用于培养苯并芘降解菌的培养基及其培育方法
【技术领域】
[0001]本发明属于焦化厂污染物降解技术领域，具体涉及一种苯并芘降解菌的培养基及其本降解菌的培育方法。
【背景技术】
[0002]苯并芘，分子式为C2idH12,分子量是252，极不易溶于水，这是其在环境中难于被降解的因素之一。苯并芘是一种强致癌物，具有致癌、致畸、致突变性。苯并芘存在于石油、食品、大气和煤焦油中，在土壤中也容易残留。许多国家都进行过土壤中苯并芘含量调查，残留浓度取决于污染源的性质与距离，在焦化厂附近土壤含量为200 mg/kg，在污染的土壤中，可高达650 mg/kg ο苯并花对眼睛、皮肤有刺激作用，是致癌物、致畸原及诱变剂，若不能将苯并芘降解，会影响周围居民的身体健康，甚至会造成更加严重的危害。
【发明内容】
[0003]本发明克服现有技术存在的不足，旨在提供一种苯并芘降解菌的培养基及其降解菌的培育方法，得到的降解菌降解能力强，对苯并芘的降解率可达50%左右，在苯并芘污染的微生物修复上具有很高的应用价值。
[0004]为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为:用于培养苯并芘降解菌的培养基，包括富集培养基和2216E培养基，所述富集培养基的原料的具体配比为:
(NH4) 2S04 0.3-0.5 g，NaNO3 0.3-0.5 g，CaCl2 0.01-0.02 g，KH2PO4 0.5-1.0 g，NaH2PO4 0.5-1.0 g, MgSO4 0.1-0.2 g，溶解苯并芘 5~10 mg 于丙酮后加水至 I L，pH值 7.5;
2216E培养基的原料具体配比为:蛋白胨5~8 g，酵母浸膏I ~2g，磷酸高铁0.01-0.02g，加水至1L，pH值7.6?7.8。
[0005]其中，作为优选地，所述富集培养基的原料的具体配比为:
(NH4)2SO4 0.3 g，NaNO3 0.3 g，CaCl2 0.01 g，KH2PO4 0.5 g，NaH2PO4 0.5 g，MgSO4 0.1g，溶解苯并花5 mg于丙酮后加水至I L，pH值7.5 ;
2216E培养基的原料具体配比为:蛋白胨5 g，酵母浸膏I g，磷酸高铁0.01 g，加水至1L，pH 值 7.6 ?7.8。
[0006]其中，作为优选地，所述富集培养基的原料的具体配比为:
(NH4)2SO4 0.5 g, NaNO3 0.5 g, CaCl2 0.02 g, KH2PO4 1.0 g, NaH2PO4 1.0 g,MgSO4 0.2g，溶解苯并花10 mg于丙酮后加水至I L，pH值7.5 ;
2216E培养基的原料具体配比为:蛋白胨8 g，酵母浸膏2g，磷酸高铁0.02 g，加水至11^，？!1值7.8。
[0007]其中，作为优选地，所述富集培养基的原料的具体配比为:
(NH4)2SO4 0.4 g, NaNO3 0.4 g, CaCl2 0.015g，KH2PO4 0.8 g, NaH2PO4 0.8 g, MgSO4 0.15g，溶解苯并花8 mg于丙酮后加水至I L，pH值7.5 ;
2216E培养基的原料具体配比为:蛋白胨6 g，酵母浸膏1.5g，磷酸高铁0.015 g，加水至 lL，pH 值 7.7。
[0008]用于培养苯并芘降解菌的分解方法，具体操作步骤如下:
一、取被苯并花污染的土样和水样的混合物加入到90mL无菌水中，加入适量玻璃珠，振荡3 h ；
二、经30min静置后，取5 mL上清液到45 mL的无机盐培养基中，培养基中的苯并芘浓度为lmg/L，培养温度为28 °C，以频率150 r/min摇床避光培养；
三、每隔7天移取10mL菌液至灭菌的90 mL无机盐培养基中富集培养，每转接一次苯并花的浓度提尚lmg/L ；
四、重复4次后，最后苯并芘的浓度为5mg/L，将最后一次的培养液稀释不同的梯度(从10 LlO 7)涂布于表面涂有苯并芘的选择性固体培养基平板上培养，在28°C的培养温度下培养2天；
五、分别挑取单菌落接种到2216E固体平板液体培养基中，反复划线分离经28°C培养箱倒置培养2d，得到纯培养物，观察菌落形态并测量菌落大小，记录并保存菌株；
六、菌株总DNA的提取:挑取适量菌株于含有10ulddH2O的1.5mL离心管，研磨形成菌液，将77.5uL菌液分别加入每管含有1uLbuffer、12.5uLDTT的PCR管中，65°C水浴处理20min，然后离心，置于冰上作20min处理，取上清为PCR反应的模板；
七、把总DNA稀释至100ng/>L，用稀释液为PCR扩增反应的模板，用蒸馏水为阴性对照，50μ?反应体系进行目的片段的扩增，然后对PCR扩增产物进行纯化，产物送上海桑尼生物工程公司测序；
八、测序结果在NCBI中进行序列搜索比对后，选择亲缘关系较近的几种菌株作为参比菌株，用MEGA软件构建系统发育树。
[0009]本发明与现有技术相比具有以下有益效果:本发明所得的苯降解菌菌株具有优良的降解苯并芘的能力，具有从环境介质中清除苯并芘的较好效果，在苯并芘污染的微生物修复上具有很高的应用价值。
【附图说明】
[0010]
图1为Α18的降解标准曲线。
【具体实施方式】
[0011]下面结合菌体的实施方式对本发明作进一步阐述。
[0012]实施例一
一、用于培养苯并芘降解菌的培养基，富集培养基的原料的具体配比为:
(NH4)2SO4 0.3 g，NaNO3 0.3 g，CaCl2 0.01 g，KH2PO4 0.5 g，NaH2PO4 0.5 g，MgSO4 0.1g，溶解苯并花5 mg于丙酮后加水至I L，pH值7.5 ;
2216E培养基的原料具体配比为:蛋白胨5 g，酵母浸膏I g，磷酸高铁0.01 g，加水至11^，？!1值7.6。
[0013]用于培养苯并芘降解菌的分解方法，具体操作步骤如下:
A、取被苯并芘污染的土样和水样的混合物加入到90 mL无菌水中，加入适量玻璃珠，振荡3 h ;
B、经30min静置后，取5 mL上清液到45 mL的无机盐培养基中，培养基中的苯并芘浓度为lmg/L，培养温度为28 °C，以频率150 r/min摇床避光培养；
C、每隔7天移取10mL菌液至灭菌的90 mL无机盐培养基中富集培养，每转接一次苯并花的浓度提尚lmg/L ；
D、重复4次后，最后苯并芘的浓度为5mg/L，将最后一次的培养液稀释不同的梯度(从10 LlO 7)涂布于表面涂有苯并芘的选择性固体培养基平板上培养，在28°C的培养温度下培养2天；
E、分别挑取单菌落接种到2216E固体平板液体培养基中，反复划线分离经28°C培养箱倒置培养2d，得到纯培养物，观察菌落形态并测量菌落大小，记录并保存菌株；
二、分离菌株形态特征分析
菌株总DNA的提取:挑取适量菌株于含有10ulddH2O的1.5mL离心管，研磨形成菌液，将77.5uL菌液分另Ij加入每管含有1uLbuffer, 12.5uLDTT的PCR管中，65 °C水浴处理20min，然后离心，置于冰上作20min处理，取上清为PCR反应的模板。把总DNA稀释至100ng/>L，用稀释液为PCR扩增反应的模板，用蒸馏水为阴性对照，50μ?反应体系进行目的片段的扩增，然后对PCR扩增产物进行纯化，产物送上海桑尼生物工程公司测序，测序结果在NCBI中进行序列搜索比对后，选择亲缘关系较近的几种菌株作为参比菌株，用MEGA软件构建系统发育树。
[0014]三、苯并芘含量的测定
采用萃取-紫外分光光度法测定苯并芘含量，用二氯甲烷试剂，配制梯度苯并芘标准溶液，用紫外分光光度计分别在300 nm波长处测定其梯度吸光度，作标准曲线，同时在筛选得到的每一种