通过与环己烷羧酸合成相关的碳链延伸生产7碳化学物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及使用一种或多种分离的酶例如P-酬硫解酶、脱氨酶、还原酶、硫醋 酶、脱簇酶、水合酶、合酶、硫醋酶、CoA-连接酶、CoA-转移酶、脱乙酷基酶，或转氨酶，或使 用表达一种或多种运些酶的重组宿主细胞，生物合成W下一种或多种物质的方法：庚二酸、 7-径基庚酸、7-氨基庚酸、庚二胺和1,7-庚二醇（下文称为"C7结构单元"）。 阳00引发明背景
[0003] 尼龙是聚酷胺，其一般通过二胺与二簇酸的缩聚合成。类似地，尼龙可通过内 酷胺的缩聚生成。一种无处不在的尼龙是尼龙6,6,其通过六亚甲基二胺（HMD)和己 二酸的反应生成。尼龙6可通过己内酷胺的开环聚合生成（Anton&Baird,Polyamides Fibers,EncyclopediaofPolymerScienceandTechnology, 2001)。
[0004] 尼龙7和尼龙7, 7代表与尼龙6和尼龙6, 6相比具有增值特征的新型聚酷胺。尼 龙7是通过7-氨基庚酸聚合生成的，而尼龙7, 7是通过庚二酸和庚二胺的缩聚生成的。不 存在生成用于尼龙7和尼龙7, 7的单体的经济上可行的石油化学路径。 阳0化]鉴于没有经济上可行的石油化学单体给料；生物技术提供了一种经由生物催化的 备选方法。生物催化是使用生物催化剂（诸如酶）来实施有机化合物的生物化学转化。
[0006] 生物衍生给料和石油化学给料两者是用于生物催化过程的可行起始材料。
[0007] 因而，针对此背景，清楚的是需要用于生成庚二酸、7-径基庚酸、7-氨基庚酸、庚 二胺和1，7-庚二醇化巧tanediol)(下文为"C7结构单元"）中一种或多种的可持续方法， 其中所述方法是基于生物催化剂的。
[0008] 然而，无野生型原核生物或真核生物天然过度生成运类C7结构单元或将其排出 至胞外环境。不过，已经报告了庚二酸的代谢。
[0009] 二簇酸庚二酸作为碳源经由P-氧化被众多细菌和真菌有效转化成中屯、代谢 物。辅酶A(CoA)活化的庚二酸到CoA活化的3-氧代庚二酸的P-氧化经由例如与芳香 族底物降解有关的途径促进进一步代谢。已经广泛表征了 3-氧代庚二酷基-CoA被几种 细菌分解代谢成乙酷基-CoA和戊二酷基-CoA(HarwoodandParales,AnnualReviewof Microbiology, 1996, 50:553 - 590)。
[0010] 最优性原理陈述微生物调节其生物化学网络W支持最大生物量生长。超出宿主 生物体中表达异源路径的需要，将碳流量引向充当碳源而非充当生物量生长成分的C7结 构单元与最优性原理矛盾。例如，与天然生产者的产量性能相比，将1-下醇途径从梭菌 (Clostridium)物种转移入其它生产菌株中经常下降一个数量级（化en等，Appl.Environ. Microbiol.，2011，77巧）：2905 - 2915)。
[0011] 在C7脂肪族主链上形成末端官能团（诸如簇基、胺或径基基团）前，7碳脂肪族主 链前体的有效合成是合成一种或多种C7结构单元中的重要考虑因素。 阳〇1引发明概述
[0013] 本申请至少部分地基于W下发现：可构建用于生产屯碳链式脂族主链前体的生 物化学途径，在所述屯碳链式脂族主链前体中可形成一个或两个官能团，例如簇基、胺或 者径基，导致W下一种或者多种物质的合成：庚二酸、7-氨基庚酸、7-径基庚酸、庚二胺和 1，7-庚二醇（下文称为"C7结构单元")。庚二酸和庚二酸盐（醋），7-径基庚酸和7-径基庚 酸盐（醋），7-氨基庚酸和7-氨基庚酸盐（醋）本文中可替换使用，指代W其任意中性或离 子化形式的化合物，包括其任意的盐形式。本领域的技术人员应当理解具体的形式将依赖 于pH。本文描述的运些途径、代谢工程和培养策略依赖于与Synt虹ophusaciditrophicus 中环己烧簇酸生物合成或2-氨基己二酸赖氨酸生物合成相关的碳链延伸的酶或同源物。
[0014] 面对最优性原理，令人惊讶地发现，可将适当的非天然途径、原料、宿主微生物、对 宿主的生物化学网络的弱化策略和培养策略组合起来，来高效地生产一种或多种C7结构 单元。
[0015] 在一些实施方案中，用于转化为C7结构单元的C7脂族主链是3-酬庚二 酷-CoA(也可W称为3-氧代庚二酷-CoA)或庚二酷-CoA，其可W使用与Synt虹ophus aciditro地i州S中环己烧簇酸合成或2-氨基己二酸赖氨酸生物合成相关的酶，从乙 酷-CoA形成。见图1和图2。
[0016] 在一些实施方案中，末端簇基可使用硫醋酶、醒脱氨酶、7-氧代庚酸脱氨酶、 CoA-转移酶、或可逆CoA-连接酶酶促形成。见图1、图2和图3。
[0017] 在一些实施方案中，末端胺基可W使用《-转氨酶或者脱乙酷基酶酶促形成。见 图4和图5。
[0018] 在一些实施方案中，末端径基可W使用醇脱氨酶酶促形成。见图6和图7。
[0019] 在一个方面，本申请的特征在于生物合成选自下组的产物的方法：庚二酸、7-氨 基庚酸、7-簇基庚酸、庚二胺和1,7-庚二醇。所述方法包括使用与环己烧簇酸生物合成或 2-氨基己二酸赖氨酸的生物合成途径相关的酶，酶促合成屯碳链式脂族主链，并在所述主 链中酶促形成一个或两个选自簇基、胺和径基的末端官能团，从而形成所述产物。所述屯碳 链式脂族主链可W是庚二酷-CoA。可W通过3-酬庚二酷-CoA，从乙酷-CoA或2-氧代戊二 酸酶促合成庚二酷-CoA。P-酬硫解酶或P-酬脂酷[acp]合酶可W将戊二酷-CoA转化 为3-酬庚二酷-CoA。可W使用戊締二酷-CoA脱簇酶或戊二酷-CoA脱氨酶，从己豆酷-CoA 生产戊二酷-CoA。可W使用3-径基己二酷-CoA脱氨酶将3-酬庚二酷转化为3-径基庚二 酷-CoA;3-径基庚二酷-CoA可W由6-氧代-环己-1-締-幾基-CoA水解酶转化为6-酬 环己-1-締-1-幾基簇酷-CoA，或者3-径基庚二酷-CoA可W由締酷-CoA水合酶转化为 2, 3-脱氨庚二酷-CoA。
[0020] 所述两个末端官能团可W是相同的（例如胺或径基），或者可W是不同的（例如末 端胺和末端簇基；或末端径基和末端簇基）。
[0021] 转氨酶或者脱乙酷基酶可W酶促形成胺基。所述《-转氨酶可W与列于SEQ IDNO. 8-13中的任一氨基酸序列具有至少70%的序列同一性。
[0022] 6-径基己酸脱氨酶、5-径基戊酸脱氨酶、4-径基下酸脱氨酶、或醇脱氨酶可W酶 促形成径基基团。
[0023] 硫醋酶、醒脱氨酶、7-氧代庚酸脱氨酶、6-氧代己酸脱氨酶、CoA-转移酶（例如戊 締二酸CoA转移酶）、或可逆CoA-连接酶（例如可逆班巧酷-CoA连接酶）可W酶促形成末 端簇基。所述硫醋酶可W与列于SEQIDNO: 1中的氨基酸序列具有至少70%的序列同一 性。
[0024] 簇酸还原酶和憐酸泛酷琉基乙胺基转移酶能够形成末端醒基，作为形成所述产物 的中间物。所述簇酸还原酶可W与列于SEQIDNO. 2-7中的任一氨基酸序列具有至少70% 的序列同一性。
[00巧]任意所述方法可W通过发酵在重组宿主中进行。所述宿主可W经受厌氧、微氧或 混合的氧/反硝化培养条件下的培养策略。所述宿主可W在营养限制的条件下培养。所述 宿主可W使用陶瓷中空纤维膜保留，W维持发酵期间的高细胞密度。
[00%] 在任意所述方法中，所述宿主对高浓度C7结构单元的耐受可W通过在选择环境 中连续培养来改善。
[0027] 进料至发酵的主要碳源可W衍生自生物或非生物原料。在一些实施方案中，所述 生物原料是W下物质，包括W下物质，或衍生自W下物质：单糖、二糖、木质纤维素、半纤维 素、纤维素、木质素、乙酷丙酸和甲酸、甘油=醋、甘油、脂肪酸、农业废物、浓缩的酒糟可溶 物或城市废物。
[0028] 在一些实施方案中，所述非生物原料是W下物质，或衍生自W下物质：天然气、合 成气、CO2/H2、甲醇、乙醇、苯甲酸、来自环己烧氧化过程的非挥发性残留物（NVR)或者碱洗 废物流，或对苯二甲酸/异献酸混合物废物流。
[0029] 另一方面，本申请的特征在于重组宿主，其包括至少一种外源性核酸，其编码（i) P-酬硫解酶或P-酬脂酷[acp]合酶，（ii) 6-氧代-环己-1-締-幾基-CoA水解酶或締 酷-CoA水合酶，和（iii)反式-2-締酷-CoA还原酶，締酷-[acp]还原酶，或2-酬环己烧 簇基-CoA水解酶，所述宿主生产庚二酷-CoA。所述宿主可W进一步包括戊締二酷-CoA脱 簇酶或戊二酷-CoA脱氨酶。
[0030] 生产庚二酷-CoA的重组宿主进一步可W包括至少一种编码W下一种或多种物 质的外源性核酸：硫醋酶、醒脱氨酶、7-氧代庚酸脱氨酶、6-氧代己酸脱氨酶、戊締二酸 CoA-转移酶，可逆班巧酷-CoA-连接酶、乙酷化醒脱氨酶、或簇酸还原酶，所述宿主生产庚 二酸或庚二酸半醒。
[0031] 生产庚二酸半醒的重组宿主进一步可W包括至少一种编码转氨酶的外源性 核酸，并生产7-氨基庚酸。
[0032] 生产庚二酸半醒的重组宿主进一步可W包括至少一种编码编码W下物质的外源 性核酸：4-径基下酸脱氨酶、5-径基戊酸脱氨酶、或6-径基己酸脱氨酶，所述宿主生产 7-簇基庚酸。
[0033] 生产庚二酸半醒、7-氨基庚酸、或7-径基庚酸的重组宿主进一步可W包括簇酸还 原酶、转氨酶、脱乙酷基酶、N-乙酷转移酶、或醇脱氨酶，所述宿主生产庚二胺。
[0034] 生产7-径基庚酸的重组宿主进一步可W包括至少一种编码簇酸还原酶或醇脱氨 酶的外源性核酸，所述宿主生产1，7-庚二醇。
[0035] 所述重组宿主可W是原核生物，例如来自埃希氏菌属（Escherichia)如大 肠杆菌巧scherichiacoli);来自梭菌属（Clostridia)如杨氏梭菌（Clostridium ljungd址lii)、自产乙醇梭菌（Clostridiumautoethanogenum)或者克鲁佛梭 菌（Clostridiumkluyveri);来自棒状杆菌属（Corynebacteria)如谷氨酸棒状杆 菌（Corynebacteriumglutami州m);来自贪铜菌属（Qipriavidus)如钩虫贪铜菌 (Qipriavidusnecator)或者耐金属贪铜菌（Qipriavidusmetallidurans);来自假单 胞菌属（Pseudomonas)如巧光假单胞菌（Pseudomonasfluorescens)、恶臭假单胞菌 (Pseudomonasputida)或者食油假单胞菌（Pseudomonasoleavorans);来自代尔夫特菌 属值elftia)如食酸代尔夫特菌值elftiaacidovorans);来自芽抱杆菌属度acillus) 如枯草芽胞杆菌度acillussubtillis);来自乳杆菌属（Lactobacillus)如德氏乳杆 菌（Xactobacillusde化rueckii);或者来自乳球菌属（Xactococ州S)如乳酸乳球菌 (Xactococ州Slactis)或来自红球菌属巧hodococcus)如马红球菌巧hodococcusequi)。
[0036] 所述重组宿主可W是真核生物，例如来自曲霉属（Aspergillus)如黑曲霉 (Aspergillusniger);来自酵母属（Saccharomyces)如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae);来自毕赤氏酵属（Pichia)如己斯德毕赤酵母（Pichiapastoris);来自 耶罗维亚酵母属（Yarrowia)如解脂耶罗维亚酵母（Yarrowialipolytica);来自伊萨 酵母属（Issatchenkia)如东方伊萨酵母（Issathenkiaorientalis);来自德己利酵母 属值ebaryomyces)如汉逊德己利酵母值ebaryomyceshansenii);来自Arxula属如 Arxulaadenoinivorans;或者来自克鲁维酵母菌属化luyveromyces)如乳酸克鲁维酵母 菌化luyveromyceslactis)的真核生物。
[0037] 本文所述的任意重组宿主进一步可W包括一种或多种W下弱化的酶：产生乙酸 的憐酸转乙酷酶，乙酸激酶；乳酸脱氨酶；甲基糞酿（menaquinol)-延胡索酸氧化还原酶； 产生乙醇的乙醇脱氨酶；丙酬酸脱簇酶；产生异下醇的2-含氧酸脱簇酶；聚合物合酶； NADPH特异性心谷氨酸脱氨酶；NADPH/NADH心谷氨酸脱氨酶；NADPH-消耗型转氨酶；庚二 酷-CoA脱氨酶；降解C7结构单元及其前体的酷基-CoA脱氨酶；戊二酷-CoA脱氨酶；或庚 二酷-CoA合成酶。
[0038] 本文所述的任意重组宿主进一步可W过表达编码W下物质的一种或多种基因：乙 酷-CoA合成酶、甲酸脱氨酶、PEP簇激酶、PEP簇化酶、丙酬酸簇化酶、PEP合酶、k丙氨酸 脱氨酶；NADH-特异性心谷氨酸脱氨酶；二胺转运体；二簇酸转运体；和/或多药物转运体。
[0039] 本文所述途径的反应可W在一种或多种细胞（例如宿主细胞）株中进行，所述细 胞株（a)天然表达一种或多种相关酶，化）经遗传工程化而表达一种或多种相关酶，或（C) 天然表达一种或多种相关酶并经遗传工程化而表达一种或多种相关酶。或者，可W从W上 任意类型的宿主细胞中提取相关酶，并W纯化或半纯化形式使用。提取的酶可选地固定在 固体基质上，例如适合的反应容器的底和/或壁。此外，运些提取物包括可W作为相关酶来 源使用的裂解物（如细胞裂解物）。在本申请提供的方法中，所有步骤可W在细胞（例如宿 主细胞）中进行，所有步骤可W使用提取的酶进行，或一些步骤可W在细胞中进行，而其它 步骤可W使用提取的酶进行。
[0040] 本文所述的多种酶催化可逆反应，并且感兴趣的反应可W是所述反应的逆反应。 图1-6所示的示意性途径阐明了对于每种中间物感兴趣的反应。
[0041] 在一些实施方案中，所述宿主微生物的内源性生物化学网络被弱化或增强，来（1) 保证乙酷-CoA的细胞内可用性（2)创造NADP的不平衡，其仅可W通过C7结构单元的形成 来平衡，（3)阻止通向和包括C7结构单元的中屯、代谢物或中屯、前体的降解，和/或（4)保 证从细胞的高效流出。
[0042] 除非另外定义，本申请使用的所有技术和科学术语的定义与本发明所属领域的普 通技术人员所通常理解的含义相同。虽然与本申请所述的方法和材料相似或者等同的方法 和材料也可用于实践本发明，但在下文描述适合的方法和材料。本文提及的所有公开、专利 申请、专利和其它参考文献通过提述完整并入本文。在冲突的情况下，W本说明书包括定义 为准。另外，材料、方法和实施例仅为示例性的而不意图限制。
[0043] 本发明的一个或多个实施方案的细节列于下面的附图和描述中。根据说明书和附 图，并根据权利要求，本发明的其它特征、目的和优点将显而易见。根据专利法的标准实践， 词语"包含"在权利要求中可被"基本上由…组成"或者"由…组成"替代。
[0044] 附图简述 W45] 图1是从乙酷-CoA或2-氧代戊二酸作为中屯、代谢物通向庚二酷-CoA的示例性 生物化学途径的示意图。
[0046] 图2是使用庚二酷-CoA作为中屯、前体通向庚二酸的示例性生物化学途径的示意 图。
[0047] 图3是使用庚二酷-CoA或庚二酸作为中屯、前体通向7-氨基庚酸的示例性生物化 学途径的示意图。
[0048] 图4是使用7-氨基庚酸、7-径基庚酸或庚二酸半醒作为中屯、前体通向庚二胺的示 例性生物化学途径的示意图。
[0049] 图5是使用庚二酷-CoA或庚二酸作为中屯、前体通向7-径基庚酸的示例性生物化 学途径的示意图。
[0050] 图6是使用7-径基庚酸作为中屯、前体通向1，7-庚二醇的示例性生物化学途径的 示意图。
[0051] 图7含有由tesB编码的大肠杆菌硫醋酶（参见GenBank登录号AAA24665. 1， 沈QIDNO: 1)、海分枝杆菌（Mycobacteriummarinum)簇酸还原酶（参见GenBank登录号 ACC40567. 1，沈QIDN0:2)、耻垢分枝杆菌（Mycobacteriumsmegmatis)簇酸还原酶（参 见GenBank登录号ABK71854. 1，SEQIDN0:3)、Se即iliparusrugosus簇酸还原酶（参见 GenBank登录号EFV11917.1，SEQIDN0:4)、耻垢分枝杆菌簇酸还原酶（参见GenBank登录 号ABK75684.1，沈QIDN0:5)、马赛分枝杆菌（Mycobacteriummassiliense)簇酸还原酶 (参见GenBank登录号EIV11143.1，SEQIDN0:6)、Se即iliparusrotundus簇酸还原酶（参 见GenBank登录号ADG98140. 1，SEQIDN0:7)、紫色色杆菌（Qiromobacteriumviolaceum) w-转氨酶（参见GenBank登录号AAQ59697.1，SEQIDN0:8)、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa) ?-转氨酶（参见GenBank登录号AAG08191. 1，沈QIDN0:9)、下香假单胞菌 (Pseudomonassyringae)"-转氨酶（参见GenBank登录号AAY39893.1，沈QIDN0:10)、球 形红杆菌巧hodobactersphaeroides) ?-转氨酶（参见GenBank登录号ABA81135. 1，沈Q 10^:11)、大肠杆菌《-转氨酶（参见66址3证登录号44457874.1，沈9 10^:12)、河流 弧菌（VibrioFluvialis) ?-转氨酶（参见GenBank登录号AEA39183. 1，沈QIDN0:13)、 枯草芽抱杆菌度acillussubtilis)憐酸泛酷琉基乙胺基转移酶（参见GenBank登录号 〔八八44858.1，沈910側：14)、或诺卡尔菌物种（齡〇曰'山3 3口.）服化5646憐酸泛酷琉基乙 胺基转移酶（参见GenBank登录号ABI83656. 1，SEQIDN0:15)的氨基酸序列。
[0052] 图8是释放的CoA在412皿处相对吸光度的柱状图，其作为相对于空载体对照，硫 醋酶将庚二酷-CoA转化为庚二酸的活性的测量。
[0053] 图9是总结20分钟后在340nm处吸光度的改变的柱状图，其为相对于只有酶的对 照（没有底物），NADPH的消耗和簇酸还原酶的活性的测量。
[0054] 图10是20分钟后在340nm处吸光度的改变的柱状图，其为相对于空载体对照， NADPH的消耗和簇酸还原酶将庚二酸转化为庚二酸半醒的活性的测量。 阳化5] 图11是20分钟后在340nm处吸光度的改变的柱状图，其为相对于空载体对照， NADPH的消耗和簇酸还原酶将7-径基庚酸转化为7-径基庚醒的活性的测量。
[0056] 图12是20分钟后在340nm处吸光度的改变的柱状图，其为相对于空载体对照，NADPH的消耗和簇酸还原酶将N7-乙酷-7-氨基庚酸转化为N7-乙酷-氨基庚醒的活性的 测量。 阳057] 图13是20分钟后在340皿处吸光度的改变的柱状图，其为相对于空载体对照， NADPH的消耗和簇酸还原酶将庚二