鉴定生物样品中定量细胞组成的方法
【专利说明】鉴定生物样品中定量细胞组成的方法
[0001]本发明提供了鉴定生物样品中细胞组成的定量、综合性图像的表观遗传血象，又 被称为表观遗传血细胞计数，其中有利的是，使用了归一化标准物。所述归一化标准物为核 酸分子，其包含对待检测的每种血细胞和/或免疫细胞特异的至少一种标志物区域W及为 细胞非特异的至少一种对照区域，其中所述区域W相同拷贝数存在于所述分子和/或已知 组成的天然血细胞样品中。此外，本发明涉及进行生物样品的综合性定量细胞组成的表观 遗传评估的试剂盒W及试剂盒的用途。所述生物样品来源于，例如哺郭动物体液，包括外周 血样品、毛细管血样品或静脉血样品或其亚组分，如外周血单个核细胞或外周血单核细胞， 或组织样品、器官样品，或来源于冷冻的、干燥的、包埋的、保存的或新鲜的体液或组织样 品。
[000引发明背景
[0003]"血细胞计数"、"全血细胞计数"或"血细胞概况"通常指确定血细胞和/或其 细胞亚群（例如，嗜中性粒细胞、嗜酸粒细胞、嗜碱粒细胞、畑19或畑3细胞及其亚群，如 畑3句)4+和/或CD37畑矿细胞）的数目、比率和形态的一组测试。该样的血细胞计数在临 床诊断中被用作病症的广泛筛选测试或个体一般健康状况的确定。通常，"血细胞计数"包 括涉及血细胞比容、血红蛋白的定量、总血细胞和红血细胞指标（例如，平均红细胞体积、 平均红细胞血红蛋白、平均红细胞血红蛋白浓度、红血细胞分布）的测定。
[0004] 白血细胞（也称为白细胞）为细胞免疫系统（我们将所有免疫细胞，包括B-细胞 明确定义为细胞免疫系统）的一部分，且不仅在防御哺郭动物免于外来生物体（特别是例 如；病毒、细菌、寄生虫等）引起的病理效应，而且在防御哺郭动物免于来自患病的自体细 胞（如肿瘤细胞）崎变中起重要作用。另外，免疫细胞自身经受疾病，作为原发性（先天性） 免疫疾病如IPEX综合征，或作为继发性（获得性）免疫疾病如，例如AIDS,HIV。在前者中， 免疫系统自身受损，然而，在后者中，外界因素（如病毒感染、福射、化学疗法或环境因素） 导致削弱免疫系统。存在若干类型的白细胞，它们来源于髓系-例如嗜中性粒细胞、嗜酸性 粒细胞和嗜碱性粒细胞、肥大细胞和巨隧细胞-或者来源于淋己系，包括所有淋己细胞亚 群-如，例如T-细胞、B-细胞、M细胞。因为已经对免疫系统的成分及其细胞膜进行了许 多分析，所W该正常免疫细胞计数（或比率）的失常易于被认可，被用于诊断中且可用于临 床决策。因此，在临床背景中定期分析该些细胞的比率和计数-作为常规诊断工具或分析 工具W及在临床研究或试验中-W便检测可由疾病或者疾病治疗或者其它内部或外部因 素引起的任何异常或明显变化。例如，血细胞计数被用于诊断白细胞减少症或淋己细胞减 少症或者白细胞增多症或淋己细胞增多症（如粒细胞增多症）的发作/出现。此外，进行 血细胞计数W监测所有疾病的治疗成功，所述疾病由总体或特异性白细胞计数或淋己细胞 计数的变化导致、引起，或者所述疾病的治疗导致总体或特异性白细胞计数或淋己细胞计 数的变化。例如，针对诊断或监测感染、贫血、白血病或化学疗法的效果，使用所谓的全血细 胞"分类"计数W便分析和鉴别免疫细胞及其亚群。在一些原发性免疫病症和继发性免疫 病症中，该程序可为唯一可用的诊断工具。白细胞分类计数包括针对总白细胞、嗜中性粒细 胞、淋己细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的定量的测定。
[0005] 通常地，对于可溶性细胞，即主要为血液还有可溶性组织或体液，该样的特异性免 疫细胞概况通过流式细胞术或通过免疫组织化学（IHC，针对固体组织）来测量。两种技术 都基于暴露于细胞膜上的蛋白质表位起作用，所述蛋白质表位对细胞亚群的每种亚型为特 异的。最近，研究集中于白细胞亚群的生物学作用，该导致允许鉴别该种群体的临床应用及 研究应用的强烈需求。
[0006] 技术上，在常规诊断学中，通过基于光检测和电阻抗的自动细胞计数仪来确定血 细胞比容、血红蛋白W及总白细胞计数。经由血液涂片的手动显微计数或自动计数来确定 白细胞分类计数，包括嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞和肥大细胞。
[0007] 允许检测T细胞群的其它方法为MHC多度量分析、细胞因子捕获分析、个别T细胞 检测巧LISP0T-测定法）或仅定性检测和定位免疫细胞（免疫组织化学分析）。如流式细 胞术，该些测定基于蛋白质的检测；未使用独立于特异性表达水平的标志物。值得注意的 是，所有该些测定W及基于mRNA检测的所有测定在细胞之间是不同的。该是因为即使对某 种蛋白质无疑为阳性的细胞仍存在W时间方式变化量的蛋白质。因此，根据给定抗体的亲 和为和非特异性结合性质W及祀蛋白的表面表达的平均量，必须确定各种和每种蛋白质标 记物的"阳性"阔值。
[000引即使个体中几乎所有细胞含有完全相同的DNA密码互补/组成，高等生物体必须 在不同类型的组织中利用且维持不同的基因表达模式。大多数基因调控为瞬时的，该取决 于当前的细胞状态W及外界刺激的变化。另一方面，持续性调控为表观遗传学的主要作 用-不会改变DNA的基本遗传密码的可遗传调控模式。DNA甲基化为表观遗传调控的典型形 式；其充当细胞的稳定记忆且在维持不同细胞类型的长期身份中起重要作用。最近，发现了 表观遗传调控的其它形式。除了"第五碱基巧-甲基胞喀晚（mC)之外，可找到第六（5-媛甲 基胞喀晚，hmC)、第屯（5-甲酯基胞喀晚，fC)和第八（5-簇基胞喀晚，cC)(MichaelJ.Booth 等.QuantitativeSequencingof5-Methylcytosineand5-Hydroxymethylcytosine atSingle-BaseResolutionScience, 2012 年日月 18 日，第 336 卷，6083 期，934-937 页）。所提及的DNA修饰的主要祀标为两个核巧酸序列胞喀晚-鸟嘿岭（"CpG位点"）；在 该上下文中，胞喀晚（C)可经历简单的化学修饰W变成甲酯化的、甲基化的、媛甲基化的或 簇化的。在人基因组中，除了在被称为"CpG岛"的某些相对密集簇之外，CG序列比预期更 罕见。CpG岛通常与基因启动子相关，估计多于一半的人基因具有CpG岛（Antequeraand Bird,化oc化tlAcadSciUSA90:11995-9,1993)。
[0009] 对于最近描述的一种胞喀晚修饰，5-媛甲基化，显示了对CpG岛处的化mC作图 且定量的氧化亚硫酸氨盐测序的效用（MichaelJ.Booth等.Quantit;ativeSequencing of5-Methylcytosineand5-HydroxymethylcytosineatSingle-BaseResolution Science, 2012 年日月 18 日，第 336 卷，6083 期，934-937 页）。
[0010] 在本发明的上下文中，术语"亚硫酸氨盐可转化的染色质"应意指允许亚硫酸氨盐 化学修饰胞喀晚的染色质结构（例如，充分打开的结构）。因此，术语"DNA亚硫酸氨盐可转 化性"涉及使用亚硫酸氨盐处理，在所述染色质中和/或为所述染色质的一部分的各个核酸 中的胞喀晚碱基可W (或已经）被转化的程度。术语还涉及使用亚硫酸氨盐处理，在参考 核酸（如质粒）中的胞喀晚碱基可W (或已经）被转化的程度。反过来，术语"亚硫酸氨盐 不可转化的染色质"或"亚硫酸氨盐不可转化的核酸"涉及使用亚硫酸氨盐处理，胞喀晚碱 基不可w(或不能）被转化的程度。
[0011] 如上文所提及的，最近发现了王种新的胞喀晚修饰。因此，预期将来的科学发现将 对过去所述的亚硫酸氨盐可转化性的表观遗传模式产生更精确的解释。胞喀晚修饰的该些 过去结果涵盖亚硫酸氨盐可转化的（未甲基化的，未修饰的）胞喀晚W及不可转化的（甲 基化的，修饰的）胞喀晚。如所述，两个术语需要被重新解释。根据新的科学发现（i)亚硫 酸氨盐不可转化的胞喀晚涵盖5-甲基胞喀晚（mC)和5-媛甲基胞喀晚化mC)，W及（ii)亚 硫酸氨盐可转化的胞喀晚涵盖5-甲酯基胞喀晚（fC)、5-簇基胞喀晚（cC) W及未修饰的胞 喀晚。
[0012] 另外，早期发明基于（i)亚硫酸氨盐可转化的胞喀晚与染色质总量的比率（不依 赖于细胞类型的，100%亚硫酸氨盐可转化的DNA基因座），或者（ii)亚硫酸氨盐可转化的 胞喀晚（fC，cC，未修饰的胞喀晚）与亚硫酸氨盐不可转化的胞喀晚化mC和mC)的比率。该 些比率被用于表征细胞类型、细胞分化、细胞阶段W及病理性细胞阶段。因此，新技术将产 生新的、更多的特定比率，可W补充当前的细胞特异性、细胞期特异性W及表观遗传修饰的 病理模式，因此，定义了潜在的新型生物标志物。待发现为生物标志物的新比率可定义为：
[0013] 生物标志物比率=a/b
[0014]a=E(C和 / 或mC和 / 或hmC和 / 或fC和 / 或cC)
[001引b=E(C和/或mC和/或hmC和/或fC和/或cC)，
[0016] 由此，通过一至四种修饰，a和b彼此不同。新的DNA修饰的发现必定会扩展该列 举。
[0017] 出于本申请的目的，DNA序列中的表观遗传修饰通过W下术语指明；（i)亚硫酸氨 盐可转化的胞喀晚巧-甲酯基胞喀晚（fC)和/或5-簇基胞喀晚（cC))，W及（ii)亚硫酸 氨盐不可转化的胞喀晚（（包括5-甲基胞喀晚（mC)，5-媛甲基胞喀晚化mC))。因为两种甲 基化，mC和hmC是亚硫酸氨盐不可转化的，所W区分该两者是不可能的。同样，fC、cCW及 未修饰的胞喀晚为亚硫酸氨盐可转化的，也不可能彼此区分。
[001引此外，除DNA修饰之外，组蛋白也经历改变其与DNA和核酸蛋白质相互作用的翻译 后修饰。修饰包括甲基化、乙酷化、憐酸化、泛素化、sumoylation、瓜氨酸化和ADP-核糖基 化。也可修饰组蛋白肥A、H2B和H3的核屯、。组蛋白修饰在不同的生物学过程中起作用，如 基因调控、DNA修复、染色体浓缩（有丝分裂）和精子发生（减数分裂）。另外，对于该些修 饰，修饰的特定模式对不同的细胞类型、细胞阶段、分化状态是特异的，可分析亚硫酸氨盐 可转化性的该种模式或相似方法，W便鉴定某些细胞和细胞阶段。本发明也涵盖该些修饰 的应用。
[0019] 预期未来将发现DNA修饰的其它变体。每种修饰类型应为亚硫酸氨盐-可转化的 或亚硫酸氨盐-不可转化的。也可将该些新的修饰用作生物标志物读出。另外，预期将建 立亚硫酸氨盐修饰的新方法，从而产生可转化的DNA和不可转化的DNA的不同组。
[0020] 报道临床上或分析上有用的细胞免疫状态的适应症种类非常多。对于几乎每种疾 病，细胞免疫状态直接相关或者由于可W引起继发性免疫病症和崎变的药物影响而变得相 关（如在癌症中）。疾病背景中总体免疫状态的该种广泛意义产生对测量该些参数（即，白 细胞亚型和亚群）的方法的明显需求。
[0021]解决该需求的当前方式为通过流式细胞术和免疫组织化学方法，其为已经确立的 且已经开发为供医院使用的高通量系统，为参考实验室中的标准程序，w及对于更多简单 应用，为医师可用的。然而，某些问题和要求限制了流式细胞术和免疫组织化学的可应用 性。
[0022] a)对于流式细胞术，细胞需要为完整的。该意味着血样必须新鲜"状态测量， 测量的任何延迟可W导致结果偏差。一般说来，应在8小时内测量样品，因为在该时间范围 W后，粒细胞（血液中的一种主要细胞成分）开始裂解。作为新鲜处理的替代选择，可W是 冷藏保存的血样，但存在与性能和可重复性相关的重要问题。因此，在临床常规中避免流式 细胞术且省略许多可能有意义的分析，然而在临床试验中，免疫标志物为治疗预测的主要 生物标志物备选物，经常被忽略，或者如果调控需要的话，则需要配置额外的设备。
[0023] b)抗原表达不是数字化过程（开-关），而是模拟过程（低、中、高）。因此，必须 确定限定阳性信号对比阴性信号的阔值。对于某些标志物，该是没有问题的，而对于其它标 志物，阔值非常难且不精确。
[0024] C)对于流式细胞术，其也造成问题；许多细胞类型不能通过表面（分化簇-畑） 分子简单鉴定，但是一些细胞类型的特征在于胞内或胞外可溶性蛋白质，例如转录因子或 细胞因子。当前针对T扣、化l、Th2细胞和Tr巧S的标志物属于该种类别的细胞类型-完 全归一化程序的应用甚至更困难。该是因为细胞类型特异性标志物需要被捕获W便与细胞 相关联。
[0025] d)此外，流式细胞术依赖于所分析底物（细胞悬液）的溶解性。关于该一点，可W 通过酶消化溶解组织细胞，但该经常导致其表面分子的丢失-使得作为流式细胞术分析 的主要祀标的畑标志物无用。
[0026] e)通常，表面标志物、胞内标志物或胞外标志物均不是100%细胞类型特异的。 已经报道了某些基因产物的"泄露"表达（Wiezcorek等，CancerRes. 2009年1月15日； 69 (2) : 599-608)，使得定量稍有不精确。
[0027] f)因为免疫组织化学基于与流式细胞术相同的原理，所W特异性问题重叠。然而， 该技术的主要问题是其仅被视为半定量的。特别地，具体问题是由于存在各种不同的细胞 层而使总细胞计数不可行，难于正确区分和计数。
[0028] 就方面e)而言，发明人先前已经发表了出版物，证明了流式细胞术检测表达 的表面表位，但其不能区分细胞类型特异性表位表达与不依赖于细胞类型的表位表达 的诱导W及其不能检测当前不表达或较少表达某些表面标志物的特异性细胞。例如， CD4+CD25+CD45RA+T细胞的体外刺激产生高表达水平的F0XP3,然而F0XP3基因仍为甲基 化的，因此无活性巧aron等，E：pigenetics. 2006年1月-3月；1 (1) :55-60)。另外，对 于体外分化的化17细胞，尽管存在高水平的比-17A转录物，但未观测到比-17A启动子 的脱甲基化（JansonP.C.J.等.ProfilingofCD4+Tcellswithepigeneticimmune lineageanalysis.TheJournalofImmunology. 2010, 92-102)。另一方面，公开了甲基 化与标志物表达有关（Hamerman,Page,Pullen.Distinctmethylationstatesofthe CDSJ3geneinperipheralTcellsandIntraepithelialLymphocytes.TheJournal ofImmunology1997,P124〇-1246;JansonP.C.J等.ProfilingofCD4 巧cellswith epigeneticimmunelineageanalysis.TheJournalofImmunology. 2010. 92-102 ; Melvin等.HypomethylationinIFN-GammaGencorrelateswithexpressionof IFN-G,includ