CCG
[0260] 反向引物；ql730_m2R2_Ml:AGGTAATTGTTAGTAATTTTTACG
[0261] 水解探针；ql730m2Pl:肥X-CTCACTCTCCCCGTCCCTCTATC-B明 1
[0262] 基于测试-模板测试化G-特异性PCR-体系的技术特异性（参见图4)。发现化G 和如G特异性PCR体系分别对亚硫酸氨盐转化的模板和亚硫酸氨盐未转化的模板为高度特 异的。另外，化G-特异性和CpG-特异性PCR体系分别未显示与CpG和化G模板的交叉反 应性（图4显示化G-特异性PCR体系）。为了进一步增加qPCR引物体系的特异性，Mg2+ 浓度从（通常应用的）3. 2mM增加至3. 5mM(参见图4)。
[0263] 使用某些所分选的细胞部分W及使用全血样来测试嗜中性粒细胞-特异性 qPCR-体系的生物学特异性（参见表9)。发现所建立的qPCR测定对嗜中性粒细胞为高度 特异的。
[0264]
[026引由亚硫酸氨盐转化的嗜中性粒细胞-特异性标志物的拷贝数与样品中亚硫酸氨 盐转化的和亚硫酸氨盐未转化的嗜中性粒细胞-特异性标志物的拷贝数总和如下计算样 品中嗜中性粒细胞的相对量：
[0266] 嗜中性粒细胞％ =
[0267] 亚硫酸氨盐转化的嗜中性粒细胞拷贝数/亚硫酸氨盐未转化的嗜中性粒细胞拷 贝数X100;
[026引 嗜中性粒细胞％ =巧3. 67八巧3. 67+152. 67)X100 = 62. 43
[0269] 本测定在该样的意义中为特别的；使用"常见的"合适引物和标准物PCR-方案扩 增亚硫酸氨盐-转化的嗜中性粒细胞-祀-DNA未提供充分的结果。仅在PCR中使用本文 所确定的策略性位点处设计具有突变（"错配"）的扩增引物，连同使用较高Mg2+-浓度之 后，允许嗜中性粒细胞-祀区域的有效扩增。
[0270] 在下一步中，可设计基因组质粒标准物，W及可评估细胞特异性测定-校正因子 (参见实施例6)。 脚。隻施例8-伸用W硫酸氧盐-未转化的核酸分子（甚肉组质粒梳准物）作为扫一 化梳准物来评估细胞特择巧测定-巧市肉子PI定量细胞的绝对敬/微升
[0272] 发明人开发亚硫酸氨盐未转化的基因组质粒标准物作为归一化标准物。该些基因 组质粒标准物中的一种包括对T-淋己细胞特异的标志物区域W及为细胞类型非特异的标 志物区域（GAPDH，管家基因，检测所有细胞，100%的细胞）。每种单个质粒含有相同拷贝数 的该两种标志物区域（等摩尔）；该些质粒中的两种对应于DNA拷贝数/单个免疫细胞，因 此被视为单个细胞。将含有限定数目的所述基因组质粒分子的储备液用于确定T-淋己细 胞-特异性测定-校正因子W及评估未知血样中T-淋己细胞的绝对数/微升。
[0273] 在第一步中，分离未知组成的四个人血样的DNA。将该分离的DNAW及基因组质 粒标准物的基因组质粒经亚硫酸氨盐处理。随后，通过qPCR评估亚硫酸氨盐转化的T-淋 己细胞-特异性标志物区域和GAPDH-特异性标志物区域的拷贝量（表10，B、C部分）。使 用亚硫酸氨盐-转化的归一化标准物进行该些qPCR分析（表10,A部分），表明亚硫酸氨 盐-转化的DNA的相对数W及含有T-淋己细胞-特异性标志物区域和GAPDH标志物区域 的基因组质粒拷贝的相对数（表10,B、C部分）。
[0274] 未知血样中T-淋己细胞的相对量百分比被计算为亚硫酸氨盐转化的T-淋己细 胞-特异性标志物的拷贝数相对于亚硫酸氨盐转化的GAPDH拷贝数（表10,B部分）。
[0275] T-淋色細胞％= 亚碗酸氯盐-转化的T-淋色細胞-特异性标志物的拷贝数X100 亚硫酸敦盐-转化的GAPDH的拷贝数
[0276](例如RD260314) ;1896, 7/6570,Ox100 = 28. 87%
[0277] 在下一步骤中，基于所述基因组质粒标准物来评估T-淋己细胞-特异性测定-校 正因子（表邸，C部分）。如上所述，所述基因组质粒标准物为亚硫酸氨盐转化的，并且使 用对T-淋己细胞和GAPDH的亚硫酸氨盐-转化的标志物区域特异的引物通过qPCR来评估 质粒的拷贝数。还使用亚硫酸氨盐-转化的归一化标准物进行该些qPCR分析（表10,A部 分）。T-淋己细胞和GAPDH的qPCR效率应相等，因为新基因组的亚硫酸氨盐未转化的质粒 标准物含有等摩尔量的T-淋己细胞-特异性标志物区域和GAPDH-特异性标志物区域。因 此，所评估的基因组T-淋己细胞拷贝数与GAPDH拷贝数的偏差对应于qPCR测定效率的差 异。
[027引例如，平均T-淋己细胞拷贝数=6058对比平均GAPDH拷贝数=5483
[0279] 该偏差定义了细胞类型测定-特异性校正因子：
[0280] 平均T-淋己细胞拷贝数/平均GAPDH拷贝数=6058/5483 = 1. 1。
[0281] 对于T-淋己细胞，对测定校正因子1.1(平均值，n=2)进行评估（表10, C部 分）。在未知血样RD260314中，将T-淋己细胞的相对量通过因子1. 1校正，产生26. 24% 的T-淋己细胞的绝对量（表10, D部分）。
[0282]T-淋己细胞的绝对量=T-淋己细胞的相对量/特异性测定-校正因子
[0283]例如；28,87% /I. 1 = 26,24%的打'巧细胞
[0284] 另外，评估未知血样内T-淋己细胞的绝对数/微升（表10,E部分）。如上所述， 所述基因组质粒标准物（储备液为6250个拷贝/微升）为亚硫酸氨盐转化的，并且使用对 T-淋己细胞的亚硫酸氨盐-转化的标志物区域特异的引物通过qPCR来评估质粒的拷贝数 (C部分）。使用亚硫酸氨盐-转化的归一化标准物进行该些qPCR(A部分）。
[028引由储备液的已知、初始基因组质粒数（6250个拷贝）和未知血样内T-淋己细 胞-特异性标志物的qPCR所评估的拷贝数（参见B部分）相对于qPCR所评估的基因组质 粒标准物拷贝数（参见C部分）计算未知血样内T-淋己细胞的量/微升。
[0286]T-淋己细胞/ii1 =质粒拷贝数/U1X亚硫酸氨盐-转化的T-淋己细胞-特异 性标志物拷
[0287]
[028引（例如RD260314):化巧Ox1896, 7) / 化058, 3x2) = 978 个T-淋己细胞 /ii1
[0289](参见下表10)
[0290]
[0291] 表10 ;使用亚硫酸氨盐-未转化的核酸分子作为质粒标准物来评估Treg-特异性 测定-校正因子。
【主权项】
1. 产生表观遗传血象的方法，其包括以下步骤：在表观遗传学上检测生物样品中的血 细胞，以及使用归一化标准物定量所检测的所述血细胞，其中所述归一化标准物为核酸分 子，其包含对待检测的每种所述血细胞特异的至少一种标志物区域，以及为细胞非特异的 至少一种对照区域，其中所述区域以相同拷贝数存在于所述分子和/或已知组成的天然血 细胞样品中。2. 如权利要求1所述的方法，其中所述归一化标准物为亚硫酸氢盐-未转化的或亚硫 酸氢盐-转化的核酸分子。3. 如权利要求2所述的方法，其中所述亚硫酸氢盐-未转化的或亚硫酸氢盐-转化的 核酸分子选自质粒、酵母人工染色体（YAC)、人类人工染色体（HAC)、P1-来源的人工染色体 (PAC)、细菌人工染色体（BAC)和PCR-产物。4. 如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述天然血细胞样品为已知细胞组成 的血样和/或已知血细胞类型和免疫细胞类型组成的血样，且优选为提前制备的。5. 如权利要求1至4中任一项所述的方法，其还包括用测定特异性校正因子来校正所 产生的所述表观遗传血象的步骤。6. 如权利要求1至5中任一项所述的方法，其还包括基于所述检测和定量来获得综合 性血象的步骤。7. 如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中检测细胞类型标志物区域，将特异性细 胞类型和/或至少一种特异性细胞亚群与白细胞血象、T-淋巴细胞血象、粒细胞血象、单核 细胞血象、B-淋巴细胞血象和/或NK-细胞血象的其它细胞区别开。8. 如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述至少一种细胞非特异性对照区域 选自在待检测的所有细胞中表达的基因，诸如，例如管家基因。9. 如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述归一化标准物为亚硫酸氢盐-未 转化的，并且含有至少一个亚硫酸氢盐-可转化的CpG位点。10. 如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述生物样品中的细胞类型的所述定 量基于使用所述亚硫酸氢盐-未转化的归一化标准物或使用所述亚硫酸氢盐-转化的归一 化标准物，将细胞类型特异性和非特异性染色质的相对量归一化。11. 如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中使用所述亚硫酸氢盐-未转化的归 一化标准物的所述归一化指示所述生物样品内细胞含量的绝对量和/或百分比。12. 如权利要求5至11中任一项所述的方法，其中使用所述归一化标准物，通过将所述 天然血细胞样品的定量组成与所述天然血细胞样品的亚硫酸氢盐-可转化的染色质的相 对量进行比较来获得每种细胞类型特异性和非特异性测定的所述测定校正因子。13. 如权利要求5至11中任一项所述的方法，其中所述生物样品内细胞的相对量的所 述校正通过使用所述测定校正因子获得，并且指示所述生物样品内细胞含量的绝对量和百 分比。14. 如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述生物样品为未知细胞组成的样 品。15. 如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述生物样品选自哺乳动物体液 诸如例如外周血样品、毛细管血样品或静脉血样品或其亚组分诸如例如外周血单核细胞， 血块，干血斑，组织样品，器官样品，干燥的、冷冻的、包埋的、保存的和新鲜的体液或组织样 品。16. 如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述表观遗传血象包括白细胞血象、 和/或T-淋巴细胞血象、和/或粒细胞血象、和/或单核细胞血象、和/或B-淋巴细胞血 象、和/或NK细胞血象。17. 如权利要求16所述的方法，其中 a) 所述白细胞血象选自T-淋巴细胞、自然杀伤细胞、B-淋巴细胞、单核细胞和/或粒 细胞及其组合， b) 所述T-淋巴细胞血象选自CD3+CD4+、CD4+记忆细胞、CD4 +效应细胞、CD4 +初始细胞、 CD3+CD8+、CD8+记忆细胞、CD8+ 效应细胞、CD8+ 初始细胞、CD3 +CD8TD4\CD3+CD8+CD4+、NKT细 胞、iTreg、Treg、Tfh、Thl、Th2、TH9、Thl7、Thl9、Th21、Th22、记忆和 / 或效应辅助性T细胞 及其组合， c) 所述粒细胞血象选自嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、全部嗜中性粒细 胞、和/或粒细胞髓源抑制性细胞及其组合， d) 所述单核细胞血象选自CD14+单核细胞、CDlf单核细胞、巨噬细胞、浆细胞样树突状 细胞、单核细胞髓源抑制性细胞、中间型单核细胞、经典型单核细胞、非经典型单核细胞、和 /或全部树突状细胞及其组合， e) 所述B-淋巴细胞血象选自初始B细胞、前B细胞、记忆B细胞、过渡型B细胞和/或 未成熟B细胞及其组合，以及 f) 所述NK细胞血象选自CD56^P/或CD56*NK细胞。18. 如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述至少一个待分析的CpG位点存 在于转录起始上游的5'区、启动子区、5'或3'非翻译区、内含子、外显子/内含子边界和/ 或转录终止下游的3'区中的标志物区域。19. 如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中SEQIDNo1至684任一个中至少 一个CpG位点的亚硫酸氢盐转化指示表4中所列出的各自细胞类型，或者其中SEQIDNo 685或686任一个中至少一个CpG位点的亚硫酸氢盐转化指示嗜中性粒细胞，或者其中SEQ IDNo687至689任一个中至少一个CpG位点的亚硫酸氢盐转化指示嗜酸性粒细胞。20. 如权利要求1至19中任一项所述的方法，其还包括在表观遗传血象的在先评估期 间，生成包括关于所估计的细胞特异性测定-校正因子的信息的知识库的步骤。21. 如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述确定亚硫酸氢盐-可转化的和 /或亚硫酸氢盐不可转化的DNA或核酸的相对量包括选自以下的方法：特异性酶消化或染 料排除技术、亚硫酸氢盐测序、下一代测序、纳米孔测序、单分子实时测序、启动子区中的表 观遗传修饰分析、使用对亚硫酸氢盐-转化的DNA特异的引物、使用对亚硫酸氢盐-转化的 DNA特异的阻断寡核苷酸、使用荧光标记的淬灭的寡核苷酸探针，使用对亚硫酸氢盐-转化 的DNA特异的单核苷酸引物延伸的引物、数字或定量PCR分析、以及特异性选择性（核酸和 /或染色质）沉淀。22. 如权利要求1至21中任一项所述的方法，其还包括基于所产生的所述表观遗传血 象来推断哺乳动物的免疫状态的步骤。23. 如权利要求1至22中任一项所述的方法，其还包括通过将所产生的所述组成和/ 或血象与取自同一哺乳动物更早期样品的组成和/或与对照样品的组成进行比较，在所鉴 定的所述生物样品中监测所述细胞组成的步骤。24. 诊断疾病或疾病易感性或评估发展疾病风险的方法，其包括权利要求1至23中任 一项所述的方法，以及基于所鉴定的所述生物样品中的细胞组成来推断所述疾病或所述疾 病易感性。25. 鉴定化学物质或生物物质对细胞组成的影响的方法，其包括对从用所述物质处理 的哺乳动物获得的血样实施权利要求1至24中任一项所述的方法，以及将所述样品中的细 胞组成与未处理样品的组成进行比较。26. 产生表观遗传血象的试剂盒，其包括用于实施权利要求1至22中任一项所述的方 法的材料，任选地具有使用说明书。27. 权利要求26所述的产生表观遗传血象的试剂盒的用途。
【专利摘要】本发明提供了鉴定生物样品中细胞组成的定量、综合性图像的表观遗传血象，又被称为表观遗传血细胞计数，其中有利的是使用了归一化标准物。所述归一化标准物为核酸分子，其包含对待检测的每种血细胞特异的至少一种标志物区域，以及为细胞非特异的至少一种对照区域，其中所述区域以相同拷贝数存在于所述分子和/或已知组成的天然血细胞样品中。此外，本发明涉及实施生物样品的综合性定量细胞组成的表观遗传评估的试剂盒以及试剂盒的用途。所述生物样品来源于，例如哺乳动物体液，包括外周血样品、毛细管血样品或静脉血样品或其亚组分，如外周血单个核细胞或外周血单核细胞，或者组织样品，器官样品，或者来源于冷冻的、干燥的、包埋的、保存的或新鲜的体液或组织样品。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105189783
【申请号】CN201480016515
【发明人】斯文·欧莱克, 乌利齐·霍夫缪勒
【申请人】艾皮恩蒂斯有限公司
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2014年4月22日
【公告号】CA2904658A1, EP2986735A2, US20160024578, WO2014170497A2, WO2014170497A3