栓菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，特别涉及栓菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 栓菌属微生物，属于担子菌门的白腐真菌（white-rotfungi)。白腐真菌靠降解 木质素一纤维素材料的能力穿入木质，侵入木质细胞腔内，释放降解性酶，导致木质腐烂并 呈白色，是降解芳香化合物能力最强的微生物。白腐真菌主要利用分泌出的过氧化物酶 (LiPs、MnPs和漆酶）对木质素进行催化氧化反应，从而降解木质素分子。与其它两种木质 素降解酶LiPs和MnPs相比，漆酶是目前唯一一个实现工业化生产和应用的木质素降解酶。
[0003] 漆酶广泛存在于木腐真菌中，并在植物、真菌、细菌和昆虫等物种中也有发现。研 究指出高等真菌，尤其是担子菌门的白腐真菌，是目前最主要的漆酶生产菌种。漆酶（EC 1. 10. 3. 2)，属于蓝多铜氧化酶（bluemulticopperoxidases,MCOs)家族的一种，能够在氧 气作为电子受体的条件下氧化芳香族化合物，且底物作用特异性低。漆酶不仅可以氧化多 酚类芳香族化合物，还可以利用在小分子介体的介导下形成的漆酶/介体体系（LMS)氧化 非酚类物质或其它更为复杂的大分子。漆酶可选择性的去除木质纤维素中的木质素，有效 地对偶氮染料进行脱色，还可以去除环境中酚类药物或其它类似毒性物质。因此，漆酶在生 物质能源、纺织、造纸、废报纸脱墨、食品、生物修复和生物传感器等领域具有重要的研究和 应用价值。
[0004] 虽然漆酶已实现工业化生产和应用，但是目前研究或生产使用的漆酶产生菌株仍 具有发酵产酶时间长和发酵活力较低等缺点，致使发酵成本过高，制约着漆酶的广泛应用。 因此，为了更好地满足生产需求，获取具有发酵时间短、发酵活力高的漆酶产生菌株及其产 酶培养基依然是漆酶生产和研究领域需要解决的难题。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供栓菌及其应用，利用本发明栓菌生产的漆酶产量高，所生产 的漆酶可以被应用与生物质能源、纺织、食品、生物修复、造纸等方面。
[0006]栓菌，保藏编号为：CCTCC NO :M2015191，拉丁文名称为Trametes sp. LS-10C，保藏 单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2015年04月03日，保藏地址为中国武汉武 汉大学。
[0007] 所述栓菌是从安徽省芜湖市神山公园、赭山公园和清水苗圃园中收集的富含腐烂 植物茎叶组织的土壤中经过筛选获得；
[0008] 该菌株在PDA平板上生长速度快，其菌落呈白色，局部菌丝细密，但总体菌落较蓬 松，气生菌丝发达，基内菌丝不明显，菌丝纤细，无明显孢子生成。
[0009] 该菌种筛选方法为：
[0010] 1平板初筛
[0011] 使用无菌水对采集的27个自然样各取0.lg用无菌水稀释至lmL，打碎混勾，于室 温放置2d后使用无菌水进行梯度稀释至10 \ 10 2和10 3,分别取浓度为10 \ 10 2和10 3 的样本稀释液各〇. 4mL涂布于无菌的固体筛选培养基平板（每L培养基含有：土豆浸出汁 20mL(取200g土豆去皮加入800mL水，煮沸0. 5h，冷却后定容到lOOOmL)，葡萄糖20g，愈创 木酚0. 4mL，卡那霉素100mg，琼脂粉20g，pH6. 0)。将涂布后的平板放置于30°C恒温培养箱 中培养5d，挑取周围能够形成红褐色氧化圈的菌落进行划线分离，同时记录并比对各筛选 菌株的菌落直径与氧化圈大小。使用超低温（_80°C)甘油冻结管保藏法分别保藏所得菌 株。
[0012] 2摇瓶复筛
[0013] 将筛选获得的菌株分别划线接种PDA(每L培养基含有：土豆浸出汁20g，葡萄糖 20g，琼脂粉20g，pH6. 0)平板并于30°C恒温培养箱中培养5d后，每个平板使用5mL无菌水 进行洗涤，吸取2mL洗涤后获得的菌丝悬液接入48mL无菌种子培养基（每L培养基含有： 酵母浸出物5g，葡萄糖20g，蛋白胨20g，pH5. 5)中，接种后种子培养基装液量为250mL三 角瓶装50mL培养基。接种后置于恒温震荡培养摇床中培养，培养温度为30°C，摇床转速为 220rpm，培养2d后，吸取5mL种子培养液接种于45mL液态发酵培养基（每L培养基含有：酵 母浸出物5g，葡萄糖20g，蛋白胨20g，pH5. 5)，接种后发酵培养基装液量为250mL三角瓶装 50mL培养基。接种后置于恒温震荡培养摇床中培养，培养温度为30°C，摇床转速为220rpm， 培养12d，期间每24h从发酵液中吸取lmL液体并对其漆酶活力进行测定。
[0014] 3菌种鉴定
[0015] 经上述方法对自然样本进行反复筛选和比较，最终获得一株发酵周期较短、产漆 酶活力较高菌株，经菌落形态学观察、显微形态观察（图1)和分子生物鉴定（图2)将该菌 株鉴定为毛栓菌。
[0016] 栓菌菌株分子生物学鉴定：
[0017] (1)栓菌染色体提取
[0018] 使用CTAB抽提法，具体步骤如下：
[0019] ①把分离到的菌种接种到PDA斜面培养基培养3-4d至长出孢子，转接到液体PDA 种子液（每L培养基含有：土豆浸出汁20g，葡萄糖20g，pH6. 0)中培养36h，离心收集菌体， 用无菌水洗涤菌体至洗液澄清，真空冷冻干燥；②取冷冻干燥的菌体，放于预冷的研钵中， 快速充分研磨；③加入lmL65°C预热的CTAB和100yLSDS，充分混匀后在65°C水浴中保 温40min，每8min轻柔混匀一次；④lOOOOrpm，4°C，离心10min，收集上清液；⑤加入等体积 的酸：氯仿，轻柔混勾lmin，10000rpm，4°C离心5min，收集上清液；⑥往上清液中加入等体 积的氯仿抽提，轻柔混勾，l〇〇〇〇rpm，4°C离心5min，收集上清液；⑦往上清液中加入2. 5倍 体积的无水乙醇，室温沉淀20min后，10000rpm，4°C离心10min，收集核酸沉淀；⑧加入lmL 75%乙醇洗涤沉淀，lOOOOrpm，4°C离心5min;⑨吸去上清，将Ep管倒扣于干净的纸巾上，室 温干燥DNA沉淀15min。加入20yL双蒸水，-20°C备用。
[0020] (2)栓菌5. 8SrDNA-ITS基因PCR扩增和序列测定
[0021] 以CTAB抽提法获得的染色体DNA为模板，以5. 8SrDNA-ITS区域通用引物（ITS1 : 5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4 :5' -TCCTCCGCTTAITGATATGC-3'）为扩增引物，使用PCR 方法获得菌株5. 8SrDNA-ITS基因片段。
[0022] PCR扩增体系（50y1)如下
[0023]
[0024] 将PCR产物连接载体pUCm-T，并转化Escherichia coli DH5 a感受态细胞，抽 提重组质粒并委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成目的基因的序列测定，测定的 5. 8S rDNA-ITS基因序列为SEQUENCE LISTING。
[0025] (3)系统进化树构建
[0026] 将菌株的5. 8SrDNA-ITS基因片段测序结果通过在线数据库Blast/ blastp(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)对测定序列进行比对，选取相近序列并使 用BioEdit软件进行多重比对，比对结果通过软件MEGA5. 1利用Neighbor-Joining(NJ) 法构建系统发育树（图3)，结合形态学观察结果将该分离菌株鉴定为栓菌。
[0027] 栓菌作为生产漆酶的应用；
[0028] 一种漆酶的生产方法，步骤包括：
[0029]A、制备种子培养液，将栓菌在种子培养基中培养后进行接种；
[0030] 具体为：将栓菌菌种在PDA培养基中培养3d后用无菌水洗下孢子，使用血球计数 板计算孢子数并稀释至1x107个/mL，按1 %接种量接入种子培养基中，于30°C、200rpm条 件下培养24h后作为种子液备用，使用超低温（_80°C)甘油冻结管保藏法保藏所得菌株；
[0031] 取保藏毛栓菌菌株的超低温（_80°C)甘油冻结管置室温溶解并吸取0.lmL液体涂 布PDA平板，于30°C培养5d后用无菌水洗下菌丝，每个平板使用5mL无菌水进行洗涤，吸 取2mL洗涤后获得的菌丝悬液接入48mL无菌种子培养基中进行接种培养，接种后种子培养 基装液量为250mL三角瓶装50mL培养基，培养温度为30°C，摇床转速为220rpm，恒温培养 48h后即为摇瓶发酵产酶的种子培养液；
[0032] 所述PDA培养基配方为：每L培养基含有：土豆浸出汁20g，葡萄糖20g，琼脂粉 20g，pH6. 0 ;
[0033] 所述种子培养基配方为：每L种子培养基含有：酵母浸出物5g，葡萄糖20g，蛋白 胨20g，pH5. 5 ;
[0034]B、使用产漆酶培养基液态发酵产漆酶；
[0035] 具体为：吸取5mL种子培养液接入45mL产漆酶培养基，接种后置于震荡恒温培养 摇床中培养，培养温度为30°C，摇床转速为220rpm，总培养时间12d;接种后发酵培养基装 液量为250mL三角瓶装50mL培养基；
[0036] 所述产漆酶培养基配方为：葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉糊精之一或其混合物10~ 30g，10%麸皮浸出汁80~120g，氯化铵、酒石酸铵、硝酸铵、硝酸钾、豆柏、豆渣之一或其混 合物5~10g，酵母粉、蛋白胨之一或其混合物2. 5g，五水硫酸铜0. 1~0. 3g，氯化钠lg，磷 酸二氢钾lg，氯化钙0. 3g，pH5. 5。
[0037] 所述产漆酶培养基配方中10%麸皮浸出汁按如下方法配置：准确称取100g麸皮， 加入1000mL蒸馏水并煮沸30分钟后使用4层纱布过滤，过滤