专利名称：临床治疗用脐带胎盘间充质干细胞的制备储存和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于临床治疗用的脐带胎盘干细胞，及其制备，储存和应用。具体地说是涉及一种不 同于一般细胞库的方法，而是旨在临床治疗用的脐带和胎盘的干细胞，库，和其制备与储存。
背景
由于干细胞对多种疾病潜在的临床治疗作用，干细胞己被在基础医学试验方法上进行了广泛的研究。 然而由于其基础研宄的特性和向临床应用的过度方式的特质，使这些研究在临床治疗用干细胞的制备，储
存和应用方面有所欠缺。并为所储存的干细胞被病原体的污染，和所储存的不同个体干细胞之间的交互污 染留下隐患。从而为这些干细胞的临床应用埋下潜在危险，使这些干细胞丧失临床应用价值。本发明公开 用于临床治疗所用的安全的脐带，胎盘干细胞，和库，以及这些干细胞的制备，储存和应用的方法。
背景技术：
近年来有关干细胞的研究日益深化，新的发现已使干细胞在人类与疾病斗争中又增添了全新的武器。 目前，新的干细胞多向性分化(plasticity)的发现是可以将来源于不同组织的干细胞用于器官、组织疾 病的治疗，例如比较容易获得的造血干细胞和间充质干细胞己被广泛应用于不同疾病治疗的研究，比较明 显的结果是有关心血管疾病、神经损伤、代谢疾病的研究。胎盘及脐带间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC脐带，胎盘的干细胞)在疾病治疗中的作用已在动物实验和人类疾病的治疗中取得进展和证实。 这些疾病包括Alzheimer病(痴呆症)、脊髓损伤、中风、烧伤、心脏病、糖尿病、骨关节炎和类风湿性 关节炎等。
早期的间充质干细胞的研究立足于对这些细胞的生物特性和功能的研究。其后的一些细胞库的研宄则 处于这些研究结果过度之中。由于其基础研究的特性和向临床应用的过度方式的特质，使这些研究在临床 治疗用干细胞的制备储存和应用方面有所欠缺。主要表现为
1 正常分娩时由于胎盘脐带经由有菌的阴道娩出。许多正常分娩的脐带不能得到很好地处理，从而
使这些脐带不能用于干细胞的储存。
2 由于有些脐带被病原体污染，所获的一些脐带在培养过程中，细菌，霉菌等繁殖，造成对其它细
胞和其他个体储存物的污染。
3 更为严重的是由于目前一般储存中多采用在液氮中浸泡法储存，这样就会使被储存的细胞之间经
由液氮液相的交互污染的危险机会增加。
4 在使用有盖的塑料储存管时，由管盖口泄露也对其他标本交互污染的机会大大增加。
以上由于正常分娩的带菌性大大限制了这些个体的脐带，胎盘间充质干细胞的可储存性，甚至这些储 存被仅限于刨腹产者。更为严重的是诸项中的细菌，霉菌，液相交互污染，和储存物从管口外泄导致的交 互污染都会对将来的临床治疗的应用造成巨大的问题。并为所储存的干细胞被病原体的污染，和所储存的 不同个体干细胞之间的细胞，DNA， RNA等的交互污染留下隐患。从而为这些干细胞的临床应用埋下潜 在危险，使这些干细胞丧失临床应用价值。因而目前这些问题是为保证干细胞临床治疗安全性；和使广大 正常阴道分娩孕妇的干细胞也可得到应用所需亟待解决的问题。
本发明的目的就是在于克服以上问题，提供用于临床治疗所用脐带，胎盘干细胞，库和这些细胞的制 备和储存，为临床干细胞的治疗在安全上提供保障。
发明内容
本发明内容的技术方案步骤如下1) 正常阴道分娩胎盘，脐带的去污染处理，a) 用无菌生理盐水冲洗胎盘和脐带去除肉眼可见的污物和残留血液。b) 用2%医用碘酒和75%医用酒精，或其它中高强度消毒剂对脐带，胎盘表面处理。c) 根据情况以手工分离，或专用仪器去除0.5 mm左右的脐带胎盘外表面。去除过程中外表面不接 触无菌的内侧组织。(图一)d) 以上方法确保包括待处理的胎盘，脐带组织的无菌，和干细胞的最好回收率，并为后期工作减少 需处理的组织量和消化酶的使用量。e) 所储存个体常规进行组织配型(HLA)，生物学，病源微生物检测。同时建立临床用脐带，胎盘间 充质干细胞库的数据库，制备与所储存者的各类细胞，个人资料数据库，和各项报告相一致的数 据卡和条形码。2) 间充质干细胞的制备和培养。a) 使用无菌手动，或自动方法处理脐带或胎盘组织至小于1 mm大小b) 进-步可使用无菌组织研磨设施处理组织至更小的颗粒c) 室温离心250g5分钟，弃去上清，收集细胞，用DMEM清洗。再次离心和清洗。d) 常规胶原酶，胰蛋白酶处理组织。e) 常规收集储存第一代和培养后收集第二，三代间充质干细胞。f) 培养采用Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM, Gibco, USA), 10%自身血清或正常人AB血 清，1。/。glutamine (Gibco， USA)及无血清培养液3) 脐带间充质干细胞的安全储存。a) 脐带间充质干细胞以无菌的方式根据需要收集在无菌的2或5ml细胞储存管屮。Corning 2mL Vial (430661)， Corning 5mL Vial, (430663),或冷冻袋'E叩endorf等低温冷冻管中。b) 含有干细胞的储存管加密封盖。c) 加盖后的细胞储存管进一步用高质量聚酯膜，EVO共聚物膜，Teflon FEP film或其它适用于 -210摄氏度的双层膜覆盖并用抽空密封法封存各管。每一储存者拥有各自的密封的储存系统。该 各自系统含有与计算机，纸文件档案相一致的封存的条形码和储存者的信息(图二)。 在使用冷 冻袋时，同样处理。这些个体干细胞储存系统储存于蒸汽液氮罐的汽相部分。d) 为安全和临床实际需要，备查管分二级保管和待查。 一份存于-80度冰箱，另一份存于C项描 述的密封存储系统。(图二)e) 所有经以上方法处理的细胞储存在MVE摄氏-190度高效能蒸汽液氮罐Vapor (MVE 815P-190, MVE 1536P-190, MVE 1879P-190)的汽相中，或其它厂家的摄氏-190度的蒸汽式液氮储存罐的汽 相中。经以上方法处理的干细胞，及其干细胞库和储存方法可以避免由于液相浸泡所导致的细菌，霉菌等病 原体，其他人的细胞，DNA， RNA等的交互污染。也可避免因所用管盖泄漏引起的对其他储存者干细胞 的污染，使储存的干细胞的安全性和将来的临床应用得以保证。同时大f节省储存空间。进而降低成本。图例说明(图一)以手工分离，或专用仪器去除0.5 mm左右的脐带胎盘外表面。去除过程中外表面不接触无 菌的内侧组织。(图二)以储存管为例的安全储存干细胞的个人储存系统。
具体实施例方式
实施例1:正常阴道分娩胎盘，脐带的去污染处理。用无菌生理盐水冲洗胎盘和脐带去除肉眼可见的污物和残留 血液。用2%医用碘酒30秒，后75%医用酒精脱碘。以手工分离0.5 mm左右的脐带胎盘外表面。去除过程中外表面不接触无菌的内侧组织。所储存个体常规进行组织配型(HLA)，生物学，病源微生物检测。 同时建立临床用脐带，胎盘间充质干细胞库的数据库，制备与所储存者的各类细胞，个人资料数据库，和 各项报告相一致的数据卡和条形码。间充质干细胞的制备和培养。使用无菌手动，或自动方法处理脐带或胎盘组织至小于1 mm大小。室温离心250g5分钟，弃去上清， 收集细胞，用DMEM清洗。再次离心和清洗。常规胶原酶，胰蛋白酶处理组织。常规收集储存第一代和 培养后收集第二，三代间充质干细胞。培养采用Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM， Gibco， USA),川％自身血清培养液。挤带间充质干细胞以无菌的方式根据需要收集在无菌的5ml细胞储存管中。Coming 5mL管， (430663),中，2ml的作为待査管。含有干细胞的储存管加密封盖。加盖后的细胞储存管进一步用高质量聚 酯膜，双层膜覆盖并用抽空密封法封存各管。每一储存者拥有各自的密封的储存系统。该各自系统含有与 计算机，纸文件档案相一致的封存的条形码和储存者的信息。这些个体干细胞储存系统储存于MVE摄氏 -190度高效能蒸汽液氮罐Vapor (MVE 815P-190, MVE 1536P-190, MVE 1879P-190)的汽相中。为安全和 临床实际需要，备查管分二级保管和待查。 一份存于-80度冰箱，另一份存于上项描述的密封存储系统。实施例2:正常阴道分娩胎盘，脐带的去污染处理。用无菌生理盐水冲洗胎盘和脐带去除肉眼可见的污物和残留 血液。用2%医用碘酒和75%医用酒精，脐带胎盘表面处理。根据情况以手工和专用仪器去除0.5 mm左 右的脐带胎盘外表面。去除过程中外表面不接触无菌的内侧组织。所储存个体常规进行组织配型(HLAJ. 生物学，病源微生物检测。同时建立临床用脐带J台盘间充质干细胞库的数据库，制备与所储存者的各类 细胞，个人资料数据库，和各项报告相一致的数据卡和条形码。间充质干细胞的制备和培养。使自动方 法处理脐带或胎盘组织至小于1 mm大小。进一步使用无菌组织研磨设施处理组织至更小的颗粒。室温 离心250g5分钟，弃去上清，收集细胞，用DMEM清洗。再次离心和清洗。常规胶原酶，胰蛋白酶处 理组织。常规收集储存第一代和培养后收集第二，三代间充质干细胞。培养采用Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM， Gibco， USA), 无血清培养液。脐带间充质干细胞的安全储存于冷冻袋,进一步用Teflon FEP film膜覆盖并用抽空密封法封存各袋。 每一储存者拥有各自的密封的储存系统。该各自系统含有与计算机，纸文件档案相一致的封存的条形码和 储存者的信息。这些个体干细胞储存系统储存于蒸汽液氮罐的汽相部分。为安全和临床实际需要，备査管 分二级保管和待査。 一份存于-80度冰箱，另一份存于上项描述的密封存储系统。所有经以上方法处理的 细胞储存在MVE摄氏-190度高效能蒸汽液氮罐V邻or (MVE815P-190, MVE 1536P-190'MVE 1879P-190) 的汽相中。实施例3:用带有青霉素，链霉素的无菌生理盐水冲洗胎盘和脐带去除残留血液。用医用H202快速处理胎盘， 脐带表面。根据情况以手工分离，或专用仪器去除0.5 mm左右的脐带胎盘外表面。去除过程中外表面不 接触无菌的内侧组织。所储存个体常规进行组织配型(HLA),生物学，病源微生物检测。同时建立临床 用脐带，胎盘间充质干细胞库的数据库，制备与所储存者的各类细胞，个人资料数据库，和各项报告相一致 的数据卡和条形码。使用无菌手动，或自动方法处理脐带或胎盘组织至小于lmm大小。进一步可使用无菌组织研磨设施 处理组织至更小的颗粒。室温离心250g5分钟，弃去上清，收集细胞，用带青霉素，链霉素DMEM清洗。 再次离心和清洗。常规胶原酶，胰蛋白酶处理组织。常规收集储存第一代和培养后收集第二，三代间充质 干细胞。培养采用Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM, Gibco， USA), 正常人AB血清'1% glutamine (Gibco, USA)。脐带间充质干细胞以无菌的方式根据需要收集在无菌低温冷冻管中。含有干细胞的储存管加密封盖。加盖后的细胞储存管进一步用高质量聚酯膜，EVO共聚物膜，Teflon FEP film或其它 适用于-210摄氏度的双层膜覆盖并用抽空密封法封存各管。每一储存者拥有各自的密封的储存系统。该 各自系统含有与计算机，纸文件档案相一致的封存的条形码和储存者的信息。这些个体干细胞储存系统 储存于蒸汽液氮罐的汽相部分。为安全和临床实际需要，备査管分二级保管和待査。 一份存于-80度冰箱， 另一份存于密封存储系统。所有经以上方法处理的细胞储存在MVE摄氏-190度高效能蒸汽液氮罐Vapor (MVE815P-190, MVE 1536P-190, MVE 1879P-190)的汽相中，或其它厂家的摄氏-190度的蒸汽式液氮储 存罐的汽相中。经以上方法处理的干细胞，及其干细胞库和储存方法可以避免由于液相浸泡所导致的细菌，霉菌等病 原体，其他人的细胞，DNA， RNA等的交互污染。也可避免因所用管盖泄漏引起的对其他储存者干细胞 的污染，使储存的干细胞的安全性和将来的临床应用得以保证。同时大量节省储存空间。进而降低成本。
权利要求
1干细胞制备时正常阴道分娩胎盘，脐带的去污染处理。a)用无菌生理盐水冲洗胎盘和脐带去除肉眼可见的污物和残留血液。b)用2％医用碘酒和75％医用酒精，或其它中高强度消毒剂对脐带，胎盘表面处理。c)根据情况以手工分离，或专用仪器去除0.5mm左右的脐带胎盘外表面。去除过程中外表面不接触无菌的内侧组织。(图一)d)以上方法确保包括待处理的胎盘，脐带组织的无菌，和干细胞的最好回收率，并为后期工作减少需处理的组织量和消化酶的使用量。e)所储存个体常规进行组织配型(HLA)，生物学，病源微生物检测。同时建立临床用脐带，胎盘间充质干细胞库的数据库，制备与所储存者的各类细胞，个人资料数据库，和各项报告相一致的数据卡和条形码。
2 根据权利要求1)，间充质干细胞的制备和培养。a) 使用无菌手动，或自动方法处理脐带或胎盘组织至小于lmm大小b) 进一步可使用无菌组织研磨设施处理组织至更小的颗粒c) 室温离心250g5分钟，弃去上清，收集细胞，用DMEM清洗。再次离心和清洗。d) 常规胶原酶，胰蛋白酶处理组织。e) 常规收集储存第一代和培养后收集第二，三代间充质干细胞。f) 培养采用Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM， Gibco， USA), 10%自身血清或正常人AB血 清，1% glutamine (Gibco， USA)及无血清培养液
3 根据权利要求l)， 2),脐带间充质干细胞的安全储存。a) 脐带间充质干细胞以无菌的方式根据需要收集在无菌的2或5ml细胞储存管中。Coming 2mL Vial (430661)， Corning 5mL Vial, (430663),或冷冻袋，Eppendorf等低温冷冻管中。b) 含有干细胞的储存管加密封盖。c) 加盖后的细胞储存管进一步用高质量聚酯膜，EVO共聚物膜，Teflon FEP film或其它适用于 -210摄氏度的双层膜覆盖并用抽空密封法封存各管。每一储存者拥有各自的密封的储存系统。该 各自系统含有与计算机，纸文件档案相一致的封存的条形码和储存者的信息(图二)。 在使用冷 冻袋时，同样处理。这些个体干细胞储存系统储存于蒸汽液氮罐的汽相部分。d) 为安全和临床实际需要，备査管分二级保管和待査。 一份存于-80度冰箱，另一份存于C项描 述的密封存储系统。(图二)e) 所有经以上方法处理的细胞储存在MVE摄氏-190度高效能蒸汽液氮罐Vapor (MVE 815P-190, MVE 1536P-190, MVE 1879P-190)的汽相中，或其它厂家的摄氏-190度的蒸汽式液氮储存罐的汽 相中。
4 根据权利要求1)，对于正常由阴道分娩的脐带，胎盘的去污染处理包括消毒剂的使用和被污染组织的 无菌清除，清除部分为外层0.5mm ±。
5 根据权利要求2),脐带，胎盘干细胞培养是在DMEM培养液中进行。用10%自体血清，AB血清或无血清培养。收集的细胞包括第一代，和培养之后的二，三代。
6 根据权利要求3)，安全的细胞储存包括一个密闭的个体储存系统和这一系统的-190度的汽相保存及信 息统一系统。这一个体储存系统包括密闭的细胞储存管，袋，信息卡，二级待査管。
7 根据权利要求1-3)这一制备，储存系统也可用于脐带间充质之外的其他细胞，包括脐带血干细胞的制 备和储存。
8 根据卜6)，这一专利包括经以上方法处理的干细胞的无菌方法，库，和制备。及其干细胞库和储存方 法可以避免由于液相浸泡所导致的细菌，霉菌等病原体，其他人的细胞，DNA, RNA等的交互污染。 也可避免因所用管盖泄漏引起的对其他储存者干细胞的污染，使储存的干细胞的安全性和将来的临床 应用得以保证。同时大量节省储存空间。进而降低成本。及所致的干细胞的安全临床应用。
全文摘要
本方法公开一种用于临床治疗用的干细胞的制备，储存和应用。本发明的构建包括1)胎盘脐带去污染处理a)用医用碘酒和酒精或其它消毒剂对脐带，胎盘表面的处理。b)手工或仪器去除脐带胎盘外表面。c)胎盘脐带组织的无菌和无干细胞的损失。2)间充质干细胞的制备和培养(无菌)a)无菌手动或自动方法处理组织。b)无菌研磨组织至最小颗粒。c)酶处理2b项中制备的组织。d)清洗离心分离和收集细胞。e)培养细胞。3)脐带间充质干细胞的安全储存a)无菌方式收集细胞在储存管或袋中。b)储存管加密封盖。c)用高质量塑料膜双层覆盖并用抽空法封闭各管。d)储存在蒸汽式液氮储存罐的液相中，或制备安全注射液等。
文档编号G06F7/00GK101298606SQ20081005228
公开日2008年11月5日 申请日期2008年2月14日 优先权日2008年2月14日
发明者王福生 申请人:天津环宇商桥商务信息咨询有限公司