专利名称：一种采用光反射差法探测生物样品的方法
技术领域：
本发明涉及一种探测生物样品的光学方法，特别涉及一种用光反射差 法从基底反面探测生物样品的新方法。
背景技术：
生物大分子之间如何相互作用及调控是当前生命科学面临的最基本 问题之一，也是解释生命本质与奥妙的重要组成部分，生物大分子相互作 用的检测是研究生物分子相互作用的关键。随着生命科学进入基因组、后
性、网络式、动态性等特点。因此发展无标记、高通量、并行检测的手段 和方法是应时之需，已成为生命科学取得突破进展的关键之一。
荧光标记法和表面等离子态共振法是目前具有代表性的两种高灵敏 度的对生物样品检测方法。焚光标记法具有高灵敏度和高通量的特点，但 需要荧光标记，存在可能改变蛋白质的性质、产生光致漂白和检测时间长 费用大等不足。表面等离子共振法虽然具有无标记和高灵敏度的特点，但 由于其灵敏度来源于等离子表面的尖锐共振，不仅对生物芯片有很高的要 求、手续繁瑣、检测成本比较昂贵，而且在高通量检测方面具有一定的困
难。正如英国剑桥大学M.Cooper博士在"Drug Discovery &Development，， 网上对生命科学传感器的评论中指出"目前还没有真正无标记高通量的 生物传感器"。
光反射差法是近年来发展起来的一种非接触、无损伤的高灵敏度对生 物样品探测新方法，不仅可同时获得实部和虚部两路信号，具有很高的灵 敏度，而且具有很高的空间分辨率和时间分辨率。本申请人首次发展了氧 化物薄膜原子尺度外延生长的光反射差法原位实时探测方法，已获发明和 实用新型专利各两项(专利号:ZL97219032.1; ZL97 1 21997.4; ZL031 53938.6; Z103276452.9 )。在此基础上，我们和合作者还分别对蛋白质、 核酸等生物样品进行了光反射差法无标记的检测，实验结果表明，光反射 差法是无标记和高通量检测生物大分子的相互作用(如蛋白与蛋白，蛋白
3与核酸，核酸与核酸等)的一种好方法。到目前为止，所有的光反射差法 检测生物样品，入射光都是/人生物样品的表面入射，然后对生物样品表面
的反射光进4亍^r测，例长口参考文献1: Applications of Oblique-Incidence Reflectivity Difference Method in Primary Study of Protein Biomolecules.
H.Y. Zhang， et al, Chinese Physics Letters 23:1032 (2006); 参考文献 2: Oblique-Incidence Reflectivity Difference and Fluorescence Imaging of
Oligonucleotide and IgG Protein Microarrays. James P. Landry, et al， Mat. Res. Soc. Symp. Proc. Vol. 773 (2003);参考文献3: Label-free de tection of microarrays of biomolecules by oblique-incidence reflectivity d ifference microscopy. J. P. Landry, et al, Optics Letters ,Vol. 29， 581(20 04); 参考文献4: Comparison of two optical techniques for label-free d etection of biomolecular microarrays on solids. X.D.Zhu, Optics Commu nications， 259， 751 753 (2006))所介绍。但在研究中发现，用光反射差 法从生物样品的表面进行;险测，往往由于生物样品的结晶或样品表面的不 平整，引起入射光的散射，致使光信号减弱，甚至使光信号畸变和不能反 映生物样品的真实特性。这样不仅对生物样品的制备提出了较高的要求， 而且使光反射差法在检测生物样品方面受到 一 定的局限。
发明内容
本发明的目的在于，克服上述光反射差法从生物样品表面进行检测 时，由于生物样品的结晶或表面不平整而引起入射光的散射，致使光信号 减弱，甚至使光信号畸变不能反映生物样品真实特性的缺陷与不足，从而 提供一种采用光反射差法让探测光从基底反面入射来探测生物样品的方 法。该方法具有高灵敏度、适用于检测蛋白质与蛋白质、蛋白与核酸、核 酸与核酸等生物大分子相互作用的不同的生物样品和不同的生物芯片。
本发明的目的是这样实现的
本发明提供的采用光反射差法探测生物样品的方法，其特征在于，包 括以下步骤
1) 选择基底选择承载生物样品的基底是双面光学抛光的透明材料 或半透明材料；
2) 生物样品的制备按照常规的光反射差法探测用生物样品的制备 工艺，4巴生物样品制备在双面抛光的透明或半透明基底的一个表面；
43) 生物样品的设置采用光反射差法的装置和检测方法，将步骤l) 制备好的有生物样品的基底放在光反射差法的装置样品台上，并且基底上 有生物样品的面朝下，把基底没制备生物样品的抛光面朝上作为探测光的 入射面，从生物样品和基底界面的反射光探测生物样品；
4) 探测将光反射差法的装置启动，按照常规的光反射差法进行探 观'J,用硅光电二极管做探测器，用计算机系统对^r测结果进行数据釆集和 处理，按照要求，用光反射差法对生物样品进行原位实时监测或对生物样 品进行扫描探测。
在上述的技术方案中，所述的基底包括石英、玻离或塑料等材料。
本发明的采用光反射差法探测生物样品的方法，由于基底采用透明或 半透明的材料，而且基底双面进行光学抛光，因此入射光从基底的两个表 面都会发生反射，当入射光扫描到有生物样品处时，入射光会从生物样品 和基底表面的界面处反射，由于基底表面是光学抛光，不会产生散射，因 而其反射率比较高，界面处的生物样品对入射光产生影响，反射光就带有 生物样品的信息，而且纟果测光从基底反面探测生物样品，不^又对生物样品 的制备没有特殊的要求，而且就可得到高灵敏度和真实的生物样品信息。
本发明的优点在于 一方面基底表面是光学抛光，生物样品和基底的 界面非常光滑，不像一般生物样品的表面比较粗-隨，因而反射光几乎没有 散射，可以得到生物样品比较真实的信息。另一方面，由于光反射差法具 有入射光斜入射的特点，也就是说，光入射的角度很大，因而基底上下表 面反射的光束分离的比较大，光探测器仅选择探测基底下表面的反射光， 就可以得到很高的探测灵敏度。
本发明提供的用光反射差法从基底反面探测生物样品的方法，克服了 一般光反射差法从样品上表面探测所具有的缺点和不足，不仅提高了探测 的灵敏度，降低了对生物样品制备的要求。而且适用于探测蛋白质与蛋白 质、蛋白与核酸、核酸与核酸等生物大分子相互作用的不同的生物样品和 不同的生物芯片，生物芯片可以是一个生物样品点，也可以是多个生物样 品点的线列和面阵生物芯片，还可以原位实时监测生物大分子的相互反 应，因而具有非常广泛的应用。
下面结合附图及实施例对本发明进行详细的^兑明图1釆用光反射差法探测生物样品方法的示意图。
图2用光反射差法从基底反面探测生物样品的示意图。
图3用光反射差法从基底正面和反面分别:探测生物样品的扫描成像
图面说明如下: 附图标记
I- 激光器； 5 -透镜； 9-样品台；
II- 基片；
2-调制器; 6-探测器;
13 -基底表面和生物样品界面反射光束；
15 -从基底反面探测生物样品的扫描成像16 -从基底正面纟笨测生物样品的扫描成像图。
3-普克盒；4-分析器； 7-锁相放大器；8-计算机系统； IO—入射光束； 12-基底表面反射光束；
14 -生物样品；
具体实施例方式
实施例1:
参考图1,使用；选用长IO厘米、宽3厘米、厚0.2厘米、双面为光 学表面的高质量光学玻片做基底11,。
1) 选择基底选用长10厘米、宽3厘米、厚0.2厘米、双面为抛光 的光学表面的高质量光学玻片做基底11;
2) 生物样品的制备选取蛋白质做生物样品14，按照常规的光反射 差法探测用生物样品的制备工艺，把生物样品14制备在光学玻片的基底1 1的一个表面上；
3) 生物样品的设置采用光反射差法的装置和检测方法，将步骤l) 制备好的有生物样品的基底放在光反射差法的装置样品台上，并且基底上 有生物样品的面朝下，把基底没制备生物样品的抛光面朝上作为探测光的 入射面，从生物样品和基底界面的反射光探测生物样品；
4) 探测使用专利号为ZL03153938.6所提供的光反射差法装置，如 图1所示；其中激光器1使用输出波长6328A、 5mW、 s偏振光的He-Ne 激光器；普克盒3选用New port公司的普克盒产品；分析器4选用偏振 器；透镜5是一块焦距为IO厘米的玻璃透镜，探测器6选用硅光电二极 管做光；放大器7选用锁相放大器；样品台9选用二维扫描样品台。将光反射差法的装置启动，即打开激光器和电源，将制备了生物样品的基底放 在仪器的样品台上，并且把基底制备了生物样品的面朝下，把基底没制备 生物样品的抛光面朝上作为探测光的入射面，探测基底表面和生物样品界 面反射光束13，用光反射差法的成像方法，对同一个样品点，从生物样品
表面和基底反面分别探测生物样品；按照常规的光反射差法进行探测，用 硅光电二极管做探测器，用计算机系统8对检测结果进行数据采集和处理， 按照要求，用光反射差法对生物样品进行原位实时监测或对生物样品进行 扫描探测。
图3用光反射差法从基底正面和反面分别:探测生物样品的扫描成像
图，其中15是用光反射差法从基底反面探测的扫描成像图，16是用光反 射差法从基底正面探测生物样品的扫描成像图，图3中的15和16对比可 以看出，从基底反面探测，其扫描成像的最大值幅度几乎是从样品表面扫 描成像的10倍，具有非常高的灵敏度。 实施例2:
参考图2,用光反射差法实验装置，探测步骤同实施例1,所不同的 是选用长10厘米、宽3厘米、厚0.2厘米、双面为光学表面的高质量光学 玻片做基底11,选取不同浓度的蛋白质做生物样品14,用硅光电二极管 做光探测器6，探测基底表面和生物样品界面反射光束13。用光反射差法 进行二维扫描，从基底反面进行探测。
实施例3:
用光反射差法实验装置，探测步骤同实施例1,所不同的是选用长2 厘米、宽1厘米、厚0.1厘米、双面为光学抛光表面的石英片做基底11, 选取不同的核酸做生物样品14,用硅光电二极管做光探测器6,探测基底 表面和生物样品界面反射光束13。用光反射差法进行二维扫描，从基底反
面进行:探测。
实施例4:
用光反射差法实验装置，探测步骤同实施例1,所不同的是选用长5 厘米、宽2厘米、厚0.3厘米、双面为光学抛光表面的透明塑料做基底11, 选取抗原和抗体相互反应的生物样品做生物样品14,用硅光电二极管做光 探测器6，探测基底表面和生物样品界面反射光束13。用光反射差法进行 二维面扫描，从基底反面进4亍探测。
实施例5:
7按实施例l探测，选用抗原和抗体俘获的生物样品做生物样品14，用 光反射差法原位实时探测抗原和抗体的俘获过程。
权利要求
1. 一种采用光反射差法探测生物样品的方法，其特征在于，包括以下步骤1)选择基底选择承载生物样品的基底是双面光学抛光的透明材料或半透明材料；2)生物样品的制备按照常规的光反射差法探测用生物样品的制备工艺，把生物样品制备在双面抛光的透明或半透明基底的一个表面；3)生物样品的设置采用光反射差法的装置和检测方法，将步骤1)制备好的有生物样品的基底放在光反射差法的装置样品台上，并且基底上有生物样品的面朝下，把基底没制备生物样品的抛光面朝上作为探测光的入射面，从生物样品和基底界面的反射光探测生物样品；4)探测将光反射差法的装置启动，按照常规的光反射差法进行探测，用硅光电二极管做探测器，用计算机系统对检测结果进行数据采集和处理，按照要求，用光反射差法对生物样品进行原位实时监测或对生物样品进行扫描探测。
2. 按权利要求1所述的采用光反射差法探测生物样品的方法，其特征 在于所述的基底是双面光学抛光的透明材料或者是半透明材料。
3. 按权利要求2所述的采用光反射差法探测生物样品的方法，其特征 在于所述的透明材料或者是半透明材料为玻璃、石英或塑料。
全文摘要
本发明提供一种采用光反射差法探测生物样品的方法，其承载生物样品的基底是双面光学抛光的透明材料，测量时把入射光从生物样品的反面入射来探测样品，克服了一般光反射差法从生物样品表面探测所产生的光散射等缺点和不足，在提高探测灵敏度的同时，也降低了对生物样品制备的要求。本发明不仅适用于检测蛋白质与蛋白质、蛋白与核酸、核酸与核酸等生物大分子相互作用的不同的生物样品和不同的生物芯片，而且还可以原位实时监测生物大分子的相互反应，因而具有非常广泛的应用。
文档编号C12Q1/00GK101532945SQ200810101700
公开日2009年9月16日 申请日期2008年3月11日 优先权日2008年3月11日
发明者吕惠宾, 周岳亮, 杨国桢, 娟 温, 金奎娟, 珩 陆 申请人:中国科学院物理研究所