菌种”技术制种周期缩短，菌龄整齐，生产效率高，比传统固体菌种具有明显优势。
然而，由于液体菌种对生产设备设施条件要求高，对生产人员的操作专业水平要求高，对运输和储藏的技术条件要求高，比较适合规模化、机械化的工厂化生产应用，而对于目前国内仍占多数的传统劳动集约化生产模式来说，使用液体菌种存在较大风险。自上世纪90年代起，我国不少科研院所、企业在整体技术、设备投入不完善、不成熟的条件下，急于推广应用食用菌液体菌种，造成大面积污染、绝大多数设备闲置、浪费，导致国内食用菌生产对液体菌种的应用态度暧昧，褒贬不一，生产者不得不又回归“固体菌种”时代。因此我国食用菌液体菌种制备技术亟待创新与升级。
因此，开发一种将液体菌种技术与固体菌种工艺相结合的食用菌菌种制备方法，集成食用菌液体菌种活力强、生长快和固体菌种易保存、使用方便的综合优势，不仅是生产需要的，也是可行的。
一次性竹筷在我国使用数量巨大，大多成为废弃物造成污染和浪费。而竹筷的主要成分是纤维素，对于食用菌生长来说是适宜的营养基质，可以用来作为培养食用菌的载体，尤其是制备食用菌枝条菌种的良好材料。枝条菌种是食用菌生产中经常使用的一类固体菌种形式。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种基于一次性竹筷再生利用的食用菌栽培菌种的制备方法，该方法提高了菌种质量和生产效率。
为了达到上述技术目的，本发明的技术方案是：
一种基于一次性竹筷再生利用的食用菌栽培菌种的制备方法，包括以下步骤：
(1)竹筷经过清洗，使竹筷吸透水，然后将竹筷打毛，使竹筷表面变粗糙；
(2)将食用菌菌株接种到PDA斜面培养基中进行活化培养；
(3)配置液体培养基，液体培养基包括葡萄糖2.00g～2.50g/100mL，酵母浸出物0.20g～0.30g/100mL，磷酸二氢钾0.20g～0.25g/100mL，硫酸镁0.10g～0.15g/100mL,121℃灭菌20min。液体培养基优选包括葡萄糖2.00g/100mL，酵母浸出物0.20g/100mL，磷酸二氢钾0.25g/100mL，硫酸镁0.15g/100mL。
(4)将PDA斜面培养基中活化好的食用菌菌丝体接种于液体培养基中。
(5)在发酵温度为24～26℃，优选25℃，摇床转速为160～180r/min(摇床转速优选180r/min)条件下发酵，发酵时间为6d。
(6)将发酵好的液体菌丝球打碎，用无菌水稀释倍数300-500倍获得液体菌种。
(7)配制种包栽培辅料，所述种包栽培辅料包括以下质量百分比组分：木屑40％、棉籽壳50％、麸皮8％、石膏粉1％和石灰粉1％。上述种包栽培辅料加水至60％的含水量。
(8)种包栽培辅料内排满处理好的竹筷，数量为120-140支竹筷/包，竹筷的间隙和表面用辅料覆盖。
(9)将种包放入蒸汽灭菌锅内灭菌，在0.103MPa，121℃的蒸汽压力下对竹筷灭菌40-50分钟；灭菌完成后，袋袋温降到33℃以下，接种培养好的食用菌液体菌丝，接种量为20-25mL/包。
在食用菌技术研究及生产应用中，一般的固体基质(竹筷等)的灭菌条件为0.138MPa，126℃，灭菌120分钟左右，这种灭菌条件耗时耗能，而且造成竹筷基质营养成分的流失。本发明的灭菌参数不仅能够起到很好的灭菌效果，而且减少了竹筷基质营养成分的流失和能源的浪费，其技术原理是：利用液体菌接种竹筷枝条萌发快、生长迅速的特点(液体菌丝可以迅速布满竹筷表面并向内部生长，使食用菌菌丝生长处于优势状态，从而抑制杂菌生长)，在适当降低灭菌参数的同时，不会影响竹筷表面食用菌菌丝正常生长；另一方面，由于本发明的灭菌参数降低了处理温度，缩短了处理时间，从而减少了竹筷基质营养成分的流失和能源的浪费。
液体菌转接竹筷枝条包时，接种量的大小直接影响接种后菌丝萌发生长效果。如果接种量小，不仅菌丝生长缓慢，而且较长的生长周期容易造成枝条被杂菌污染。若接种量大，不仅造成资源浪费，而且对卫生环境和制冷、通风设备要求高，无法适应技术力量薄弱，菌种技术人员不足的工厂，特别是无法很好地适用于分散式种植农户。更重要的是，接种量大，会在枝条表面形成一层菌粘膜，菌粘膜将阻碍外部新鲜空气进入，这将导致内部菌丝因缺氧而无法正常生长，最终造成杂菌侵染，增加液体菌种的使用风险。20-25mL/140枝/包的接种量克服了上述的矛盾，在确保萌发效果的基础上，减少资源的浪费，避免在枝条表面形成一层菌粘膜，不会阻碍新鲜空气的进入，确保了氧气的正常供应，保证了菌丝的正常生长。
(10)将接种好的种包袋置于26℃条件下培养,当菌丝长满袋后，继续培养3-5天，使包内竹筷长满菌丝。
本发明将食用菌液体菌种代替固体培养物接种竹筷，结合食用菌枝条菌种培养技术，形成“液体菌种+竹筷”的食用菌菌种制备工艺，一方面改进了原来液体菌种技术操作难，易污染的不足，同时提高了传统枝条菌种质量和生产效率，使枝条菌种生产周期缩短至原来的2/3，生产性状无明显下降，且具有萌发快的优势。
具体实施方式
试验菌种：杏鲍菇。
PDA固体培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000mL，pH自然。
(1)将一次性竹筷(如废旧一次性竹筷)截成长7.5cm、直径0.5公分长条，竹筷经过清洗，使竹筷吸透水，然后将竹筷打毛，使竹筷表面变粗糙。
(2)将食用菌菌株接种到PDA斜面培养基中进行活化培养。
(3)配置液体培养基，液体培养基包括葡萄糖2.00g/100mL，酵母浸出物0.20g/100mL，磷酸二氢钾0.25g/100mL，硫酸镁0.15g/100mL，121℃灭菌20min。
(4)将PDA斜面培养基中活化好的食用菌菌丝体接种于液体培养基中。
(5)在发酵温度为25℃，摇床转速为180r/min条件下发酵，发酵时间为6d。
在上述液体培养基及发酵条件下，发酵菌丝体生物量(干重)可达到1.93g/100mL，产量提高了1.24倍。
(6)将发酵好的液体菌丝球打碎，用无菌水稀释倍数500倍获得液体菌种。
纯菌种在不同稀释度条件下，当接种量为10mL/袋时，菌丝的生长速度相对较慢，当接种量为20mL/袋和30mL/袋时的菌丝生长速度基本一致，都在同一天长满栽培袋的，而且其菌丝生长速度都大于接种量为10mL/袋时的生长速度。稀释500倍的菌种的菌丝生长速度相对也是最快。所以综合来看，纯菌种的最佳稀释倍数为500倍。
(7)配制种包栽培辅料，所述种包栽培辅料包括以下质量百分比组分：木屑40％、棉籽壳50％、麸皮8％、石膏粉1％和石灰粉1％。上述种包栽培辅料加水至60％的含水量。
(8)种包栽培辅料内排满处理好的竹筷，数量为140支竹筷/包，竹筷的间隙和表面用种包栽培辅料覆盖。
(9)将种包放入蒸汽灭菌锅内灭菌，在0.103MPa，121℃的蒸汽压力下对竹筷灭菌50分钟；灭菌完成后，待袋温降到33℃以下，接种培养好的食用菌液体菌丝，接种量为25mL/包。
当接种量为20mL/包时，菌丝的生长与接种量为25mL/包时无明显的区别，基本相当。
(10)将接种好的种包袋置于26℃条件下培养,当菌丝长满袋后，继续培养3-5天，使包内竹筷长满菌丝。
当菌丝长满袋后，继续培养3-5天进行扩大栽培；，使包内竹筷内部长满菌丝。
由于液体菌种生长迅速，接种竹筷后，竹筷制种包发菌速度明显加快。采用传统制备工艺生产枝条种周期为30-40天，利用“液体菌种+竹筷”技术，菌种生产周期为20-25天。
上述实施例不以任何方式限制本发明，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。