专利名称：利用脐带胎盘制备间充质干细胞的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备间充质干细胞的方法，尤其是利用脐带胎盘 制备间充质干细胞的方法。
背景技术：
间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs )是近年来研究的 一个热点，间充质干细胞具有多向分化能力，体外扩增能力强，抗原 性弱，不涉及伦理道德等问题。
骨髓间充质干细胞(BMSCs)是骨髓中中胚层来源的未分化细胞， 具备分化为成骨细胞、肌细胞、血管内皮细胞等多种组织细胞及高增 殖的潜能。其有以下优势①取材方便；②对供体健康无害；(D体外 扩增能力强、不易丟失细胞表型；④不存在组织配型的问题。但是随 着年龄的增长，骨髓中BMSCs的含量会降低，增加了分离培养的难度， 而且得到的细胞增殖分化的能力会降低。
近些年来，人们从脐带、胎盘中也陆续分离出间充质干细胞。其 具有骨髓基质干细胞相同的特点，细胞的扩增分化能力不受年龄的影 响。胎盘及脐带来源丰富，其间充质细胞产量^L高，因此，可为临床 应用、组织工程提供理想的种子细胞。
许多专利申请公开了制备间充质干细胞的方法，例如国际专利申 请WO2005/121317中公开了从人类组织中获得具有高均质性细胞悬液 的间充质纟田月包的方法；国际专利申请WO2005/045010、 WO2005/045011
4中公开了自脐带血分离和培养间充质细胞的方法；中国专利CN100344757C中公开了 一种人胎盘、脐带间充质干细胞库及其构建方法，在这些专利申请中，间充质细胞的培养基中主要采用青霉素、链霉素作为抗生素，并且使用动物源性的血清、胰蛋白酶等物质培养或消化细胞。由于青霉素容易导致过敏反应，而链霉素对人体有潜在毒性，对间充质细胞以后应用于人类疾病的治疗有潜在危险。另外，在将间充质干细胞用于人类疾病治疗时，降低动物源性物质对人类的影响也是必要的。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是 一种利用脐带胎盘制备间充质干细胞的方法，所述间充质干细胞来源于脐带胎盘中分离培养的间充质干细胞，在间充质培养基中体外扩增后，再冷冻保存。
所用的组织来源是人的脐带或胎盘。
所述的制备间充质干细胞的方法，包括脐带或胎盘的机械切割、酶消化，间充质干细胞的分离培养，间充质干细胞的体外扩增，间充质干细胞的冻存。
所述的制备间充质干细胞的方法，首先将脐带或胎盘进行机械切割，然后使用胶原酶消化，制备成单细胞悬液。
所述的胶原酶浓度为0.01-1%,使用培养基配制。
所述的胶原酶浓度为0.1%,使用DMEM / F12培养基配制。
间充质干细胞培养基为低胎牛血清培养基(胎牛血清含量^5% )。脐带胎盘的机械切割、酶消化、间充质干细胞分离培养、体外扩增、冻存所用液体中加的抗生素不包括青霉素及链霉素。
脐带胎盘的机械切割、酶消化、间充质干细胞分离培养、体外扩
增、冻存所用液体中加的抗生素为庆大霉素，浓度为lOOOOu/L-40000u/L，建议浓度20000u/L。
间充质干细胞冻存所用血清为人血清。
间充质千细胞消化传代所用酶无动物源性。
间充质干细胞消化传代所用酶为TrypLE Select。
所述的利用脐带胎盘制备间充质干细胞的方法，包括以下步骤
A、 将体外处理干净的脐带胎盘经过机械切碎后，再经过胶原酶消化为单细胞悬液，洗涤去除胶原酶残留，之后接种于培养瓶、培养皿或培养袋内；
B、 在低胎牛血清间充质培养基中培养，经数次换液、传代后得到较纯的间充质干细胞；
C、 将获得的间充质细胞重悬于含人血清20%-90%的DMEM/F12培养基中，加入冷冻保护剂，使用程控降温仪或非程控降温，深低温气相中永久保存。
上述方法制备的间充质干细胞可用于实验研究，也可在临床上用于与造血干细胞共移植治疗血液系统疾病或其它胂瘤的辅助治疗，直接或经基因修饰后用于治疗脑血管、心血管、外周血管闭塞性疾病或其他存在供血障碍的疾病，还可用于肿瘤性及炎症性疾病抑制血管新生，还可用于组织工程中作为种子细胞。
本发明的有益效果使用本方法制备的间充质干细胞具有良好增
殖潜力，而且来源丰富，供者无痛苦，致敏及动物源性物质含量少，为解决间充质干细胞的来源及增殖能力差的问题提供了解决方法，为组织工程提供良好的种子细胞来源，可建成细胞库，快速、反复、大量提供细胞来源。
图1为本发明制备的间充质干细胞。
具体实施例方式
下面，结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不受限于下述实施例。
实施例l:脐带来源间充质干细胞制备方法
1、 取健康足月顺产婴儿脐带，用加入含庆大霉素(浓度2-4万U/L)肝素(浓度50-200U/ml)的生理盐水冲洗表面，去除残留血液及可能的细菌污染，至少三次，每次更换容器及器械。
2、 机械粉碎组织，加入4 - 5倍体积的0.01-1%胶原酶消化液，37°C ,搅拌，4-12小时后收集消化液，200目滤网过滤，细胞悬液加入2倍体积洗涤液(DMEM/F12)洗涤两遍，使用低胎牛血清间充质培养基
(MesenPRO RSTM Medium, invitrogen)重悬沉淀后接种于培养瓶中，24 - 72小时后全量换液，每3天半量换液。3、 待细胞生长至80-90%融合时，进行传代操作。弃去培养基，PBS洗涤细胞一次，加入TrypLE Select (invitrogen)消化5-10分钟，加入无血清DMEM / F12终止消化，离心弃上清，再加入无血清DF12洗涤一次。沉淀用适量低胎牛血清间充质培养基重悬，按l: 2-3传代。培养3-4代后取样鉴定间充质干细胞，其余细胞加入冻存液(40%DMEM/F12 50。/。人血清10%DMSO),细胞浓度106-107/ml，经程控降温后，置于深低温气相中永久保存。
4、 间充质干细胞的鉴定。分为免疫表型测定及分化能力测定。
4.1、免疫表型检测CD14， CD31， CD44， CD45， CD105, CD144,VWF, CD29, CD34， CD73， CD90， CD95， CD 106， KDR， HLA-DR。使用TrypLE Select消化体外扩增的第3-4代的间充质干细胞，PBS洗涤2次，分成每管含5xl()S细胞，第一管加入同型对照抗体(MouseIgGl FITC/Mouse IgGl PE， coulter) 20ul，其余管中加入其它相应抗体20ul (或者按使用说明书规定的试剂量加入)，混匀，室温避光静置30分钟，加入PBS(pH7.2 _ 7.4) 2ml，混匀，300g离心5分钟，弃上清，加入1。/。多聚曱醛400ul，混匀，即可上机(流式细胞仪FACSCalibur， BD)检测。细胞免疫表型为CD73、 CD105为阳性，CD31、 vWF、 KDR、 CD34、 CD45、 CD235a、 HLA-DR为阴性。
4.2细胞的成骨及成脂分化潜能及分化后鉴定
消化体外扩增的第3-4代间充质干细胞，以5 x 10Vcm2的密度接种于预先放置无菌消毒盖玻片的6孔板中，制备细胞爬片，每孔加2ml上述分离培养基。在细胞达到60% ~70%融合时，更换诱导分化培养基。4.2.1成骨诱导分化
诱导分化培养基为含有l(T7mol/L的地塞米松，10mmol/L (3-磷酸甘油，0. 05mmol / L 2-石粦酸抗坏血酸和10 % FBS的DMEM / F12培养液，每周换液2次，培养21天。取出玻片，PBS洗涤一次，70%酒精固定10分钟，行茜素红及范可萨染色，显微镜下观察。范可萨染色可见黑色矿化物沉积，茜素红染色见细胞浆中有大量的钙沉积。
4.2.2成脂诱导分化
诱导分化培养基为含有10—6mol / L的地塞米松，10ug/ml胰岛素，0. 5mmol/L异丁基甲基黄嘌吟(IBMX), 200umol / L消炎痛(均为Sigma公司产品)和10 % FBS的DMEM / F12培养液，每周换液2次，培养14天。取出玻片，PBS洗涤一次，70%酒精固定10分钟，以油红O染色，镜检。可见油红-O染色呈强阳性。
实施例2:胎盘来源间充质干细胞制备方法
1 、取健康足月顺产婴儿胎盘，用加入含庆大霉素(浓度2-4万U /L )肝素(50-200U/ml)的生理盐水沖洗表面，去除残留血液及可能的细菌污染，至少三次，每次更换容器及器械。
2、 机械粉碎组织，加入4-5倍体积的胶原酶消化液，37°C，搅拌，4-12小时后收集消化液，200目滤网过滤，细胞悬液加入2倍体积洗涤液
(DMEM /F12 )洗涤两遍，使用低胎牛血清间充质培养基(MesenPRORS Medium, invitrogen )重悬沉淀后接种于培养瓶中，24-72小时后全量换液，每3天半量换液。
3、 待细胞生长至80-90%融合时，进行传代操作。弃去培养基，PBS
9洗涤细胞一次，加入TrypLETM Select (invitrogen)消化5-10分钟，加入无血清DMEM / F 12终止消化，离心弃上清，再加入无血清DMEM / F12洗涤一次。沉淀用适量间充质培养基重悬，按l: 2-3传代。培养3-4代后取样鉴定间充质干细胞，其余细胞加入冻存液(40% DMEM / F1250%人血清10%DMSO),细胞浓度106-107/1111，经程控降温后，置于液氮中永久保存。
4、间充质干细胞的鉴定分为免疫表型测定及分化能力测定
4.1、免疫表型检测CD14， CD31， CD44, CD45, CD105， CD144，VWF， CD29, CD34， CD73， CD90， CD95, CD106， KDR, HLA-DR。使用1%胰蛋白酶消化体外扩增的第3-4代的间充质干细胞，PBS洗涤2次，分成每管含5xl()S细胞，第一管加入同型对照抗体(Mouse IgGlFITC/ Mouse IgGl PE ) 20ul，其余管中加入其它相应抗体20ul (或者按使用说明书规定的试剂量加入)，混匀，室温避光静置30分钟，加入PBS2ml，混勾，300g离心5分钟，弃上清，加入1%多聚曱醛400ul，混勻，即可上机(流式细胞仪FACSCalibur， BD)检测。细胞免疫表型为CD73、 CD105为阳性，CD31、 vWF、 KDR、 CD34、 CD45、 CD235a、HLA-DR为阴性。
4.2细胞的成骨及成脂分化潜能及分化后鉴定
消化体外扩增的第3-4代间充质干细胞，以5xl()S/ci^的密度接种于预先放置无菌消毒盖玻片的6孔板中，制备细胞爬片，每孔加2ml上述分离培养基。在细胞达到60% ~70%融合时，更换诱导分化培养基。
4.2.1成骨诱导分化诱导分化培养基为含有10 —7mol/L的地塞米^>， lOmmol /L (3-磷酸甘油，0. 05mmol/L2-磷酸抗坏血酸和10。/。胎牛血清(FBS)的DMEM-LG/F12培养液，每周换液2次，培养21天。取出玻片，PBS洗涤一次，70%酒精固定10分钟，行茜素红及范可萨染色，显微镜下观察。范可萨染色可见黑色矿化物沉积，茜素红染色见细胞浆中有大量的钙沉积。
4.2.2成脂诱导分化
诱导分化培养基为含有10 —6mol / L的地塞米;^， 10ug/ml胰岛素，0.5mmol/L异丁基曱基黄噤吟(IBMX), 200umol / L消炎痛(均为Sigma公司产品)和10 % FBS的DMEM-LG / F12培养液，每周换液2次，培养14天。取出玻片，PBS(pH7.2-7.4)洗涤一次，70%酒精固定10分钟，以油红O染色，镜检。可见油红-O染色呈强阳性。
上述方法制备的间充质干细胞可用于实验研究，也可在临床上用于与造血干细胞共移植治疗血液系统疾病或其它肿瘤的辅助治疗，直接或经基因修饰后用于治疗脑血管、心血管、外周血管闭塞性疾病或其他存在供血障碍的疾病，还可用于肺瘤性及炎症性疾病抑制血管新生。还可用于组织工程中作为种子细胞。
综上所述，本发明的内容并不局限在的实施例中，本领域技术人员可以在本发明的技术指导思想之内提出其他实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。
ii
权利要求
1、一种利用脐带胎盘制备间充质干细胞的方法，包括脐带或胎盘的机械切割、胶原酶消化，间充质干细胞的分离培养，间充质干细胞的体外扩增，间充质干细胞的冻存，其特征在于，所述的胶原酶使用培养基配制，浓度为0.01-1％。
2、 根据权利要求1所述的利用脐带胎盘制备间充质干细胞的方法， 其特征在于，所述的月交原酶使用DMEM / F12培养基配制。
3、 根据权利要求1所述的利用脐带胎盘制备间充质干细胞的方法， 其特征在于，间充质干细胞培养基为胎牛血清含量^5%的低胎牛血清 培养基。
4、 根据权利要求1所述的利用脐带胎盘制备间充质干细胞的方法， 其特征在于，冻存所用液体中加的抗生素为庆大霉素，浓度为10000u/L-40000u/L。
5 、根据权利要求4所述的利用脐带胎盘制备间充质干细胞的方法， 其特征在于，庆大霉素的浓度为20000u/L。
6、 根据权利要求1所述的利用脐带胎盘制备间充质干细胞的方法， 其特征在于，间充质干细胞冻存所用血清为人血清。
7、 根据权利要求1所述的利用脐带胎盘制备间充质干细胞的方法， 其特征在于，间充质干细胞消化传代所用酶无动物源性。
8、 根据权利要求7所述的利用脐带胎盘制备含有间充质干细胞的 方法，其特征在于，间充质干细胞消化传代所用酶为TrypLETMSelect。
9、 根据权利要求1所述的利用脐带胎盘制备间充质干细胞的方法，包括以下步骤A、 将体外处理干净的脐带胎盘经过机械切碎后，再经过胶原酶消化为单细胞悬液，洗涤去除胶原酶残留，之后接种于培养瓶、培养皿或培养袋内；B、 在低胎牛血清间充质培养基中培养，经多次换液、传代后得到 较纯的间充质干细胞；C、 将获得的间充质干细胞重悬于含人血清20%-90%的DMEM/ F12培养基中，加入冷冻保护剂，使用程控降温仪或非程控降温，深低 温气相中永久保存。
全文摘要
本发明公开了一种利用脐带、胎盘制备间充质干细胞的方法，主要涉及一种间充质干细胞的新型来源及其制备方法。该干细胞采用胎盘或脐带作为细胞来源，首先消化组织，制备单细胞悬液，接种于培养瓶、培养皿或培养袋中，扩增间充质干细胞，然后将扩增后的间充质干细胞消化收集后冻存。按照本发明技术制备的间充质干细胞，含有大量有良好增殖潜力的间充质干细胞。该间充质干细胞可用于实验研究临床治疗、组织工程等应用。其原料来源丰富、分离成功率及产率高，细胞增殖能力强，致敏及动物源性物质含量低。
文档编号C12N5/08GK101492654SQ20081010203
公开日2009年7月29日 申请日期2008年3月17日 优先权日2008年3月17日
发明者孟恒星, 钏 石, 韩俊领, 黄家学 申请人:协和干细胞基因工程有限公司