一种球孢白僵菌dsxj-07及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种球孢白僵菌菌株DSXJ-07,及其该菌 株用于防治农作物害虫的应用。
【背景技术】
[0002] 稻水象甲（LissorhoptrusoryzophilusKuschel)属鞘翅目，象虫科，沼泽象亚 科，稻水象属。主要危害水稻并以玉米、甘蔗、小麦、大麦、牧草、禾本科杂草等为寄主，具有 危害时间长，繁殖传播速度快，抗药性和抗逆性强等特点。成虫啃食稻叶，幼虫蛀食稻根，一 般造成水稻减产15%~20%，严重的减产50%以上，甚至绝收，是水稻上重要检疫性害虫， 被国际自然保护联盟列为全球100种最具威胁性的外来入侵生物之一。1986年我国将其列 为对外检疫对象。此虫原产地为美国。上世纪70年代初，孤雌生殖型稻水象甲传入亚洲。 1976年，在日本爱知县首见此虫，至1983年，此虫几乎蔓延遍及日本全境。1988年，由日本 传入韩国及朝鲜。我国于1988年在河北省唐海县首次发现稻水象甲。此后，稻水象甲在我 国迅速蔓延，截至2011年底已在我国20个省市自治区发现了稻水象甲危害。稻水象甲已 经成为我国水稻生产的一大潜在威胁，我国将其列为近年来重点加强防治的5个外来入侵 生物之一。
[0003] 玉米已成为我国的第一大粮食作物（2012年起），作为主要的粮食作物、饲料作物 和加工工业的重要原料，在发展国民经济中具有重要地位。玉米螟是玉米的主要害虫，一 般发生年份引起玉米减产10%，大发生年减产可达30%。玉米螟危害成为限制我国玉米产 量的主要因素之一。
[0004] 长期以来，我国主要依赖于化学农药防治以上两种害虫，由于化学杀虫剂的大量、 连年施用，使农产品、土壤和水域受到农药残留污染，对人类健康已构成严重威胁和损害； 害虫抗药性的增强，使得用药量不断增加，防治费用倍增；有益天敌生物被大量损伤，生态 环境遭到严重破坏，导致害虫的再增猖獗。为保护生态环境，保证食品和饲料的产量、品质 和安全性，应用生物防治技术大面积控制农业害虫，采取害虫可持续治理措施势在必行。
[0005] 昆虫病原真菌是最重要的杀虫微生物类群，在自然条件下约70 %的昆虫病害是 真菌引起的。其致病机制复杂，不会引起害虫产生抗性，对解决害虫的抗药性问题极具潜 力。因此，昆虫病原真菌作为重要的替代农药，近年来受到广泛关注。在我国，球孢白僵 菌和绿僵菌已被广泛应用于亚洲玉米螟（OstriniafurnacalisGuen6e)、飞幢（Locusta miratoria)和松毛虫（DendrolimuspunctatusWalker)等多种大田及林业害虫的防治，并 取得了显著的经济、社会和生态效益。截止到2007年，世界上先后有180余种真菌杀虫剂 问世。昆虫病原微生物是唯一通过穿透昆虫体壁主动侵入昆虫的微生物，是鞘翅目和刺吸 式害虫的最有效的生物防治手段。另外，昆虫病原真菌具有较强的垂直和水平扩散能力，有 助于害虫的持续控制，对于迀飞性害虫稻水象甲的控制尤为有力，利用杀虫真菌控制稻水 象甲虽已见到相关报道，但杀虫效果均不理想，其主要原因之一是缺乏对稻水象甲具有高 毒力的昆虫病原真菌菌株。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种对稻水象甲及亚洲玉米螟两种害虫均有防治效果，且 防治效果及生产性状均良好的球孢白僵菌菌株DSXJ-07,利用该菌株生产的杀虫真菌制剂， 能够大幅度提高对稻水象甲及亚洲玉米螟的防治效果。
[0007] 本发明具体通过以下技术方案实现：
[0008] 本发明提供的一种球孢白僵菌（beauveriabassiana)DSXJ_07,该菌株已进行保 藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰 西路1号院3号；保藏日期：2013年01月23日；藏编号：CGMCCNo. 7192。
[0009] 本发明所述的球孢白僵菌DSXJ-07的内转录间隔区的序列为SEQIDNo. 1。
[0010] 本发明球孢白僵菌DSXJ-07接种在PDA培养基上培养，初期菌落呈白色绒毛状至 棉絮状，产孢后变成淡黄色；菌丝透明，具有分隔和分支，直径为3. 0-3. 5ym;分生孢子梗 浓密簇生、轮生或单生，呈帚状分支，大小2. 5~5. 5X1. 5~2. 5ym，其末端产生瓶形小梗， 大小15. 5~25. 5X1. 5~3. 0ym;从瓶梗的末端以向基式连续形成长串链的分生孢子，分 生孢子为单细胞，呈球形或近球形，大小2~3X2~2. 5um。
[0011] 本发明球孢白僵菌DSXJ-07用于防治禾本科作物上害虫的应用。所述的禾本科作 物为水稻、玉米、甘蔗、小麦、大麦或牧草，所述的害虫为稻水象甲和亚洲玉米螟。
[0012] 本发明球孢白僵菌菌株DSXJ-07作为制备防治禾本科作物害虫生物农药的应用， 通过常规的液固双相发酵生产，获得白僵菌高孢粉，然后加入表面活性剂如分散剂、稳定 剂、湿润剂、粘结剂、消泡剂、崩解剂、抗冻剂等中的一种或几种，或吸附载体按一定比例混 合后，制备成可湿性粉剂、水分散粒剂、悬浮剂、悬乳剂、水乳剂或微乳剂；所述的禾本科作 物为水稻、玉米、甘蔗、小麦、大麦或牧草，所述的害虫为稻水象甲及亚洲玉米螟。
[0013] 本发明球孢白僵菌菌株DSXJ-07防治禾本科作物上害虫的方法也属于本发明 的保护范围，该方法是在植物生长过程中进行喷雾处理；所述喷雾为球孢白僵菌菌株 DSXJ-07的菌悬液或发酵液或代谢产物或制备的农药制剂。
[0014] 本发明的有意效果为：本发明从自然感染的稻水象甲僵虫直接分离筛选的球孢白 僵菌菌株DSXJ-07,产孢能力强、其生产性状好、生长迅速；同时对稻水象甲及亚洲玉米螟 杀虫活性强、对稻水象甲成虫及亚洲玉米螟3龄幼虫的LT9。值分别为（5. 10±0. 11)天和 (6. 07±0. 52)天。利用该菌株生产的杀虫真菌制剂，可有效控制稻水象甲及亚洲玉米螟的 种群数量。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施 例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示 的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明 的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
[0016] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0017] 实施例1球孢白僵菌菌株DSXJ-07的分离与鉴定
[0018] 将采集到的自然感染的稻水象甲僵虫先用75 %酒精浸没3~5s，再用0.5% NaCIO表面消毒3min，灭菌水冲洗3次，在无菌条件下，用灭菌刀具将感染虫体切成5mm见 方小块，置于9cmPDA平板上培养，放入28°C培养箱中培养3~5天，使其昆虫表面生长出 新鲜孢子；然后用接种环挑取新鲜孢子在含有50yg/ml头孢霉素和30yg/ml卡那霉素的 PDA平板上划线；将划线好的培养皿倒置于28°C培养箱中培养；3~4日后挑选出典型而 无杂菌的菌落，在菌落边缘用接种环挑取带有菌丝的一小块培养基，转入平板培养基中央， 28°C培养10~15天，待产孢后，转移至斜面培养基，获得球孢白僵菌菌株DSXJ-07,4°C保 藏。
[0019] 1)形态鉴定
[0020] 将分离到的球孢白僵菌DSXJ-07菌株接种在PDA平板上，28°C培养观察菌落形态 特征、产孢结构和孢子形状与大小。
[0021] 结果显示在PDA培养基上培养初期菌落呈白色绒毛状至棉絮状，产孢后变成淡 黄色；菌丝透明，具有分隔和分支，直径为3. 0-3.5ym;分生孢子梗浓密簇生、轮生或单 生，呈帚状分支，大小2. 5~5. 5X1. 5~2. 5ym，其末端产生瓶形小梗，大小15. 5~ 25. 5X1. 5~3. 0ym;从瓶梗的末端以向基式连续形成长串链的分生孢子，分生孢子为单 细胞，呈球形或近球形，大小2~3X2~2. 5umiim。
[0022] 2)球孢白僵菌菌株DSXJ-07的ITS序列扩增、序列测定及分子鉴定
[0023] 将球孢白僵菌DSXJ-07菌株在SDAY液体培养基震荡培养3天（200rpm，28°C)。 4°C，10000rpm离心20min，以收集菌丝。液氮研磨破碎后采用真菌基因组DNA提取 试剂盒提取球孢白僵菌DSXJ-07的基因组总DNA。以提取得到的总DNA为模板，参照 White设计引物扩增球孢白僵菌ITS1-5. 8S-ITS2rDNA区域。所用引物为ITS15' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG- 3' 和ITS45' -TCCTCCGCTTATTGATATGC- 3'，产生 550bp扩增产 物。扩增条件：94°C预变性4min，l个循环；94°C变性lmin，53°C退火0. 5min，72°C延伸45s， 35个循环；最后72°C延伸lOmin。采用凝胶回收试剂盒回收扩增产物，交由生工生物工程 (上海）股份有限公司采用双脱氧测序法测定扩增产物序列。球孢白僵菌DSXJ-07ITS1 - 5. 8S-IT