一种快速提取马铃薯晚疫病菌单个孢子囊dna的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速提取马铃薯晚疫病菌单个孢子囊 DNA的方法。
【背景技术】
[0002] 晚疫病菌是马铃薯的毁灭性病害之一，每年都造成巨大的经济损失。实验室中通 过单菌丝分离法获取晚疫病菌的成功率较低，一般在30-50%左右。主要原因是病斑中和疫 霉病菌混生的镰刀菌，丝核菌，腐霉菌等杂菌的生长速度较快，在分离纯化过程中会先晚疫 病菌长出，抑制马铃薯晚疫病菌的生长或其菌丝将晚疫病菌覆盖从而得不到纯菌株。其次 常规的单孢分离法，如平板划线法，悬浮液涂板法都需要将分散开的单个孢子囊或是孢子 从水琼脂上转接到培养基上，分离过程复杂/繁琐，不易掌握，分离效率低，操作期间又极易 增加污染的几率分离效率较低。因此这两种方法都很难在短时间内为群体遗传研究提供大 量晚疫病菌菌株的DNA。本实验方法直接用叶片病斑上获取的晚疫病菌单个孢子囊快速提 取DNA，可有效弥补以上缺陷，可快速获取大量菌株的DNA样本。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种从叶片病斑上快速提取马铃薯晚疫病菌单个孢子囊 DNA的方法。利用毛细玻璃管的毛细现象获取单孢子囊后，利用改进的CTAB法直接提取单个 孢子囊的DNA。
[0004] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 1) 单个孢子囊的分离 a. 在发病叶片病斑边缘用无菌接种针挑取直径约4 mm的马铃薯晚疫病菌菌丝团于25 mL离心管中，加入5-10 mL无菌水充分混匀后，用灭菌的脱脂棉进行过滤，收集孢子囊悬浮 液于2 ml离心管中，并立即进行下一步骤； b. 将孢子囊悬浮液浓度调至1个/2 uL，利用直径6 mm的毛细玻璃管自吸6-8 s，吸取2μ L悬浮液，在显微镜下观察，确认含有一个孢子囊后转移至0.5 mL离心管中；在4°C冰箱中放 置2 h，使游动孢子充分释放； 2) 单个孢子囊DNA的提取 a. 将CTAB于水浴锅中60°C水浴10 min; b. 取10 nL预热的CTAB液于含有单个孢子囊的0.5 mL离心管中，轻轻振荡，混匀后放 置于60°C水浴锅中，水浴15 min; c. 水浴后，加10 yL异丙醇于离心管中，轻摇混勾后冰浴15 min; d. 12，000 rpm离心10 min后，弃上清，并把离心管小心倒扣在无菌吸水纸上2 min， 尽量去除管内液体； e.70%酒精洗涤沉淀，12，000 rpm离心3 min，弃上清，通风橱中放置5 min风干沉淀， 加20 uL TE液，溶解，备用。
[0005] 本发明的优点在于： 本发明提供一种快速提取马铃薯晚疫病菌单个孢子囊DNA的方法。利用毛细玻璃管的 毛细现象获取单孢子囊后，利用改进的CTAB法直接提取单个孢子囊的DNA。单个孢子囊所含 有的蛋白及多糖等杂志较少，因此无需利用酚-氯仿-异戊醇去除，进而大大减少了 DNA在繁 琐操作过程中的丢失。可在较短时间内高效提取晚疫病菌的纯DNA。
【附图说明】
[0006] 图1单孢子囊DNA提取后，PCR验证结果。
【具体实施方式】 [0007] 实施例1 1.单个孢子囊的分离 在发病叶片病斑边缘用无菌接种针挑取直径约4 mm的马铃薯晚疫病菌菌丝团于25 mL 离心管中，加入7 mL无菌水充分混匀后，用灭菌的脱脂棉进行过滤，收集孢子囊悬浮液于2 ml离心管中，应立即进行下一步骤，避免游动孢子的释放。
[0008] 将孢子囊悬浮液浓度调至1个/2 UL，利用直径6 mm的毛细玻璃管自吸8 S，吸取2μ L悬浮液，在显微镜下观察，确认含有一个孢子囊后转移至0.5 mL离心管中。在4°C冰箱中放 置2 h，使孢子囊中游动孢子充分释放。
[0009] 2.单个孢子囊DNA的提取 改进CTAB法提取单个孢子囊的DNA，主要步骤如下： 实验前将将CTAB于水浴锅中60 °C水浴10 min。
[0010]取10汕预热的CTAB液于含有单个孢子囊的0.5 mL离心管中，轻柔振荡，混匀后 60°C水浴 15 min。
[0011] 水浴后，加10 uL异丙醇于离心管中，轻摇混匀（动作剧烈易使DNA链断裂)后冰浴 15 min〇
[0012] 12, 000 rpm离心10 min后，弃上清，并把离心管小心倒扣在无菌吸水纸上，尽量 去除离心管内残留液体。
[0013] 70%酒精洗涤沉淀，12, 000 rpm离心3 min，弃上清，风干沉淀后加20 UL TE液，溶 解，备用。
[0014] 实施例2 1)单个孢子囊的分离 a.在发病叶片病斑边缘用无菌接种针挑取直径约4 mm的马铃薯晚疫病菌菌丝团于25 mL离心管中，加入10 mL无菌水充分混匀后，使用灭菌的脱脂棉进行过滤，收集孢子囊悬浮 液于2 ml离心管中，并立即进行下一步骤，避免游动孢子的释放。
[0015] b.将孢子囊悬浮液浓度调至1个/2 uL，利用直径6 mm的毛细玻璃管自吸7 s，吸取 2uL悬浮液，在显微镜下观察，确认含有一个孢子囊后转移至0.5 mL离心管中。在4°C冰箱中 放置2 h，使孢子囊中游动孢子充分释放。
[0016] 2)单个孢子囊DNA的提取 改进CTAB法提取单个孢子囊的DNA，主要步骤如下： a.实验前将CTAB于水浴锅中60 °C水浴10 min。
[0017] b.取10 yL预热的CTAB液于含有单个孢子囊的0.5 mL离心管中，轻柔振荡，混匀 后放置于60°C水浴锅中，水浴15 min。
[0018] c水浴后，加10 UL异丙醇于离心管中，轻摇混匀（动作剧烈易使DNA链断裂)后冰浴 15 mirud. 12，000 rpm离心10 min后，弃上清，并把离心管小心倒扣在无菌吸水纸上，尽量 去除离心管内残留液体。
[0019] e.70%酒精洗涤沉淀，12, 000 rpm离心3 min，弃上清，风干沉淀后加20 uL TE液， 溶解，备用。
[0020] 实施例3 1)单个孢子囊的分离 a.在发病叶片病斑边缘用无菌接种针挑取直径约4 mm的马铃薯晚疫病菌菌丝团于25 mL三角瓶中，加入5 mL无菌水充分混匀后，使用灭菌的脱脂棉进行过滤，收集孢子囊悬浮液 于2 ml离心管中，并立即进行下一步骤，避免游动孢子的释放。
[0021] b.将孢子囊悬浮液浓度调至1个/2 uL，利用直径6 mm的毛细玻璃管自吸6 s，吸取 2uL悬浮液，在显微镜下观察，确认含有一个孢子囊后转移至0.5 mL离心管中。在4°C冰箱中 放置2 h，使孢子囊中游动孢子充分释放。
[0022] 2)单个孢子囊DNA的提取 改进CTAB法提取单个孢子囊的DNA，主要步骤如下： a.实验前将CTAB于水浴锅中60 °C水浴10 min。
[0023] b.取10 yL预热的CTAB液于含有单个孢子囊的0.5 mL离心管中，轻柔振荡，混匀 后60°C水浴 15 min。
[0024] c水浴后，加10 uL异丙醇于离心管中，轻摇混匀（动作剧烈易使DNA链断裂)后冰浴 15 mirud. 12，000 rpm离心10 min后，弃上清，并把离心管小心倒扣在无菌吸水纸上，尽量 去除离心管内残留液体。
[0025] e.70%酒精洗涤沉淀，12, 000 rpm离心3 min，弃上清，风干沉淀后加20 yL TE液， 溶解，备用。
[0026] 疫病菌群体遗传研究常用的一对SSR引物Pi89进行PCR扩增，检测单孢子囊DNA提 取效果。引物序列为F: 5' -GAGAACGCACAATGTAAGGC-3'，R: 5' -ACATAAATACACGCTGAACGG-3'。 25 yL PCR反应体系:模板DNA为7 yL, 12.5yL 2x Easy SuperMix，10 pmol/yL引物，加无 菌超纯水至25 yL。反应程序:使用Applied Biosystems PCR仪，95°C预变性2 min;94°C变 性30 s，61°C退火30 s，72°C延伸1 min，40个循环；72°C再延伸5 min，终止反应。
[0027] 检测:琼脂糖凝胶电泳，取7 yL扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳， 电泳时间35 min，电压90 V，电泳结束后采用G-B0X凝剑检测系统检测。图1电泳结果 显示扩增后片段大小和预期的一致，约为177 bp。
[0028] 表1单孢子囊DNA提取成功率 1:. ..............................................................................
....................................................?^>?????-· 表2本专利单孢子囊DNA提取技术与现有技术对比
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修 饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1. 一种快速提取马铃薯晚疫病菌单个孢子囊DNA的方法，其特征在于:具体方法如下： 1) 单个孢子囊的分离 a. 在发病叶片病斑边缘用无菌接种针挑取直径4 mm的马铃薯晚疫病菌菌丝团于25 mL 离心管中，加入5-10 mL无菌水充分混匀后，用灭菌的脱脂棉进行过滤，收集孢子囊悬浮液 于2 ml离心管中，并立即进行下一步骤； b. 将孢子囊悬浮液浓度调至1个/2 uL，利用直径6 mm的毛细玻璃管自吸6-8 s，吸取2μ L悬浮液，在显微镜下观察，确认毛细管中含有一个孢子囊后转移至0.5mL离心管中，在4°C 冰箱中放置2 h，使孢子囊中游动孢子充分释放； 2) 单个孢子囊DNA的提取 a. 将CTAB于水浴锅中60°C水浴10 min; b. 取10 nL预热的CTAB液于含有单个孢子囊的0.5 mL离心管中，轻轻振荡，混匀后放 置于60°C水浴锅中，水浴15 min; c. 水浴后，加10 yL异丙醇于离心管中，轻摇混勾后冰浴15min; d. 12000 rpm离心10 min后，弃上清，并把离心管小心倒扣在无菌吸水纸上2 min，去 除管内液体； e.70%酒精洗涤沉淀，12000 rpm离心3 min，弃上清，通风橱中放置5 min风干沉淀，加 20 uL TE液，溶解，备用。
【专利摘要】本发明提供一种快速提取马铃薯晚疫病菌单个孢子囊DNA的方法。利用毛细玻璃管的毛细现象获取单孢子囊后，利用改进的CTAB法直接提取单个孢子囊的DNA。单个孢子囊所含有的蛋白及多糖等杂质较少，因此无需利用酚-氯仿-异戊醇去除，进而大大减少了DNA在繁琐操作过程中的丢失。可在较短时间内高效提取晚疫病菌的纯DNA。
【IPC分类】C12N15/10
【公开号】CN105567675
【申请号】CN201610067939
【发明人】段国华, 杨丽娜, 詹家绥, 沈林林, 习京
【申请人】福建农林大学
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2016年2月1日