一种千层塔内生腐霉菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种千层塔内生腐霉菌及其应用。
【背景技术】
[0002]千层塔(Huperziaserrata(Thunb.)Trev.)为石松目(Lycopodiales)石杉科(Lycopodiaceae)石杉属(Lycopodium L.)多年生草本蕨类植物。千层塔产生的次生代谢产物石杉碱甲是一种高效、低毒的可逆性乙酰胆碱酯酶抑制剂(AChEI)，被作为治疗阿尔茨海默病(AD，Alzheimer disease)的药物，同时在美国被用做益智的营养保健品。千层塔自然繁殖能力较差，野生状态下通过孢子和芽孢繁殖，而孢子萌发缓慢，从萌发到成熟需15-20年。野生千层塔对于生长环境要求较高，生长于海拔350-1700m的山地密林下或沟谷阴湿地，郁闭度、年均降雨量、空气相对湿度均较大，环境中土壤含水量为10% -30%。同时千层塔生长缓慢，生长半年的幼苗平均高度为1.42cm，成株平均年生长量在2.0-2.5cm之间。目前，石杉碱甲的提取主要依赖于野生资源，提取率仅为0.006%-0.1%，因而大量的市场需求、受限的自然资源和自身生长繁殖的限制使得野生千层塔资源锐减，因此探索如何促进千层塔的生长是迫在眉睫的事情。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于，提供一种千层塔内生腐霉菌，该腐霉菌的分类命名为腐霉(Pythium sp.)，保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期:2015年6月10日，保藏编号:CGMCC10770，并将CGMCC10770在千层塔植株栽培过程中添加，可使千层塔的移栽成活率达到82%，比传统方法提高1.6倍，为千层塔的人工移栽提供技术参考。
[0004]为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案:
[0005]一种千层塔内生腐霉囷，该腐霉囷的名称为腐霉，Pythium sp.，该腐霉囷的保减编号为 CGMCC10770。
[0006]所述的千层塔内生腐霉菌提高千层塔植株移栽成活率的应用。
[0007]具体的，该应用包括在千层塔移栽培养过程中将千层塔内生腐霉菌菌丝放置在千层塔植株的根部用于提高千层塔植株的移栽成活率。
[0008]更具体的，将质量为0.1?0.4g千层塔内生腐霉菌菌丝放置在单株千层塔植株的根部，放置次数为2?3次，相邻放置次数的间隔时间为7天。
[0009]再具体的，将千层塔植株在温度为25°C ±2°C、光照强度为2000LUX和光周期16小时的条件下进行移栽培养。
[0010]本发明的优点为:
[0011](I)本发明在千层塔植株的根部分离出一种内生腐霉菌，该内生腐霉菌的分类命名为腐霉(Pythium sp.)，保藏编号为CGMCC10770，通过在千层塔植株栽培过程中加入CGMCC10770的灭活菌丝体，可明显提高千层塔的移栽成活率，从而为千层塔的人工移栽提供技术参考；
[0012](2)通过在千层塔植株栽培过程中添加从其根部分离出的内生菌灭活菌丝，可使千层塔的移栽成活率达到82%，比传统方法提高1.6倍，为千层塔的人工移栽提供技术参考；每株千层塔植株根部周围浇灌的内生真菌悬浮液中内生真菌菌丝的剂量为0.2g ;每隔I周施加一次，最适的施加次数为3次。
【具体实施方式】
[0013]根际内生真菌侵染宿主后，与宿主稳定的长期相互作用即形成内生菌根。内生菌根能与80 %的陆生植物形成共生关系，这种共生关系有利于提尚植物抗御不良环境的能力，促进植物生长。目前大量研究表明内生菌根能促进植物吸收土壤中的无机盐等养分，诱导产生植物激素，例如细胞分裂素和赤霉酸，促进植物生长，分泌生物碱、萜类、类黄酮和类固醇等抗菌活性物质，帮助植物防御病原体，提高植物的抗病性等。
[0014]本发明从千层塔根部分离出腐霉属(Pythium)内生真菌，该腐霉菌的分类命名为腐霉(Pythium sp.)，保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期:2015年6月10日，保藏编号:CGMCC10770，通过在千层塔植株栽培过程中加入CGMCC10770的灭活菌丝体，可明显提高千层塔的移栽成活率，从而为千层塔的工移栽提供技术参考。
[0015]本发明的千层塔野生植株采自湖北省恩施市盛家坝乡。
[0016]CGMCC10770 的分离方法:
[0017]取有3个分叉及3个分叉以上的野生千层塔植株的新鲜的根，用0.1 %氯化汞溶液进行表面灭菌，取其根毛区接到MS固体培养基上培养，培养温度25°C ±2°C，光照强度为2000LUX、光周期16小时；一周后，再用5%次氯酸钠溶液进行表面灭菌；然后放置到PDA固体培养基(马铃薯200g、葡萄糖20g)上培养；培养30天后，获得内生菌菌丝体。
[0018]再通过PDA固体培养基，采用平板划线法进行纯培养获得内生菌的纯培养物即得;
[0019]CGMCC10770 的鉴定方法:
[0020]CGMCC10770通过分子生物学方法进行鉴别，rDNA的ITS片段的扩增产物与GENBANK中的腐霉属(Pythium)序列比对，近缘性彡99%，所以将CGMCC10770命名为腐霉(Pythium sp.)。该菌的ITS序列如下(从5’ 一3’端):
[0021]AGGATCATTACCACACCTAAAAACTTTCCACGTGAACTGTCATTATTTGTTGTGCGCTCTCTGCGGTGCCGGTGGCGTCTGCTGGCTTTGTTGCTGGCGGGTGCGAGCCGGATGCGGAGGCTGAACGAAGGTCGAGTTGCTTTGCTCTCTGGCTGACTTATTTTTCAAACCCAATACCAAACTTACTGATTATACTGTGAGAACGAAAGTTCTTGCTTTTAACTAGATAACAACTTTCAGCAGTGGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAACGCTGCGAACTGCGATACGTAATGCGAATTGCAGAATTCAGTGAGTCATCGAAATTTTGAACGCATATTGCACTTCCGGGTTATGCCTGGAAGTATGTCTGTATCAGTGTCCGTAAATCAACCTTGCCTTTCTTCCTTCTGTGTAGTCAGTGGAGGATGTGGCAGACGTGAAGTGTCTCGCTGTTGCTGGTTTTTGGTCATTTTGGCTATGAATACAGTTTGCGAGTCCTTTTAAATGGACACGACTTTCTCTTTTTTGTTTCTGCGAGGTGCTGTGCTCGAACGCGGTGGTTTTCGGATCGCTCGCGGCTGTTGGCGACTTCGGTGAATGCATTATGGAGTGGACCTCGATTCGCGGTATGTTGGGCTTCGGCTGGACAATGTTGCTTATTGTGTGTTTGTTCCGCGTTCGCCTTGAGGTGTACTTTCGGCTGTGTGCTTGAACTGGGATCTGCTTTGTTAGTAGTGCGCGGTCATCGTTATTCGCGGGGACATCTGTTCTTGTGCACGCATTTTGTGTGTGTGTGTTTGAGCAGAAGAGAGGTTCGAATTTGGGAAATTAGTG
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