从腐霉属物种生产ω-3脂肪酸的制作方法
【专利说明】从腐霉属物种生产w-3脂肪酸
[0001] 巧关幸国申请的香叉引用
[0002] 本发明要求在2013年3月7日提交的题为"PR孤UCTI0NOF0MEGA-3FATTYACIDS FROMPYTHIUMSPECIES"的在申请的美国实用新型专利申请No. 13/788, 372的优先权，其全 部内容通过引用并入本文。
技术领域
[0003] 本发明设及由藻类腐霉属物种生产的=酷基甘油油的生产。在一个实施方案中， 所述藻类物种含有至少约20wt%的总脂质并含有至少约lOwt%其总脂肪酸的二十碳五締 酸巧PA)和少于约5wt%其总脂肪酸的花生四締酸（ARA)。在另一个实施方案中，本发明 设及由藻类腐霉属物种生产二十碳五締酸巧PA)的多种方法。特别地，崎雌腐霉（Pythium iregulare)可用作可行的生产有机体。
【背景技术】
[0004] 二十碳五締酸巧PA，C20:5,n-3)基于其医学上确立的对屯、血管和其它疾病的治 疗能力是《-3脂肪酸系的一种重要的脂肪酸。作为EPA主要来源的鱼油具有数个限制，例 如不合需要的嗅味、重金属污染、由于渔拱过度潜在的缺乏、鱼源的季节实用性变化和生产 成本。因此，鉴定和发展新的EPA源将是非常有益的。腐霉属微生物包含许多具有产生EPA 能力的菌株。特别地，已对崎雌腐霉作为EPA源进行了广泛研究，但尚未开发由该源生产高 EPAS酷基甘油油的商业方法。
[0005] 由于EPA的营养益处（抗炎性能等），从含高含量（>10%总脂肪酸化PA中真菌/ 藻类腐霉属物种中得到=酷基甘油油是有利的。为了得到运样的油，如果该油可从含高干 细胞质重量（>20%w/w)的脂质的腐霉中提取，将是有利的。
【发明内容】
[0006] 本发明设及由藻类腐霉属物种生产的=酷基甘油油的生产。在一个实施方案中， 所述藻类物种含有至少约20wt%的总脂质并含有至少约lOwt%其总脂肪酸的二十碳五締 酸巧PA)和少于约5wt%其总脂肪酸的花生四締酸（ARA)。在另一个实施方案中，本发明设 及由藻类腐霉属物种生产二十碳五締酸巧PA)的多种方法。特别地，崎雌腐霉可用作可行 的生产有机体。
[0007] 在一个实施方案中，本发明设及一种来源于腐霉生物质的=酷基甘油油，包含：大 于20%w/w细胞干重的细胞脂质，且超过10%总脂肪酸的EPA。
[0008] 在另一个实施方案中，本发明设及一种来源于腐霉生物质的=酷基甘油油，包含： 大于20%w/w干细胞重量的细胞脂质；和/或超过10%总脂肪酸的二十碳五締酸巧PA)， 其中花生四締酸（ARA)少于5%总脂肪酸。
[0009] 在另一个实施方案中，本发明设及产生至少一种=酷基甘油油的方法，所述方法 包含步骤：（i)提供合适量的腐霉培养物；（ii)使用来自所述合适量的基质的腐霉培养物 生长腐霉生物质；（iii)从所述腐霉生物质中提取=酷基甘油油，其中所述=酷基甘油油 包含大于20%w/w细胞干重的细胞脂质且所述至少一种S酷基甘油油中包含大于10 %总 脂肪酸的二十碳五締酸巧PA)。
【附图说明】
[0010] 图1是示出本发明中解决的问题的一个方面的图，即当腐霉中细胞脂质增加至大 于20%干细胞重量值CW)时，细胞脂质中的EPA下降至少于10%总脂肪酸。因此，先前不 可能从含经济可行量（>20%w/w干细胞重量）的细胞脂质的腐霉生物质得到含高（>10% 其总脂肪酸化PA水平的S酷基甘油油。 具体实施方案
[0011] 本发明设及=酷基甘油油的生产，其由藻类腐霉属物种产生。在一个实施方案中， 所述藻类物种含有至少约20wt%的总脂质并含有至少约lOwt%其总脂肪酸的二十碳五締 酸巧PA)和少于约5wt%其总脂肪酸的花生四締酸（ARA)。在另一个实施方案中，本发明设 及由藻类腐霉属物种生产二十碳五締酸巧PA)的多种方法。特别地，崎雌腐霉可用作可行 的生产有机体。
[0012] 本领域技术人员会认识到腐霉属生物体先前被归类为真菌但现在周知已从真菌 中单独进化，且更接近地与褐藻和娃藻相关。它们目前的分类是：界：囊泡藻界，n:不等鞭 毛n，纲：卵困纲，目：腐霉目，科：腐霉科，属：腐霉属。腐霉属代表细丝状的、单细胞生物 体的一个群体，其生理上类似真菌，且由于它们先前的分类经常被当作真菌对待或指称。在 此，运些有机体可指藻类或真菌，或根据最新的分类指卵菌。可用在本发明的实践中的腐霉 属物种的实例包括，但不限于，崎雌腐霉、终极腐霉（P^hiumultimum)、诡橘腐霉（P^hium insidiuosum)、德己利腐霉（P}fthiumdebaryanum)、间型腐霉（P}fthiumintermedium)、 大雄腐霉（P}fthiummegalacanthum)、侧雄腐霉（P}fthiumparoecan化um)和林栖腐霉 (Pythiumsylvaticum)。在另一个实施方案中，当在本文中使用时术语"腐霉属物种"指可 被利用和/或可被遗传地或其他方式修饰W产生EPA的任何腐霉属物种。相应地，在一个 实施方案中，本发明的腐霉属物种可为通过经典突变或分子生物学/遗传工程得到的突变 体或转化体菌株。在另一个实施方案中，用于EPA生产的腐霉属物种是通过经典突变或分 子生物学/遗传工程得到的崎雌腐霉突变体或转化体。
[0013] 可使用任何合适的工业设备，例如能够容纳约lO-lOOm3体积的发酵罐或反应容器 实施商业规模的富脂肪酸的腐霉生物质的制备。运样的容器对本领域技术人员通常是已知 的，且添加或移除介质的装置外也可包含用于例如取样介质（例如，为了测量pH)的装置， 用于检测并调节溫度的装置，用于向培养物供应气体（例如，空气、氧气等）的装置，用于揽 拌介质的装置等。
[0014] 为了开始工业规模的培养，通常得到基本上纯的腐霉属培养物（例如来自菌种库 例如美国典型培养物保藏中屯、的野生型或通过经典突变或借助分子生物学的遗传工程得 到的其他合适来源）并用于在有利于抱子形成的条件下开始腐霉的生长，例如在通常增补 有葡萄糖和酵母提取物、抑约5. 5至约6的的琼脂斜面上生长数天（例如3-7天）。为开 始系列放大液体培养，首先制备腐霉抱子的接种体，例如通过用蒸馈水、介质等洗涂琼脂表 面，并将所述抱子溶液加入到适合于生物体大规模生长的实验室规模容器中。所述腐霉接 种体每升接种的培养基包含约1〇5至约10 7抱子。然后，通过初始接种小体积（例如，1-2 升）随后被转至依次增大的体积，所述培养逐渐"加速"。
[0015] 在腐霉的培养过程中，揽拌介质并向生长的培养物供应空气或氧气（通常是 空气）。可例如，通过在实验室规模的玻瓶培养中摇动或旋转所述培养（例如，在约 150-20化pm的rpm下，通常约17化pm)或在发酵罐培养中通过揽动或揽拌例如奖、叶轮或其 它合适的机械的方式来实施揽拌。在发酵罐培养中，所述发酵罐在培养过程中被充入空气 或氧气，通常充入氧气。通常，在整个培养过程中氧气浓度保持在约10%至约80%的水平。 本领域的技术人员会认识到向培养物提供空气或氧气也可用于揽拌所述培养物，当气体是 吹入培养物或经过培养物鼓泡时。
[0016] 典型地，为了使富脂肪酸的生物质的生产最大化，W两步实施腐霉的培养。在培 养介质与所述微生物接种后，在约2(TC至3(TC的溫度下开始生长阶段，W激励生物质的累 积。通常，在该溫度范围内保持所述培养约3至约6天。其后，为了提升腐霉细胞中脂肪酸 的累积，溫度降低至约20°C或W下。在较低的溫度下持续培养约1至约3天。因此，从开始 接种至收获腐霉生物质的总时间天数通常为约5至约7天。
[0017] 其后，通过本领域技术人员已知的数个合适手段和方法中的任一个收获腐霉生物 质，例如通过离屯、和/或过滤。根据它的目标用途实施所述生物质的后续加工，例如通过脱 水和干燥。
[0018] 按照本文描述培养的腐霉产生富含多种脂肪酸的生物质并可用于多种应用。在本 发明的一些实施方案中，根据本发明的方法由腐霉产生的富脂肪酸的生物质"依其本身"使 用，即，在使用前所述脂肪酸不与生物质分离或隔离。在运样的实施方案中，可被收集并直 接使用生物质（例如，作为湿真菌块）但将经常首先通过移除一些或多数或所用的与所述 生物质相关联的水而对其处理。因此，本发明也包含多种形式的全部或部分干的（干燥的） 由腐霉产生的生物质，所述生物质由于按本文描述培养而富含脂肪酸（例如，EPA)。运样 全部干燥的腐霉生物质可用作例如食物来源或添加剂W供养多种生物体，例如鱼（尤其是 在水产养殖鱼类"养殖场"中生长的鱼），鸡和其他家禽（火鸡、雌珍珠鸡等），牛、绵羊、山 羊、马和其他通常在"农家"环境中饲养的家畜（如狗、猫和家养宠物）等。所述生物质可 W用作W任何形式受益于脂肪酸尤其是EPA的摄取的任何物种的食物或用于补充其饮食。 特别的兴趣可能是饲养产蛋鸡W增加鸡蛋中脂肪酸的质量（类型），或增加鸡蛋中所需的 脂肪酸的量。相似地，所述生物质可供应为饲养动物的食物W增加肉类中的脂肪酸的质量 (类型），或增加肉类中所需的脂肪酸的量。通常，运样的所需的脂肪酸包括多不饱和脂肪 酸（PUFA)，和特别地，0-3脂肪酸如EPA。
[0019] 在本发明的其他实施方案中，脂肪酸，特别是EPA，可从生物质中分离，即基本纯化 不同程度，然后使用，例如作为食品补充剂或添加剂。运种脂肪酸制剂可包含一种或多种来 源于本发明的腐霉生物质的脂肪酸的混合物，或作为一种选择地，所述脂肪酸可被分离W 提供一种或多种基本上纯的脂肪酸。
[0020] 根据本发明的方法制备的生物质和/或脂肪酸可用于除食品外的用途。例如，各 种皮肤制物、化妆品、肥皂、洁肤剂、洗液、防晒霜、护发产品和其他可被配制W包含所述生 物质自身或